肠炎沙门氏菌对雏鸭致病性差异与携带毒力基因相关性研究

摘 要：为了探究肠炎沙门氏菌的致病性差异，选择7株鸭源肠炎沙门氏菌开展动物试验，并检测了20种毒力基因（avrA、sipA、sipC、sopA、ssaB、mgtC、misL、orf319、sopB、siiE、pipC、stn、fimA、spvB、spvD、spvC、sitC、sefA、sifA、pefA）在不同菌株中的分布情况，对毒株致病性与携带毒力基因的相关性进行分析。结果表明，所有肠炎沙门氏菌对雏鸭均有致病性，但致病性存在明显差异，致死率为12%～87.5%。毒力基因检测结果显示，不同菌株携带的毒力基因存在差异，其中SE115、SE161菌株携带基因avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、spvB、spvC、sitC、sefA、sifA、pefA等19种毒力基因；SE60、SE62、SE63菌株除携带上述基因外，还携带spvD基因；SE39菌株携带avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、

mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、sitC、sefA、sifA、pefAd等17种毒力基因；SE56菌株携带avrA、misL、ssaB、spvB、spvD等5种毒力基因。上述结果说明不同菌株的鸭源肠炎沙门氏菌对雏鸭的致病性存在差异，这种差异与其携带毒力基因的数量和种类有一定相关性，此研究结果为进一步研究沙门氏菌的致病机理提供基础理论。

关键词：鸭源肠炎沙门氏菌；致病性；毒力基因；相关性

中图分类号：S858.32 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2024）09-0006-08

沙门氏菌是世界卫生组织列出的最危险的食源性病原体之一[1]。我国是世界上水禽生产第一大国，近30年来，我国鸭、鹅出栏量的年均增长率超过5%，其中鸭肉产量占总禽肉的1/3[2-3]。研究表明，养鸭场沙门氏菌分离率显著高于养鸡场和养猪场[4]。肠炎沙门氏菌成为引发沙门氏菌病的最主要血清型，已成为养禽业的主要问题之一[5]。

沙门氏菌可导致从轻度腹泻至严重全身性感染等不同程度的症状，严重影响了畜牧业和人类的公共卫生，且其致病力均与沙门氏菌携带的毒力因子相关。沙门氏菌依靠多种毒力因子在宿主体内生存、繁殖和扩散，如毒力岛（Salmonella pathogen islands，SPIs）、pSLT 毒力质粒、菌毛、鞭毛和生物被膜等[6]。徐爱霞[7]研究表明，60株沙门氏菌对受试毒力基因的检出率为 100%，且单株菌毒力基因至少携带14种，最多携带23种；致病性研究初步表明致病性与毒力基因的携带数量呈正相关。本试验对7株鸭源肠炎沙门氏菌进行了致病性试验和毒力基因检测，探究鸭源肠炎沙门氏菌致病性与毒力基因携带情况的相关性。

1 材料与方法

1.1 样品来源

本研究中的肠炎沙门氏菌是从山东省内养鸭场送检的病料中分离，由本实验室鉴定、保存，样本信息见表1。

基金项目：河北省自然科学基金生物农业联合基金培养项目（C2022402048）

第一作者：刘智慧（1999—），女，硕士，家禽传染病专业，E-mail：2679712425@qq.com

通信作者：胡峰（1985—），男，副研究员，E-mail：hufengggg@126.com

并列通信作者：刘冠慧（1986—），女，副教授，E-mail：liuguanhui.1986@163.com

收稿日期：2024-07-16

1.2 主要试剂材料

TSA固体培养基、LB肉汤培养基，海博生物科技有限公司；2 × Taq Master Mix （Dye Plus）、DL2 000 DNA Marker，康润生物科技（北京）公司；引物由北京华大基因科技有限公司合成。

1.3 菌液培养

取冻存的肠炎沙门氏菌菌种，TSA固体培养基三区划线，37 ℃培养箱培养18 h，无菌挑取单菌落至4 mL LB液体培养基中，37 ℃，180 r/min摇床中培养12 h，收集菌液，计数，备用。

1.4 致病性试验

将66只7日龄健康雏鸭随机分为8组，其中7组为试验组，每组8只；1组为对照组，10只。生理盐水调整菌液浓度至1×109 CFU/mL，经腿部肌肉注射途径感染雏鸭，0.2 mL/只，对照组按相同方式注射等体积生理盐水。试验组与对照组隔离饲养7 d，每日观察，记录雏鸭发病情况。取病死鸭的肝脏进行致病菌分离培养[8]。

1.5 PCR扩增

按参考文献[7， 9-10]设计特异性引物，引物序列、扩增片段长度及退火温度分别见表2、表3。PCR反应体系：2×Taq Master Mix（Dye Plus） 10 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板为菌液1 μL，ddH2O 5 μL，共20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；退火温度按照不同引物进行更改。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪成像分析。

2 结果与分析

2.1 致病性结果

致病性试验结果显示，攻毒第1天，SE39株和SE63株感染的雏鸭即出现死亡；攻毒第2天，SE63株和SE115株感染的雏鸭死亡数量明显增加；到第7天时，SE39、SE56、SE60、SE62、SE63、SE115、SE161各组的存活率分别为25%、87.5%、50%、37.5%、12.5%、12.5%、37.5%，见图1；对照组无死亡。攻毒后观察发现，试验组鸭均出现不同程度的跛行、运动障碍等症状。死亡雏鸭剖检可见肝脏、脾脏肿胀、出血，心脏出现心包炎及出血，心脏外膜有黄白色纤维素样物质渗出，出现坏死灶；对照组组织脏器均正常。

无菌蘸取肝脏内部组织液接种TSA培养基，培养14 h，挑取单菌落进行PCR鉴定，获得与目的片段大小一致的条带，见图2，证实雏鸭发病是由接种的肠炎沙门氏菌引起。

2.2 毒力基因检测

20种毒力基因PCR扩增结果见图3。由检测结果可知，7株分离菌均携带毒力岛基因avrA、ssaB、misL。SE115、SE161菌株携带基因avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、spvB、spvC、sitC、sefA、sifA、pefA。SE60、SE62、SE63株除携带上述19种基因外，还携带spvD基因。SE39菌株携带avrA、sipA、sipC、sopA、sopB、ssaB、mgtC、misL、siiE、pipC、stn、fimA、orf319、sitC、sefA、sifA、pefA等17种毒力基因。SE56菌株携带5种毒力基因，包括avrA、misL、ssaB、spvB、spvD。7株沙门氏菌毒力基因携带情况见表4。

3 分析与讨论

家禽是肠炎沙门氏菌的天然感染对象，1周龄以下的家禽中，肠炎沙门氏菌表现为高致病性，急性感染可致死亡[11]。大量研究报道显示，不同菌株沙门氏菌的致病性存在较大差异。张珍[12]通过小鼠致病性试验检测55株沙门氏菌分离株的致病性，结果显示所有分离株对小鼠均具有致病性，但致死的时间和剂量有所差异。王德宁[13]检测鸡源沙门氏菌分离株的致病性，结果显示菌株表现出强致病性、中等强度致病性、弱致病性，表明菌株的致病性存在差异。本研究致病性试验结果表明，7株鸭源肠炎沙门氏菌均可引起雏鸭死亡，但致死时间存在差异；致病性强弱依次为SE63、SE115、SE39、SE62、SE161、SE60、SE56，致死率为12%～87.5%，表明不同菌株、不同来源的沙门氏菌的致病性存在差异。沙门氏菌致病性差异是多种因素共同作用的结果，其中，菌株中含有的毒力基因数量、种类是主要原因，可通过检测菌株的毒力基因携带情况来分析沙门氏菌致病性差异的原因。

诸多研究均已表明，沙门氏菌的致病性与携带毒力基因的种类存在一定关联[14]。SPI-1～SPI-5是沙门氏菌具有高致病性的分子基础[15]。殷俊磊等[16]毒力试验结果表明，SPI-2毒力岛sifA基因缺失后，沙门氏菌的毒力下降，说明sifA基因与沙门氏菌的毒力相关。曹莉等[17]研究证实SPI-3毒力岛基因mgtC与沙门氏菌的致病性密切相关。戚帅等[18]研究表明SPI-5毒力岛基因sopB缺失可促进巨噬细胞坏死。谢晓蕾等[19]毒力试验结果显示，与野生株、回补株相比，sipC基因缺失菌株对BALB/c小鼠的毒力没有显著差异。本研究中，7株沙门氏菌含有两种以上的SPI-1～SPI-5关键毒力基因，且均表现出较强的致病性，据此可推测，这些沙门氏菌的致病性与SPI-1～SPI-5的毒力基因密切相关。沙门氏菌可通过质粒转移获得新的毒力基因，其水平方向的传递可使菌株毒力发生改变，从而改变沙门氏菌对宿主的致病性，毒力质粒上的毒力基因更加具有危害性[20]。王德宁[13]对含有毒力质粒基因spvC的沙门氏菌进行质粒消除，结果表明，质粒消除后，菌株的致病性有减弱趋势。但刘晓艳等[21]研究结果显示，spvB/spvC基因缺失对沙门氏菌毒力影响不明显。研究中发现，不携带spvB、spvC的SE39株的致病性高于携带这两个毒力质粒的SE60、SE62株，表明毒力质粒spvB、spvC对肠炎沙门氏菌的致病性影响不大。本研究中沙门氏菌的毒力质粒spvB检出率略低于吴植等[22]的检出率，但高于王喜等[23]和KHOO等[24]的研究结果，这表明在不同血清型和菌株来源之间，spvB基因的检出率存在差异。SE56株携带基因avrA、misL、ssaB和毒力质粒spvB、spvD，致死率较低，为12.5%，这表明基因avrA、misL、ssaB对致病性有一定影响。本研究中所检测分离株普遍携带多重毒力基因，毒力基因携带情况复杂多样，进一步表明本研究所检测的肠炎沙门氏菌具有较强的致病性。

毒力基因的携带数量对致病性也具有很大影响。本研究中，SE56株携带4种毒力基因，表现出最低的致病性；而SE63株携带20种毒力基因，致病性最高，表明毒力基因的携带数量能够直接影响沙门氏菌的致病性。SE56株的低致病性以及携带的少量毒力基因，为后续弱毒疫苗的研制奠定了基础。SE60、SE62、SE63菌株之间的致死率有差异，但均携带20种毒力基因，针对此现象，推测可能是由于毒株存在其他毒力基因、毒力基因出现变异或毒力基因之间相互协同导致致病性改变造成的。除毒力基因以外，沙门氏菌的致病性还受多种因素控制，包括宿主的免疫状态、宿主的饲养条件、混合感染等因素[25]。后续试验，可对7株沙门氏菌致病性差异的原因进行深入探究。

4 结论

本实验室分离鉴定的7株肠炎沙门氏菌的致病性存在显著差异，且致病性与携带的毒力基因种类和数量有密切关系。

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Research on the Relationship between the Pathogenicity Variations of Salmonella Enteritidis in Ducklings and the Presence of

Virulence Genes

LIU Zhihui1，2， YAN Zhaoyang1， WEI Kexin2， LI Jitong2， LV Junfeng2， GAO Yuehua2，

HU Feng2 ， LIU Guanhui1

（1.School of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan 056004， China; 2.Shandong Provincial Key Laboratory of Immunity and Diagnosis of Poultry Diseases，

Jinan 250100， China）

Abstract： In order to investigate the pathogenicity of duck-derived Salmonella enteritidis， in this study， animal experiments were carried out with seven strains of duck-derived S. enteritidis and the virulence genes （avrA， sipA， sipC， sopA， ssaB， mgtC， misL， orf319， sopB， siiE， pipC， stn， fimA， spvB， spvD， spvC， sitC， sefA， sifA， pefA） in different strains were detected， then the correlation between strain pathogenicity and virulence genes was analyzed. The results showed that S. enteritidis strains showed different pathogenicity to ducklings， with the lethality ranging from 12% to 87.5%. The results of virulence genes detection showed that different S. enteritidis strains carried various virulence genes. Among them， SE115 and SE161 strains both carried genes of avrA， sipA， sipC， sopA， sopB， ssaB， mgtC， misL， siiE， pipC， stn， fimA， orf319， spvB， spvC， sitC， sefA， sifA， pefA. Despite the genes above， SE60， SE62， and SE63 strains also carried spvD gene. SE39 strain carried 17 virulence genes including avrA， sipA， sipC， sopA， sopB， ssaB， mgtC， misL， siiE， pipC， stn， fimA， orf319， sitC， sefA， sifA， pefA. SE56 strain only carried 5 virulence genes， including avrA， misL， ssaB， spvB， spvD. The results of this study revealed that S. enteritidis strains exhibited different pathogenicity to ducklings， and this pathogenicity was correlated with the amount and type of virulence genes they carried. The results of the study would provide bases for further research on the pathogenic mechanism of S. enteritidis.

Keywords： Salmonella enteritidis; Pathogenicity; Virulence gene; Correlation