一株鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

摘 要：为确认山东省德州市某肉鸭场疑似为鸭多杀性巴氏杆菌感染的病原菌，本试验对于送检病死鸭进行剖检、细菌分离培养、菌落观察、生化试验、PCR鉴定、16S rRNA基因测序分析以及药敏试验等方法鉴定该病原菌。结果显示：分离得到的病原菌在含有5%胎牛血清的营养琼脂培养基中呈现为圆形、湿润、光滑的灰白色菌落，革兰氏染色为阴性短杆菌，瑞氏染色呈现两极浓染；分离菌株的生化特性可以发酵葡萄糖、蔗糖以及甘露醇，硫化氢、氧化酶等试验阳性；细菌特异性PCR扩增片段与预期条带大小一致；16S rRNA基因序列系统进化树显示与多杀性巴氏杆菌同源性为99%；分离菌株对于新霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟、林可霉素具有耐药性，对于氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素、粘杆菌素B、卡那霉素、大观霉素敏感。本研究结果为鸭源多杀性巴氏杆菌病的防治提供一定参考依据。

关键词：鸭；多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；16S rRNA；耐药性

中图分类号：S858.32 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2024）07-0023-08

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是一种重要的革兰氏阴性人畜共患致病菌，可引起人类和动物严重的发病率和死亡率，造成畜牧业的经济损失[1-2]。多杀性巴氏杆菌具有荚膜和芽孢，无鞭毛，不能运动，兼性厌氧菌[3-4]。多杀性巴氏杆菌引起的常见疾病包括家禽霍乱、牛出血性败血症和猪萎缩性鼻炎[5-6]。

鸭巴氏杆菌病是由巴氏杆菌引起的一种急性、败血性传染病。该病的主要特征是肝脏、心脏、肾脏等器官的实质性病变和弥漫性出血。该病在养鸭业中较为常见，对养鸭业造成了较大的威胁[7-8]。鸭巴氏杆菌病可发生于各品种的鸭，但以肉用型鸭多发。该病主要通过呼吸道和消化道传播，也可通过直接接触传播。病鸭和带菌鸭是该病的主要传染源，健康鸭通过与病鸭接触或食用被污染的饲料和水源而感染。该病一年四季均可发生，但以春季和秋季多发。根据流行病学、临床症状和病理变化可对鸭巴氏杆菌病进行初步诊断，但确诊需要进行实验室检查[9-11]。实验室诊断方法包括细菌分离培养、染色镜检、血清学诊断等。

2023年11月，山东德州某肉鸭养殖场29日龄肉鸭出现大批死亡现象，病程短，死亡率较高。鸭群主要表现精神沉郁，采食量低，行动缓慢；发病鸭常常聚集成堆，不愿活动，羽毛潮湿，有时出现腹泻，排黄绿色稀便。对病死鸭进行剖检，可见肝脏表面有大量针尖状白色坏死灶；心脏淤血，心包积液；肺脏淤血、水肿；脾脏肿大，花斑状；肠道肿胀，肠系膜出血等。根据临床症状和解剖特点，初步怀疑患病鸭可能是感染鸭多杀性巴氏杆菌引起的。为了进一步确认病原，本试验对患病鸭进行了细菌分离鉴定，并对分离菌进行了药敏试验，以期为该病的防治提供一定的参考依据。

1 "材料与方法

1.1 "病料采集

无菌采集山东省德州市某肉鸭场29～30日龄发病死亡肉鸭的肝脏、脾脏组织，送至山东和康源生物育种股份有限公司动物保健研发中心实验室进行检测。

1.2 "试验试剂及主要仪器

主要试剂：营养琼脂（NA）购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；2 × PCR mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA Marker、核酸染料购于北京康润诚业生物科技有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒、瑞氏染色试剂盒购于金克隆（北京）生物技术有限公司；小牛血清购于平睿生物科技（北京）有限公司。

主要仪器：医用洁净工作台购于济南鑫贝西生物技术有限公司；生化培养箱购于天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；N-300M显微镜购于宁波永新光学股份有限公司；164-5050型电泳仪购于Bio-Rad Laboratories，Inc；Y04S-3D型凝胶成像分析系统购于北京君意东方电泳设备有限公司；T30型三槽梯度PCR仪购于杭州朗基科学仪器有限公司。

1.3 "细菌分离培养及纯化

将采集的病死鸭肝脏、脾脏组织无菌接种于营养琼脂培养基（含5%胎牛血清），置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落生长形态。选取单个菌落进行革兰氏染色和瑞氏染色、镜检，观察分离菌的形态特征，并对疑似菌落进行纯化培养。

1.4 "细菌生化鉴定

将分离菌株的纯化培养产物分别接种于细菌生化微量鉴定管，包括葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、枸橼酸盐、尿素、硫化氢、氧化酶、过氧化氢、硝酸盐还原、鸟氨酸脱羧酶等，于37 ℃恒温培养24～48 h，依据《伯杰细菌鉴定手册》判定反应结果。

1.5 " PCR鉴定

根据GenBank数据库中Pm的kmt1基因设计引物；F：5’- ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’；R：5’- GCTGTAAACGAACTCGC CAC -3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。无菌挑取疑似菌落于100 μL的无菌PBS中，煮沸5 min后以此为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体系见表1，扩增程序参数见表2。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增目的条带长度为460 bp。

1.6 "16S rRNA基因序列测序及分析

挑取分离纯化后的菌株，依据细菌总DNA提取试剂盒要求，进行纯化菌株的总DNA提取。16S rRNA基因引物序列：F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；R：5’-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3’，预期条带大小为1 466 bp。PCR扩增反应体系见表3，扩增程序参数见表4。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR回收产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果利用NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源性分析，选取同源性较高菌株的16S rRNA基因序列，并通过MEGA 11.0.10软件构建系统进化树。

1.7 "药敏试验

采用纸片扩散（K-B）法对分离菌进行药物敏感试验，将纯化的菌株均匀涂布于营养琼脂培养基（含5%胎牛血清）上，将药敏片间隔30 mm以上进行敏感试验，根据抑菌圈大小判定菌株的药物敏感性。分离菌结果判定标准见表5。

2 "结果分析

2.1 "细菌的分离培养及形态观察

利用病死鸭肝脏、脾脏组织分别进行细菌的分离培养，该菌株纯化后在麦康凯培养基上不生长，于营养琼脂培养基（含5%胎牛血清）培养24 h后，呈现为圆形、湿润、光滑的灰白色菌落，菌落形态见图1；革兰氏染色为阴性菌，球杆状或短杆状，菌体钝圆；瑞氏染色呈现两极浓染，见图2。该分离菌株与多杀性巴氏杆菌特性一致。

2.2 "细菌生化鉴定

分离菌株的生化鉴定结果显示，该菌株可以发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不发酵乳糖、麦芽糖，无法分解尿素，硫化氢、氧化酶、过氧化氢试验均为阳性，枸橼酸盐、硝酸盐还原、鸟氨酸脱羧酶试验均为阴性，符合多杀性巴氏杆菌生化特征。分离菌生化试验结果见表6。

2.3 " kmt1基因扩增结果

以分离纯化菌株总DNA为模板，使用kmt1基因设计引物进行PCR扩增，PCR扩增产物电泳结果见图3。扩增目的片段大小约为460 bp，与预期扩增条带大小结果相符。

2.4 "16S rRNA基因序列分析结果

分离菌株16S rRNA PCR扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序后，将测序序列利用GenBank进行Blast序列对比，之后使用MEGA 11.0.10软件综合分析并构建系统进化树，见图4。进一步分析确定分离菌株与多杀性巴氏杆菌（GenBank登录号：MG597100.1）的同源性为99%，说明该分离菌株为多杀性巴氏杆菌。

2.5 "细菌药敏试验结果

根据纸片扩散（K-B）法的结果显示，分别测量抑菌圈直径，菌株药敏结果见表7。该菌株的药敏试验结果表明，该菌株对新霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟、林可霉素耐药；对氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素、粘杆菌素B、卡那霉素、大观霉素表现高敏性。

3 "讨论分析

多杀性巴氏杆菌是一种常见的动物病原菌，可引起动物严重的出血性败血症。在自然界中，多杀性巴氏杆菌可感染多种动物，包括家禽、野禽、家畜和水生动物[12-14]。特别是在养鸭业中，多杀性巴氏杆菌的感染更为常见，给养鸭业带来巨大的经济损失。有研究表明多杀性巴氏杆菌感染鸭的最初阶段，在鸭的肝组织中诱导出血和坏死病变，促进炎症小体的组装和释放，引发炎症，造成鸭肝脏损伤。依据多杀性巴氏杆菌荚膜多糖抗原成分的不同，可以分为A、B、D、E以及F共5个血清型，其中A型多杀性巴氏杆菌是引起禽霍乱的主要血清型[15-16]。目前，抗生素依旧是防治多杀性巴氏杆菌的有效治疗方法，但是由于过度和不合理地使用抗菌药物，加速了这些微生物中编码耐药性基因表达的选择性压力，从而增加了耐药分离株的出现[17-18]。另外，多重耐药菌株也时常被广泛报道，其中多杀性巴氏杆菌的耐药基因可通过可移动质粒进行整合或拼接，促进了多重耐药菌株的出现[19]。免疫接种也是防治多杀性巴氏杆菌病的一种重要手段，其中灭活疫苗与弱毒疫苗对防治多杀性巴氏杆菌病也发挥了重要作用[20]。

本研究首先从病死鸭的体内采集了病料，并通过细菌分离培养、生化试验、PCR鉴定以及16S rRNA基因序列测序等手段，成功地分离鉴定了1株鸭源多杀性巴氏杆菌，阐明了该分离菌株的菌落特性、形态特征、生化特性等生物学特点。为了更好地了解该菌株的耐药性，对该菌株进行了药敏试验。药敏试验结果显示，该菌株对多种抗生素具有耐药性，其中对新霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟、林可霉素耐药；对氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素、粘杆菌素B、卡那霉素、大观霉素表现高敏性。在多杀性巴氏杆菌的临床防治过程中，抗生素不规范、不合理的使用导致其对于多种抗生素具有较强的抗性，并且可能进一步加强对于抗生素的抗性。因此，多杀性巴氏杆菌防治需要按需合理使用抗生素，避免滥用药物，同时养殖过程中加强饲养管理，合理通风，保持适宜的温度与湿度，加强舍内环境卫生监管，减少多杀性巴氏杆菌病的传播[21]。本研究为多杀性巴氏杆菌防控与治疗提供了一定数据参考，也为相关多杀性巴氏杆菌疫苗株筛选与开发奠定一定基础。

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Isolation， Identification and Drug Resistance Analysis of a Duck-Origin Pasteurella Multocida Strain

LIU Honggang1， ZHAO Jie1， SHI Yanhong1， ZHANG Xiao1， WANG Jianhua1，XU Mingqing1，

MA Qin1， LIU Zihan1， YU Feifei1， LV Junfeng2，3， ZHU Tong2，3， LIU Liping2，3， LI Yufeng2，3

（1. Shandong Hekangyuan Biological Breeding Co.， Ltd.， Jinan， Shan dong "250001，China;

2. Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan "250100，China;

3. Poultry Breeding and Disease Prevention and Control Shandong Engineering Research Center，

Jinan "250100，China）

Abstract： "In order to investigate the suspected pathogenic bacteria causing Pasteurella multocida infection in ducks at a meat-type duck farm in Dezhou， Shandong Province， various methods were employed. These methods included necropsy， bacterial isolation and culture， colony observation， biochemical experiments， PCR identification， 16S rRNA gene sequencing analysis， and drug sensitivity testing of deceased ducks. The findings revealed that the isolated pathogenic bacteria cultivated on nutrient agar medium supplemented with 5% fetal bovine serum exhibited characteristics of round， slightly raised， moist， smooth， and translucent colonies.The Gram staining results indicated a negative presence of Brevibacterium， while the Wright staining revealed poles staining. The isolated strains exhibited the ability to ferment glucose， sucrose， and mannitol， and yielded positive results for hydrogen sulfide， oxidase， and other tests. The amplified fragment obtained through bacterial specific PCR was found to be consistent with the expected band size. The phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence demonstrated a 99% homology with Pasteurella multocida. Furthermore， the isolated strains displayed resistance to neomycin， amoxicillin， ampicillin， cefotaxime， and lincomycin， while exhibiting sensitivity to florfenicol， enrofloxacin， and doxycycline， colistin B， kanamycin， spectinomycin. The findings of this study offer valuable insights for the prevention and treatment of Pasteurella multocida in ducks.

Keywords：Duck; Pasteurella multocida; Isolation and identification; 16S rRNA; Drug resistance

基金项目：山东省农业良种工程：优质肉鸭育种技术创新与新品种培育（项目编号：2022LZGC014）

第一作者：刘洪港（1997—），男，硕士，研究方向为家禽疫病诊断与防治，E-mail：LHG2013614@163.com

并列第一作者：赵杰（1988—），女，硕士，兽医师，研究方向为家禽疫病诊断与防治，E-mail：945975664@qq.com

通信作者：李玉峰（1973—），男，博士，研究员，研究方向为家禽分子病原学与免疫学研究，E-mail：dicpd@163.com