pH对蛋黄-海藻酸钠乳液冷凝胶理化性质的影响及其机制分析

摘要：乳液冷凝胶因其独特的结构和功能特性显示出巨大的优势和广阔的应用前景。以蛋黄蛋白质（egg yolk protein，EYP）和海藻酸钠（sodium alginate，SA）为基质，通过高速剪切均质机与含葵花籽油混合（油相∶水相为3∶7），形成O/W型EYP-SA乳液冷凝胶。通过改变EYP-SA的pH，分析其热稳定性、水分分布、流变、溶解度、表面疏水性、分子间作用力及二级结构，探究pH对EYP-SA乳液冷凝胶理化性质的影响及机制。结果表明，pH值对EYP-SA乳液冷凝胶的性质有显著影响，随着pH的升高，EYP-SA对水的结合能力增强，逐渐形成了均匀致密的网络结构，展现出良好的热稳定性；在频率扫描测试中，pH的提高降低了样品的G′与G″，EYP-SA弹性和刚性减弱。溶解度和表面疏水性呈显著性相关，原因可能是pH升高，静电排斥力增强导致蛋黄颗粒解聚，溶解度增加的同时蛋白质结构展开，使原本嵌在蛋白质分子内的疏水基团暴露在蛋白质分子表面，疏水相互作用和氢键是EYP-SA乳液冷凝胶形成的主要分子力。pH为9.0时EYP-SA乳液中液滴小且分散均匀，更有利于物质包埋。这些发现为EYP-SA乳液冷凝胶在食品凝胶递送体系中的应用提供了重要的理论依据。

关键词：乳液冷凝胶；蛋黄蛋白质；海藻酸钠；pH；理化性质

中图分类号：TS201.2""""" 文献标志码：A"""" 文章编号：1000-9973（2024）10-0043-07

Effect of pH on Physicochemical Properties of Egg Yolk-Sodium Alginate

Emulsion Cold-Set Gel and Its Mechanism Analysis

ZHANG Gen-sheng1， SU Wen-wen1， XU Gui-yang1， XU Yi-meng2，

DU Yi-nan1， FEI Ying-min3*

（1.College of Food Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150028， China;

2.Type Ⅶ （Shanghai） Supply Chain Management Co.， Ltd.， Shanghai 201800， China;

3.Department of Food Engineering， Heilongjiang Vocational College for

Nationalities， Harbin 150066， China）

Abstract： Emulsion cold-set gel shows tremendous advantages and broad application prospects due to its unique structure and functional properties. With egg yolk protein （EYP） and sodium alginate （SA） as the substrates， an O/W type EYP-SA emulsion cold-set gel is formed by mixing with sunflower seed oil through high-speed shear homogenizer （oil phase∶water phase is 3∶7）. The thermal stability， moisture distribution， rheology， solubility， surface hydrophobicity， intermolecular force and secondary structure of EYP-SA are analyzed by changing the pH of EYP-SA， and the effect and mechanism of pH on the physicochemical properties of EYP-SA emulsion cold-set gel are explored. The results show that pH significantly influences the properties of EYP-SA emulsion cold-set gel. With the increase of pH， the water-binding ability of EYP-SA is enhanced， and a uniform and dense network structure is gradually formed， showing good thermal stability. In the frequency scanning test， the increase of pH reduces the G' and G\" of the sample， and the elasticity and rigidity of EYP-SA decrease. Solubility is significantly correlated with surface hydrophobicity， which may be due to the increase of pH， the increase of electrostatic repulsion force leading to the depolymerization of egg yolk particles. With the increase of solubility， the protein structure unfolds， exposing the hydrophobic groups originally embedded in the protein molecules to the surface of the protein molecules. Hydrophobic interaction and hydrogen bonding are the main molecular forces in the formation of EYP-SA emulsion cold-set gel. When pH is 9.0， the droplets in EYP-SA emulsion are small and uniformly dispersed， which is more conducive to the encapsulation of substances. These findings have provided an important theoretical basis for the application of EYP-SA emulsion cold-set gel in food gel delivery systems.

Key words： emulsion cold-set gel; egg yolk protein; sodium alginate; pH; physicochemical properties

乳液冷凝胶是由分散的油滴和凝胶基质作为连续相组成的一种凝胶材料，不仅具有凝胶网络结构，而且具有很强的力学性能[1]。乳液冷凝胶能够在不影响感官特性的同时，保留热敏化合物的功能性特点，可用于包埋对环境敏感的生物活性化合物或药物，如姜黄素和酚类化合物[2]。冷凝胶的形成要经过两个过程：一是在相对较低的浓度下，蛋白质溶液在低的离子强度和高于或低于等电点的pH值条件下被加热，以获得反应蛋白聚合体；二是通过降低溶液pH值，减少聚合体之间的静电排斥，从而诱导凝胶化。值得注意的是，pH值对蛋白乳液冷凝胶的形成有着决定性影响。一些天然的蛋白质、多糖和蛋白质-多糖复合物都是良好的乳液冷凝胶的基质。乳液冷凝胶作为一种在经济上合理、在制备上简便的运载体系，具有较高的市场价值。

蛋黄含有32%的脂肪和16%的蛋白质，蛋黄中丰富多样的蛋白质为其凝胶的形成提供了坚实的基础，蛋黄蛋白的所有成分（低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、活性蛋白和磷蛋白）在油水界面都具有很强的吸附倾向，并已应用于乳液的制备[3]。梅钰琪等[4]利用蛋黄蛋白乳液凝胶包埋姜黄素，发现包埋后姜黄素的溶解度和稳定性均大幅提高。郭绰等[5]研究低脂蛋黄酱时发现，在pH＜5.0时，带负电荷的海藻酸钠与带正电荷的蛋黄蛋白质通过静电作用聚集，使复合凝胶结构增强、黏弹性提升。

近年来，蛋白质-多糖乳液凝胶在包埋、保护以及递送活性物方面具有优异的性能。研究乳液冷凝胶的微观结构和宏观性质，以及这些性质如何受制于制备条件，尤其是pH值对其的影响，成为了食品科学领域的一个重要议题。尽管已有研究探讨了pH对蛋黄乳液性质的影响，但对于其在不同pH条件下的凝胶化行为、结构稳定性和功能性质的系统性研究仍然相对缺乏。本研究以蛋黄-海藻酸钠乳液冷凝胶为研究对象，通过热稳定性、水分分布、流变特性、溶解性、分子间作用力、蛋白质二级结构、荧光显微镜分析，探究不同pH对蛋黄-海藻酸钠乳液冷凝胶理化性质的影响并探究其机制，旨在为理解蛋黄-海藻酸钠乳液冷凝胶的凝胶化机制提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋、金龙鱼葵花籽油：购于大润发超市；海藻酸钠、无水氯化钙：天津市福晨化学试剂厂；磷酸盐缓冲溶液、8-苯胺基-1-萘磺酸铵、氯化钠：上海源叶生物科技有限公司；β-巯基乙醇：上海麦克林生化科技有限公司；盐酸、溴化钾、尿素、氢氧化钠：西陇化工股份有限公司；尼罗红、尼罗兰：阿拉丁试剂（上海）有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1104B电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；CL-200集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；FJ200-SH数显恒速高速分散均质机 上海沪析实业有限公司；PHS-25精密酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；TG16台式高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；KDY-9820凯氏定氮仪 苏州江东精密科学仪器有限公司；UV-5200紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；NMI20-040核磁共振成像分析仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司；Spectrum Two傅里叶红外光谱仪、Anton-Paar MCR 302动态流变仪 奥地利安东帕有限公司；DSC4000差示扫描量热仪 美国珀金埃尔默仪器有限公司。

1.3 蛋黄乳液凝胶的制备

将新鲜的鸡蛋脱壳后分离出蛋黄，用凯氏定氮仪测定蛋黄中的蛋白质含量。将蛋黄液溶于去离子水中，在室温下搅拌过夜，将获得含6%的EYP母液与2%海藻酸钠（sodium alginate，SA）和水按质量比为1∶3∶0.5的比例混合，搅拌15 min，4 ℃贮藏过夜。将上述混合分散体与葵花籽油混合（水相∶油相为7∶3），使用高速剪切均质机在室温下以12 000 r/min剪切乳化4 min，用1 mol/L NaOH和HCl调节pH至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，形成不同pH的O/W型EYP-SA乳液。

1.4 检测方法

1.4.1 热稳定性

参考Fei等[6]的方法，将冻干后的样品粉碎成微粒，放入50 ℃烘箱中烘制48 h，烘干后精确称量15 mg，置于铝坩埚中，密封，压实，然后进行DSC测试。实验参数：初始温度20 ℃，以5 ℃/min的升温速率升至120 ℃，空铝盒为空白，记录DSC曲线，根据得到的热谱图计算变性温度峰值（Td）和变性热焓（ΔH）。

1.4.2 低场核磁共振

参考吴珊珊等[7]的方法，将样品放入低场核磁试管中，横向弛豫时间（T2）采用CPMG序列测定。参数为采样频率200 kHz，采样点数96 004，脉冲宽度18 μs，回波个数2 000～5 000，半回波时间0.100 ms，循环采样16次。重复测定3次。

1.4.3 流变特性

参考Li等[8]的方法，将样品放入探头型号为PP-50的流变仪进行流变分析，流变仪温度为25 ℃，固定应变1%，进行0.1～100 rad/s的频率扫描。采用幂律模型拟合频率扫描曲线，分析储能模量G′的频率依赖性，见式（1）。

G′=A′×ωn′。（1）

式中：G′为样品的储能模量（Pa）；A′为每个正弦剪切变形循环所储存和恢复的能量；ω为角频率（rad/s）；n′为G′对频率的依赖程度。

1.4.4 溶解度的测定

参考邵瑶瑶[9]的方法，将1 g EYP-SA乳液冷凝胶与9 mL磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 8.0）在12 000 r/min下均质2 min。静置20 min后，在4 ℃下以10 000 r/min离心30 min，离心后取出1 mL上清液，在540 nm处测定吸光度，溶解度的计算见式（2）。

溶解度（%）=PSPA×100%。（2）

式中：PS为上清液蛋白质含量（g）；PA为样品中蛋白质含量（g）。

1.4.5 表面疏水性的测定

参考Xu等[10]的方法，称取1 g EYP-SA乳液冷凝胶，加入磷酸缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），均质后于4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。取4 mL稀释液加入20 μL 8 mmol/L ANS（8-苯胺基-1-萘磺酸铵）溶液混合并漩涡混匀，在室温和黑暗条件下反应15 min，测定荧光强度。参数为激发波长390 mm，扫描范围420～600 nm。

1.4.6 凝胶中分子作用力的测定

参考Wang等[11]的方法，取0.6 g EYP-SA乳液冷凝胶，放入10 mL离心管中，加入5.4 mL S1，用均质机以12 000 r/min处理2 min，于10 000 r/min条件下离心20 min，取上清液测定蛋白质含量；沉淀部分继续加入5.4 mL S2，重复S1的操作，后续S3、S4均重复上述操作。

S1为0.6 mol/L NaCl，S2为0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L 尿素，S3为0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L 尿素，S4为0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L 尿素＋0.5 mol/L β-巯基乙醇。

1.4.7 傅里叶红外光谱（FTIR）分析

取冷冻干燥后的样品2 mg与200 mg KBr混合，研磨均匀后进行压片，利用傅里叶红外光谱仪对EYP-SA乳液冷凝胶粉末进行分析，测定波长为400～4 000 cm-1，扫描次数为3，分辨率为4 cm-1。谱图经标准化后采用Peakfit 4.12软件进行蛋白质二级结构分析[12]。

1.4.8 荧光显微镜分析

参考Mao等[13]的方法，用荧光显微镜观察EYP-SA乳液冷凝胶的微观分布。取少量样品于载玻片上，将尼罗红（0.1%丙二醇）和尼罗蓝（0.1%去离子水）按1∶1的比例混合约15 min，每个样品中加入10 μL混合荧光染料溶液，盖上盖玻片。平衡2 min后进行观察，使用荧光显微镜仪器自带的软件控制摄像机拍照。

1.5 统计分析

采用Origin 2018软件制图，采用Duncan's法进行显著性分析（Plt;0.05），所有实验进行3次平行操作，数据采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 pH对EYP-SA乳液冷凝胶热稳定性的影响

通过差示扫描量热法比较样品间的热量差，分析EYP-SA的热稳定性，见表1。

由表1可知，在加热过程中所有样品均在60～76 ℃之间显示吸热峰，pH为7.0时Td最高，为75.72 ℃，说明此时EYP-SA乳液冷凝胶具有更高的稳定性。此外，ΔH可以反映EYP-SA的变性情况，ΔH值高，表明样品结构有序，不易变性[14]。EYP-SA在碱性条件下的ΔH显著高于酸性条件下，可能是碱性环境导致EYP与SA相互作用加强，形成氢键和疏水键等影响了蛋白质的结构。综上，中性环境（pH 7.0）的EYP-SA乳液冷凝胶热稳定性好，碱性环境（pH 9.0）的EYP-SA乳液冷凝胶结构稳定。

2.2 pH对蛋黄-海藻酸钠乳液冷凝胶水分分布的影响

由表2可知，EYP-SA乳液冷凝胶中的水主要为自由水（T23），随着pH的增大，EYP-SA乳液冷凝胶半结合水（T22）出现，结合水（T21）峰面积显著增加，自由水（T23）峰面积先下降后上升。然而不同pH下三者峰值之和不变，表明pH可以影响EYP-SA乳液冷凝胶内部与水结合的能力，pH升高，EYP-SA乳液冷凝胶中水分子的流动性减弱，水分子在凝胶结构中的稳定性提高，逐渐形成了均匀致密的网络结构，水分被牢固的锁在网孔中，由自由水转变为结合水和半结合水。

2.3 pH对EYP-SA乳液冷凝胶流变特性的影响

通过频率扫描观察pH对EYP-SA乳液冷凝胶黏弹性的影响，结果见图1。

由图1可知，损耗系数（tanδ）值在0.1～1之间，说明弹性形变大于黏性形变（G′＞G″），EYP-SA乳液冷凝胶是以弹性为基础的凝胶网络结构。此外，G′和G″随频率的增加呈上升趋势，反映了乳液冷凝胶的弱凝胶性。

由表3可知，幂定律拟合的系数R2在0.96～0.99范围内，表明实验中幂定律对静态流变特征曲线的拟合度较高，n′均大于0，乳液凝胶的G′具有频率依赖性，证实EYP-SA乳液冷凝胶为弱凝胶。G′和G″随着pH的增加而降低，同A′数值变化分析，得知EYP-SA乳液冷凝胶的弹性和刚性随pH的升高而减弱。

2.4 pH对EYP-SA乳液冷凝胶蛋白溶解性的影响

pH对EYP-SA乳液冷凝胶蛋白质溶解度的影响见图2。

由图2可知，随着pH的升高，EYP-SA乳液冷凝胶蛋白质溶解度逐渐增大，在pH为5.0时，EYP-SA乳液冷凝胶蛋白质溶解度最低（36.95%），可能是此时EYP形成了不溶性的高密度脂蛋白-卵黄高磷蛋白复合物，随着pH的升高，体系中的负电荷数量增加，静电排斥力导致蛋黄颗粒解聚蛋白质的溶解度增加[15]。Yang等[16]在研究pH对EYP溶解度的影响中发现，EYP的溶解度与pH诱导的蛋白质构象状态之间存在显著性相关，蛋白质的溶解度随着蛋白质内疏水性和极性基团的暴露而增加。

2.5 pH对EYP-SA乳液冷凝胶表面疏水性的影响

在自然状态下，极性分子一般分布在蛋白质结构表面，非极性分子通常埋藏在蛋白质内部作为疏水核心[17]。

由图3可知，随着pH的增大，荧光最大吸收波长从510～485 nm发生蓝移现象，说明pH导致EYP-SA乳液冷凝胶聚集体数量较多，整体是一个疏水环境[18]。同时，随着EYP-SA pH的增加，EYP-SA的表面疏水性也逐渐增大，可能是碱性环境导致蛋白质原有结构展开，使原本嵌在蛋白质分子中的疏水基团暴露在蛋白质分子表面，疏水基团与ANS结合后荧光强度增强。

2.6 pH对EYP-SA乳液冷凝胶分子力的影响

蛋白质的凝胶化首先是蛋白质分子链在极端环境下发生变性展开，其次是通过分子间相互作用力，如离子键、氢键、疏水相互作用和共价键（主要是二硫键）的变化引起蛋白质分子的聚集[19]。

由图4可知，在酸性条件下，带正电的EYP与带负电的SA通过静电吸引和疏水相互作用结合形成EYP-SA配合物，随着pH的升高，EYP的表面负电荷量逐渐增多，与带负电的SA产生静电斥力，离子键先下降后上升。同时，pH升高，蛋白质结构展开，二硫键断裂，疏水基团暴露，EYP和SA与水结合形成氢键，疏水相互作用和氢键的增强对EYP-SA乳液冷凝胶的形成贡献度显著增大。在不同pH下形成复合凝胶的作用力贡献度各不相同，疏水相互作用和氢键是EYP-SA乳液冷凝胶形成的主要分子力。

2.7 pH对EYP-SA乳液冷凝胶二级结构的影响

FTIR光谱主要通过分子振动频率和强度来推测官能团和化学键的信息。

由图5可知，随着pH变化，EYP-SA乳液冷凝胶没有新的吸收峰出现，在3 650～3 200 cm-1之间的峰是O—H和N—H的伸缩振动引起的，说明EYP-SA存在分子间和分子内氢键，且随着pH的增大，峰逐渐增高，可知凝胶过程中部分水分子与蛋白质结合形成结合水，与水分分布结果相符。处于2 985～2 800 cm-1的两个峰是由亚甲基（C—H）的对称和不对称伸缩振动引起的，这两个伸缩条带大多出现在脂质样品中[20]。随着pH改变，处于2 985～2 800 cm-1的两个峰没有明显变化，说明EYP-SA的C—H伸缩振动在pH 5.0～9.0范围内相对稳定。

酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1）是FTIR光谱中关于蛋白质二级结构信息最丰富的部分，采用傅里叶去卷积法对二级结构进一步分析，利用高斯线性函数拟合1 700～1 600 cm-1区域的红外光谱，得到二级结构的含量，见表4。

由表4可知，在不同的pH条件下α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的含量变化显著（P＜0.05），表明蛋白质的二级结构对pH敏感。EYP-SA乳液冷凝胶中的蛋白质二级结构主要以β-折叠为主，其次是β-转角或α-螺旋，β-折叠是肽主链处于最伸展的构象，而β-转角区域中疏水相互作用和形成氢键能力强的氨基酸较多，两者的含量较大时，对蛋白形成结实的球状结构具有积极作用[21]。α-螺旋含量随着pH的增大而增加，α-螺旋的稳定性依赖于氢键，说明pH可使EYP-SA与水分子间的氢键作用增强，与分子间作力结果一致。无规则卷曲的含量随着pH的增大而降低，表明pH使EYP-SA的构象更有序，可能是由于蛋白质二级结构在碱性条件下更容易发生变化，碱性环境有助于EYP-SA乳液冷凝胶有序结构的形成，也可能是碱性条件下各二级结构的含量差异不显著的原因。

2.8 pH对EYP-SA乳液冷凝胶微观结构的影响

乳液和乳液冷凝胶的微观结构可以揭示液滴的微观形态和分布，见图6。

由图6可知，所有的液滴几乎都呈球形，且EYP-SA成功吸附在油水界面上，稳定地包裹着油滴。pH为6.0和8.0时，乳液液滴发生了严重的絮凝和聚集，液滴大且不规则，多呈簇状分布。蛋黄颗粒在极端环境（pH 9.0）下会裂解释放出小分子蛋白，蛋白质粒径小更容易吸附在界面上，也可能是带负电荷的蛋白质与阴离子多糖间的静电斥力导致聚集体的收缩，平均粒径变小，微观表现为分散得更加均匀。万盈[22]发现当蛋白质和多糖带有相同电荷时，蛋白质上的正电荷补丁可以与多糖的阴离子基团静电重组，这也可能是EYP-SA乳液冷凝胶在pH 9.0时结构更稳定的原因。

3 结论

以EYP和SA为基质，通过高速剪切均质机与葵花籽油混合（水相∶油相为7∶3）形成O/W型EYP-SA乳液冷凝胶，改变其pH，发现随着pH的增大，凝胶对水的结合能力增强，自由水转变成结合水和半结合水；蛋黄乳液冷凝胶的储能模量和损耗模量随着pH的增大而下降；当pH为7.0时，EYP-SA乳液冷凝胶热稳定性好，Td为75.72 ℃；当pH为9.0时，EYP-SA乳液冷凝胶溶解度和表面疏水性高。

酸性条件下，EYP带正电，能够和阴离子多糖SA通过静电相互作用结合，形成微粒，此时离子键对凝胶的形成贡献最大。随着pH的升高，体系中负电荷的数量增加，静电排斥力导致蛋黄颗粒解聚，蛋白质溶解度增加，二硫键降低，静电相互作用先降低后升高，表面疏水性提高，疏水相互作用增强。EYP-SA乳液冷凝胶的二级结构主要以β-折叠为主，其次是β-转角或α-螺旋，随着pH的增大，蛋黄蛋白质结构展开，β-折叠和α-螺旋含量上升，EYP-SA与水结合的能力增强，氢键显著提高。从EYP-SA冷凝胶的微观结构可以发现，pH为9.0时，液滴小且分散均匀，EYP-SA乳液冷凝胶更有利于物质包埋。随着pH值的升高，蛋白质结构展开并被赋予了更多的电荷，增强了氢键和EYP-SA分子间的相互作用，改善了EYP-SA乳液冷凝胶的性质。

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收稿日期：2024-05-16

基金项目：黑龙江省“百千万”工程科技重大专项（2019ZX07B03-3）

作者简介：张根生（1964—），男，教授，硕士，研究方向：畜产品加工与贮藏。

*通信作者：费英敏（1973—），女，副教授，硕士，研究方向：畜产品加工与贮藏。