生防菌对油茶病害防治效果的分析

一、概述

油茶原产于中国，是我国第一大木本食用油料树种，也是世界四大木本食用油料树种之一。2022年中央一号文件《中共中央国务院关于做好2022年全面推进乡村振兴重点工作的意见》明确指出，支持扩大油茶种植面积，促进木本粮油和林下经济发展。油茶病害是制约油茶高产、优质的主要问题之一。目前，已经报道了42种油茶病害，对这些病害的防治仍然以化学防治手段为主，容易引起一系列的“3R”问题，包括抗性、残留和再猖獗。同时，还会造成人畜伤害、环境污染、油茶产量降低等多方面的问题。因此，开展油茶病害生物防治方面的研究是保障油茶产业绿色健康发展的有效途径。

近年，我国研究人员开始考虑从微生物或植物中寻找对油茶炭疽病有防治功能的生物农药，筛选和利用拮抗微生物成为防治油茶炭疽病研究的新方向。2010年，游嘉研究分析壳聚糖对油茶炭疽病菌的生长有一定的抑制作用，且发现增大壳聚糖的浓度可增强抑菌活性。2019年，喻锦秀研究发现拮抗细菌发酵液中主要是脂肽类物质对油茶炭疽病起拮抗作用。在油茶炭疽病拮抗放线菌的研究方面，邓雷通过筛选及对抑菌谱的研究发现3个抑制作用较强的菌株。周盈等报道了1种对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BSn5及其产生的抑菌蛋白APn5，但该菌仅能拮抗胡萝卜软腐欧文氏菌亚种，其生防范围较窄。宋光桃发现短芽孢杆菌Z26能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半边疯病菌等病原菌的生长，该生防菌剂对油茶炭疽病的最大抑制率达到83.4%。徐睿等发现枯草芽孢杆菌YL13和球孢链霉菌球孢亚种（Streptomyces globisporus subsp. Globisporus） F10对油茶炭疽病菌具有明显的抑制作用，可以用于生物防治药剂的开发。

锥毛壳菌（Coniochaeta velutina）属于真菌界子囊菌门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes）。该真菌常以内生菌存在于健康植物组织中或土壤中。2015年，Xie在杉木的茎组织中分离到内生菌C. velutina。该研究发现，C. velutina在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、燕麦培养基（Oatmeal agar，OA）等培养基上均可生长。菌落表面干燥、起皱，中心呈深褐色或鲜黄色，边缘呈白色至琥珀色。扫描电子显微镜（Scanning electron micrographs，SEM）观察到菌丝在培养基表面长成圆形。菌丝体逐渐交织、成熟，形成深褐色的外皮层。包壳外壁由深褐色的棱角纹理组成，刚毛，中央有孔口，直径可达143 μm。子囊孢子透明、壁光滑，大小为（3～4.5 ）μm×（4.5～7 ）μm。刚毛棕色，圆柱形，逐渐变细到一个圆形尖端，通常是直的、有隔膜、光滑的壁或疣状，宽2.0～4.5 μm，最长25 μm。营养菌丝透明，宽1.5～2.5 μm。分生孢子梗减少为分生孢子细胞。分生孢子细胞是肠胚细胞，透明，带有离散的圆瓶，从圆柱形到心室，颈部长1～3 μm，颈圈开口1～2 μm宽。孢子形成丰富。分生孢子透明，单细胞，壁光滑，圆柱形，末端圆形或一端略尖，（1.0～2.0）μm×（2.0～6.5）μm。PDA表面形成一些疣状、不规则的孢子。

2022年，研究团队从油茶健康叶片中分离获得内生真菌C. velutina。在PDA培养基上证明该真菌能够显著抑制胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、链格孢菌（Alternaria alternata）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。但是该生防菌在田间对以上3种致病菌的防治效果仍未测定。因此，本研究利用盆栽油茶苗，在人工接种3种致病菌的基础上，将生防菌C. velutina制备成发酵液，按照50%发酵液、100%发酵液（原液）分别喷洒到人工接菌的油茶植株上，以喷洒无菌水作为对照。通过测量油茶叶部病斑的直径和病情指数来检测生防菌的田间生物防治效果。通过该研究可以为生防真菌的开发利用奠定基础。

二、试验材料与方法

（一）试验材料

菌株保存在信阳农林学院林学院林木病理学实验室。生防真菌为锥毛壳菌，致病真菌为链格孢菌、葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌（见图1）。

油茶苗选用3年生长林4号品种油茶苗。筛选健壮、无病虫害且长势大小一致的油茶苗进行栽植。

（二）试验方法

1.发酵液制备。在超净工作台中，使用打孔器对实验室保存好的生防真菌C. velutina菌种进行打孔（打孔器直径5 mm），用挑针挑取菌饼放至含PD培养基的锥形瓶内，每个瓶内放5个菌饼，共制作9瓶（见图2）。锥形瓶用透气的封口膜盖好，把锥形瓶固定在摇床内进行培养。摇床设定温度27 ℃，转速为150 rpm。

2.油茶人工接种致病菌。首先，把PDA培养基上培养好的链格孢菌、葡萄座腔菌和胶孢炭疽菌使用打孔器（直径为5 mm）进行打菌饼。其次，选取长势大小相同的油茶苗，每盆植株上挑取10片健康的油茶叶片，用注射器把叶片主脉的左右两侧分别轻扎3个小孔（表皮刺破即可）。最后，利用已灭菌的挑针挑取菌饼，并将这些菌饼贴紧在油茶叶片的针孔处。为了保湿培养，使用塑料薄膜紧密地缠绕住叶片。

3.喷施生防菌的发酵液。接菌3 d后，按照生防菌发酵液100%（原液）、发酵液50%（稀释1倍）、无菌水（对照组）分别喷洒到人工接菌的油茶植株上。每个浓度的菌液分别喷洒在3棵植株上，并且每隔5 d进行1次喷洒，共喷施3次。经过20 d的持续观察，记录不同浓度发酵液对发病植株叶斑大小直径的影响。最后，将这些数据进行统计学分析。

三、结果与分析

（一）生防菌C. velutina的发酵液

生防菌C. velutina在PD培养基内振荡培养20 d后（见图3），锥形瓶内发酵液中有试验中获得的生防菌C. velutina发酵液较多的菌丝体球，同时PD培养基也变得清澈透明，说明生防菌C. velutina在PD培养基中进行生长、繁殖，生长过程中吸收了PD培养基中的营养物质。打开锥形瓶的封口膜能够闻到明显真菌发酵的气味，这种气味可能是由于C. velutina在生长过程中产生的特定代谢产物或挥发性化合物。

（二）发酵液对油茶叶部病害的防治效果

随着发酵液浓度的提高，从50%发酵液到100%发酵液，油茶叶部的病斑直径均逐渐减小，病情指数下降，抑菌率也呈上升趋势（见表1）。对于胶孢炭疽菌引起的油茶叶部病斑，在第3次喷50%发酵液时病斑直径为2.58 cm，抑菌率为19.12%，而100%发酵液处理的病斑直径仅为2.33 cm，抑菌率达到26.96%。对于链格孢菌引起的油茶叶部病斑，在第3次喷50%发酵液时病斑直径为2.03 cm，抑菌率为16.80%，而100%发酵液处理的病斑直径仅为1.90 cm，抑菌率达到22.13%。对于葡萄座腔菌引起的油茶叶部病斑，在第3次喷50%发酵液时病斑直径为2.19 cm，抑菌率为15.76%，而100%发酵液处理的病斑直径仅为2.11 cm，抑菌率为18.84%。

四、讨论

油茶是我国生产油料的原材料之一，常因为病害的发生导致其产量和质量有所降低，其中，油茶叶部病害是油茶病害中发生最多的。这些病害的病原菌主要由真菌引起，如黑盘孢目中炭疽菌属（Colletotrichum spp.）、丛梗孢目中链格孢属（Alternaria spp.）、葡萄座腔菌目。因此，该研究选用实验室前期从油茶叶斑病中分离的致病菌（胶孢炭疽菌、葡萄座腔菌、链格孢菌）作为本次油茶人工接菌的菌株材料，选用这3种致病菌使油茶叶片发病，发病情况更接近田间自然发病情况，从而能够更准确地检测生防菌株的防治效果。

生防菌在室内环境条件下进行试验时，其防治效果表现很好，当移至田间环境时，其防治效果未能达到室内效果。当前，国内筛选和鉴定油茶叶斑病生防真菌的主要手段为平板对峙法和室内离体叶片抑菌率试验。然而，这些方法仅基于理想条件下的试验结果，与实际应用场景及自然环境条件之间存在显著差异。例如，王义勋等人关于解淀粉芽孢杆菌WH1发酵液防治油茶炭疽菌药效调查，发现该发酵液在室内培养72 h，抑菌率为100%，培养96 h，抑菌率为83.2%。在田间施用时解淀粉芽孢杆菌WH1发酵液防效为74.4%。在多变的环境条件，如温度、湿度、光照及pH等因素的综合作用下，生防菌的防治效果发生变化。因此，生防菌的实际防治效果与植物所处环境及生防菌的定殖能力有关。同时，Rajkumar等通过筛选生防菌株的试验发现，使用盆栽进行生防效果测定，相较于离体叶片筛选出的生防菌更准确。因此，本研究使用盆栽油茶苗，先进行人为接种致病菌，然后进行生物防治效果测定，这一方法更易于检测出生防菌C. velutina的防治效果，也为该菌进一步开发利用奠定理论基础。

五、结论

通过室内盆栽种植油茶苗进行大田模拟试验，系统分析了C. velutina发酵液对胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、链格孢菌（A. alternata）和葡萄座腔菌（B. dothidea）3种病原菌所致的油茶叶斑病的防治效果。试验结果表明，该发酵液对这些油茶叶部病害具有显著的抑制效果，且随着发酵液浓度的增加和喷洒次数的增多，防治效果逐渐提升，连续多次喷洒该发酵液能够显著提高防治效果。与化学农药相比，生防菌C. velutina作为一种生物防治剂，具有较低的环境风险和更好的生态兼容性，这对于推动农业的绿色发展具有重要意义。

基金项目：河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（232102110050），河南省高等学校重点科研项目（23B220001），2023年河南省本科高校大学生创新创业训练项目（202311326004）。

作者简介：李卓琪（2002—），男，河南三门峡人，硕士在读，主要从事林业病理研究。