EHD2、miR-let-7c 和lncRNA FOXD2-AS1 在人喉鳞状细胞癌组织中的表达及其关联性分析

［摘 要］ 目的：探讨 Eps15同源结构域蛋白 2（EHD2）、微小 RNA let-7c（miR-let-7c） 和长链非编码RNA （lncRNA） FOXD2-AS1 在喉鳞状细胞癌（LSCC） 组织中的表达水平，阐明EHD2/miRlet-7c/FOXD2-AS1信号轴与LSCC发生的关联性。方法：收集40例LSCC患者的癌组织标本，按照病理类型分为低级别组（中或高分化， 32 例） 和高级别组（低分化， 8 例）， 按照肿瘤淋巴结转移（TNM） 临床分期分为TNM 早期组（Ⅰ-Ⅱ期， 13 例） 和TNM 晚期组（Ⅲ-Ⅳ期， 27 例）， 按照有无淋巴结转移分为转移组（21 例） 和无转移组（19 例）。另取40 例对应癌旁正常组织标本作为对照组。采用免疫组织化学法检测各组标本中EHD2 表达情况，分析其与LSCC 患者临床病理参数之间的关系，采用生物信息学方法筛选出miR-let-7c 作为候选微小RNA （miRNA），与其启动子区域存在结合位点的FOXD2-AS1 作为候选lncRNA。取10 对新鲜的LSCC 组织标本和癌旁正常组织标本，采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR） 法检测2 组样本中EHD2 mRNA、miRNA-let-7c 和FOXD2-AS1 表达水平，并验证其关联性。结果：与癌旁正常组织比较，LSCC组织中EHD2表达水平明显降低 （Plt;0. 01），且TNM 早期组患者LSCC 组织中EHD2 阳性表达率明显高于TNM 晚期组（Plt;0. 05），病理类别和有无淋巴结转移与EHD2 表达无明显关联（Pgt;0. 05）。与癌旁正常组织比较，LSCC 组织中miR-let-7c 表达水平明显降低（Plt;0. 01），FOXD2-AS1 表达水平明显升高（Plt;0. 05）。LSCC 组织中FOXD2-AS1 与miR-let-7c 表达水平呈负相关关系（r=-0. 67，Plt;0. 05），miR-let-7c 与EHD2 mRNA表达水平呈负相关关系 （r=-0. 83，Plt;0. 01）。结论：EHD2和 miR-let-7c在 LSCC 组织中呈低表达，可能是新的抑癌基因；FOXD2-AS1 在LSCC 组织中高表达，可能是新的原癌基因；FOXD2-AS1/miR-let-7c/EHD2 信号轴可能参与了LSCC 的发生发展。

［关键词］ Eps15 同源结构域蛋白2； 微小RNA let-7c； 喉鳞状细胞癌； 长链非编码核糖核酸； 原癌基因

［中图分类号］ R767. 19 ［文献标志码］ A

喉癌的全球发病率约为2. 4/10 万［1］， 是常见的头颈部恶性肿瘤之一，93%～99% 的喉癌病理类型属于喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cellcarcinoma， LSCC）［2］， 探讨LSCC 的发生机制和发展规律十分重要。Eps15 同源结构域蛋白2（Eps15 homologous domain protein 2， EHD2） 是EHD 蛋白家族成员之一，作为近年来新发现的一种膜转运调控蛋白，具有参与和调节细胞受体内吞的功能［3］。研究［4］ 显示：EHD2 可能是喉癌潜在的抑癌基因，但其分子机制尚未见报道。分析美国癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）-头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous CellCarcinoma，HNSCC） 数据库（http：//www. cancer.gov/tcga） 发现：微小RNA let-7c （microRNA-let-7c，miR-let-7c） 与EHD2 表达呈负相关关系， 长链非编码核糖核酸（long non-coding RNA， lncRNA）FOXD2-AS1 在人LSCC 组织中明显高表达，且与miR-let-7c 启动子区域存在结合位点。目前，关于EHD2、miR-let-7c 和FOXD2-AS1 与LSCC 发生发展的关联性未见报道。本研究通过分子生物学实验探讨EHD2、miR-let-7c 和FOXD2-AS1 与LSCC 发生发展的关联性。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2018年1月-2019年12月在吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科接受手术的40 例LSCC 患者的癌组织标本，另取与其配对的癌旁正常组织标本作为对照组。所有患者均诊断明确， 肿瘤淋巴结转移（tumor node metastasis，TNM） 分期按照国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会共同制定的第8 版头颈部肿瘤分期标准。纳入标准：①经临床病理确诊为LSCC；②术前未行化疗、放疗或靶向治疗等； ③ 无重大免疫系统疾病； ④ 同意参与本研究并签署《知情同意书》。排除标准：①既往有LSCC 或其他肿瘤病史；②既往手术史且为术后复发； ③ 伴随严重的心、肺和肾等疾病；④未达到肿瘤完整切除标准；⑤术前行中医治疗、新辅助化疗或生物靶向治疗等。纳入本研究的LSCC 患者中， 女性13 例， 男性27 例，年龄42～82 岁，平均年龄为（60. 3±8. 4） 岁，按照病理类别分为低级别组（中或高分化， 32 例）和高级别组（低分化， 8 例）， 按照TNM 临床分期分为TNM 早期组（Ⅰ-Ⅱ 期， 13 例） 和晚期组（Ⅲ-Ⅳ期，27 例），按照是否淋巴结转移分为转移组（21 例） 和无转移组（19 例）。本研究方案经吉林大学第一医院医学伦理委员会批准，伦理审批号：2022416。

1. 2 主 要 试 剂 和 仪 器 即 用 型 免 疫 组 织 化 学UltraSensitiveTM 链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase， SP） 试剂盒、3， 3'- 二氨基联苯胺（3， 3'-diaminobenzidine，DAB） 显色剂和EHD2 抗体购于北京博奥森生物技术有限公司， TRIzol 试剂购于美国赛默飞世尔科技公司， All-in-OneTM 微小RNA （micro RNA，miRNA） 和实时荧光定量PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 试剂盒和验证引物HsnRNA U6 primer 购于广州复能基因有限公司， MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix 试剂盒购于莫纳生物科技有限公司， 引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。RT-qPCR 仪购于瑞士罗氏公司。

1. 3 免疫组织化学法检测 LSCC 组织中 EHD2蛋白阳性表达率 按照 SP说明书染色程序操作。将石蜡冰冻切片从-80℃冰箱中取出，置于-20 ℃冰箱过夜，次日置于4 ℃冰箱1 h。采用75% 乙醇溶液固定1 h， 磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline， PBS） 洗涤3 次， 每次5 min， 蛋白酶K（protease K， PK）（20 mg·L-1） 消化10～15 min，PBS 缓冲液洗涤后， SP 试剂盒阻断30 min， 封闭30 min，一抗37 ℃孵育1 h 或4 ℃过夜。滴加二抗，DAB 显色，苏木素复染，脱水，透明，（中性） 树胶封片，镜下观察LSCC 组织中EHD2 表达情况。由2 名病理科医生采用双盲法阅片。EHD2 蛋白在细胞膜或细胞质中呈弥漫分布的黄色或黄褐色为EHD2 蛋白阳性表达。每张组织切片随机观察10 个高倍视野（×400）， 采用免疫反应评分进行半定量分析，参照朱红珍等［5］ 的分级及评分标准计算EHD 蛋白阳性表达率，EHD 蛋白阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%， EHD 蛋白阳性表达率分为4 个等级， 细胞染色强度分为4 个等级。每张切片阳性表达率与染色强度得分乘积0～1 分为阴性表达，≥2 分为阳性表达。

1. 4 RT-qPCR法检测LSCC组织中EHD2 mRNA、miR-let-7c和 FOXD2-AS1 表达水平 TRIzol法提取组织标本中的总RNA。采用罗氏LC-96 RT-qPCR仪进行扩增， miRNA qPCR 按照All-in-OneTMcDNA 第一链合成试剂盒进行逆转录，采用All-in-OneTM miRNA qPCR 试剂盒进行扩增， 以U6 作为内参基因。扩增体系：qPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，miRNA-let-7c 引物（上游引物： 5'- TGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3'， 下游引物采用试剂盒中通用引物） 各2 μL，通用适配器PCR 引物2 μL，无酶水4 μL。扩增条件为： 95 ℃ 预变性10 min，95 ℃、20 s，60 ℃ 、30 s，72 ℃、10 s，共35 个循环。FOXD2-AS1 和 EHD2 采 用 MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 试剂盒，反应体系：qPCR Mix10 μL， 上、下游引物（10 μmol·L-1） 0. 4 μL，cDNA 模板2 μL， 无菌超净水7. 2 μL， 共20 μL。反应条件：预变性95 ℃、10 min。首次变性95 ℃、15 s， 55 ℃ 退火20 s， 72 ℃ 延伸10 s， 共40 个循环。采用2-ΔΔCT 法进行定量计算，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 为 内 参， 检 测 FOXD2-AS1 和 EHD2mRNA 表达水平。引物序列： GAPDH 上游引物GGTCGGAGTCAACGGATTTG，GAPDH 下游引物GGAAGATGGTGATG GGATTTC； FOXD2-AS1 上游引物TGGACCTAGCAGCTCCA，FOXD2-AS1 下游引物AGTTGAAGGTGCACACTG； EHD2 上游引物TTTGCGAAGATTCAGCTGGAACAT， EHD2 下游引物GGCTTCAGCGAGTGAAACTTGGT。

1. 5 统计学分析 采用 GrahPad Prism5. 0统计软件进行统计学分析和图表绘制。免疫组织化学结果为半定量资料，组间比较采用χ2 检验。LSCC 组织中EHD2 mRNA、miR-let-7c 和FOXD2-AS1 表达水平为配对计量资料，符合正态分布，组间比较采用Mann Whitney t 检验。LSCC 组织中EHD2 mRNA、miR-let-7c 和FOXD2-AS1 表达水平的相关性分析采用Spearman 相关性检验。以Plt;0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 LSCC组织中 EHD2蛋白阳性表达率、EHD2mRNA 表达水平及 EHD2蛋白阳性表达率与患者临床病理参数的关系 免疫组织化学分析结果显示： LSCC 组织中EHD2 蛋白呈低表达或不表达，在癌旁正常组织中EHD2 蛋白呈高表达， 见图1。癌旁正常组织中EHD2 蛋白阳性表达率（67. 5%，27/40） 明显高于LSCC 组织（30%， 12/40）， 组间比较差异有统计学意义（χ2=10. 1， Plt;0. 01），见表1。RT-qPCR 结果显示： 癌旁正常组织中EHD2 mRNA 表达水平高于LSCC 组织（Plt;0. 05），见图2。TNM 早期组患者中EHD2 蛋白阳性表达率为54%， 明显高于TNM 晚期组（19%）（Plt;0. 05）， 表明EHD2 表达与TNM 分期有明显关联，随着TNM 分期的进展，EHD2 蛋白阳性表达率降低。EHD2 蛋白阳性表达率与患者病理类别和有无淋巴结转移无明显关联（Pgt;0. 05）。见表2。

2. 2 LSCC组织中FOXD2-AS1和miR-let-7c表达水平 与癌旁正常组织比较，LSCC组织中FOXD2-AS1 表达水平明显升高（Plt;0. 05），miR-let-7c 表达水平明显降低（Plt;0. 05）。见图3 和4。

2. 3 LSCC 组 织 中 FOXD2-AS1 与 miR-let-7c、EHD2 mRNA 与 miRNA-let-7c表达水平的相关性 相关性分析显示：LSCC 组织中FOXD2-AS1 与miR-let-7c 表达水平呈负相关关系（r=-0. 67，Plt;0. 05），提示FOXD2-AS1可负向调控miR-let-7c表达，见图5。miR-let-7c与EHD2 mRNA表达水平呈负相关关系（r=-0. 83，Plt;0. 01），提示miR-let-7c可负向调控EHD2 mRNA 表达， 见图6。FOXD2-AS1、miR-let-7c 和EHD2 相互作用机制见图7。

3 讨 论

2018 年全球约有95 000 例患者死于喉癌 ［6］。尽管治疗手段不断进步，LSCC 患者的5 年生存率并未提高［7］。手术是LSCC 的主要的治疗手段［8］，但患者术后存在言语功能和吞咽功能丧失的风险。此外，LSCC 细胞对大部分化疗药物并不敏感，因此，深入探讨影响LSCC 发生发展的驱动基因及潜在分子机制和寻找治疗靶点非常重要。

本研究结果显示：LSCC 组织中EHD2 阳性表达率明显降低， 与既往报道［5］ 的食管鳞癌组织中EHD2 阳性表达率明显降低一致，提示EHD2 可能是LSCC 潜在的抑癌基因。本研究结果显示：EHD2 在LSCC 组织中呈低表达，在癌旁正常组织中呈高表达；EHD2 表达与TNM 分期存在明显关联，随着分期进展，EHD2 阳性表达率降低，与鲁科利等［4］ 的研究结果一致。吕丽婷等［9］ 发现：EHD2 表达水平可能与非小细胞肺癌的恶性程度有关，EHD2 高表达的非小细胞肺癌患者预后较好。鲁科利等［4］ 认为：EHD2 阳性表达率与喉癌患者的病理类别和淋巴结转移情况有密切关联，但本研究结果表明EHD2 蛋白阳性表达率与淋巴结转移及病理类别无明显关联，因此需要进一步扩大样本量明确EHD2 表达水平与LSCC 临床病理参数之间的关系。EHD2 还在多种肿瘤进展中起作用，如结肠腺癌［10］、甲状腺乳头状癌［11］ 和肝癌［12］ 等， 提示EHD2 可能可以作为评价包括LSCC 在内的多种肿瘤预后的客观指标之一。

miRNA 是一类长度为18～25 个核苷酸的单链RNA［13］，可与特定mRNA 结合或者调节特定mRNA 的翻译过程来调控基因表达。王苹等［14］ 证实：多个miRNA 在喉癌组织中呈差异表达，推测部分miRNA 可能参与喉癌发生。本研究结果显示：癌旁正常组织中miR-let-7c 表达水平明显高于LSCC 组织， 其可能发挥抑癌作用。WU 等［15］ 发现： circCORO1C 通过竞争性结合miR-let-7c， 降低前B 细胞白血病转录因子3 表达水平， 促进LSCC 发生。研究［16-17］ 显示： miR-let-7c 在多种癌组织中表达水平降低， 可能发挥抑癌作用， 如miR-let-7c 靶向高迁移率蛋白抑制膀胱癌细胞侵袭和迁移，靶向胸苷激酶1 影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭等，miR-let-7c 有望作为肿瘤生物标志物。

lncRNA 分布于细胞核和细胞质，在转录、转录后和表观异常等多个水平调控基因表达。FOXD2-AS1 是一类常见的lncRNA， 位于染色体1p33 上，含2 527 个核苷酸，与癌症的发生和恶化关系密切［7］。本研究结果显示： LSCC 组织中FOXD2-AS1 表达水平明显高于癌旁正常组织，与陈伟等［18］ 的研究结果一致。LI 等［19］ 发现：FOXD2-AS1 主要位于LSCC 细胞核中，可以作为蛋白支架提高信号转导因子和转录激活因子3 的转录活性， 调控喉癌干细胞特性和促进喉癌化疗耐药。研究［20-23］ 显示：FOXD2-AS1 在直肠癌、甲状腺癌、胶质瘤和食管癌中呈异常高表达，是一种促癌基因， 影响癌症进展。FOXD2-AS1 在包括LSCC 在内的多种恶性肿瘤中可能是原癌基因，有望成为新型的肿瘤标志物和治疗靶点。

本研究结果显示： EHD2 和miR-let-7c 在LSCC 组织中存在明显负相关关系，尽管miR-let-7c在LSCC 组织中与癌旁正常组织中的表达趋势与EHD2 相同， 但仍可能通过负向调控EHD2 抑制LSCC的发生发展；另外，FOXD2-AS1与miR-let-7c呈明显负相关关系。研 究［24］ 显 示： miRNA 是lncRNA 发挥作用的重要环节。lncRNA 竞争性结合目标miRNA， 从而降低其对下游基因的转录抑制［25］。本文作者推测FOXD2-AS1 可能竞争性结合miR-let-7c，从而对LSCC 的发生发展产生影响。

综上所述，EHD2、miR-let-7c 和FOXD2-AS1在LSCC 组织和癌旁正常组织中的表达存在差异性， 且FOXD2-AS1 表达与miR-let-7c 表达呈负相关关系， EHD2 表达与miR-let-7c 表达呈负相关关系，提示EHD2/miR-let-7c/FOXD2-AS1 信号轴可能参与调控LSCC 的发生，本课题组将在后续实验中进一步深入研究其具体调控机制。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：宫美恒参与实验设计、实验操作、数据整理和论文撰写，陈沫参与实验操作和病理制片，韩慧参与实验设计和病理阅片，于婷婷参与实验设计、数据分析和论文审校。

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