Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂MSAB 对人子宫内膜基质细胞纤维化反应的影响

［摘 要］ 目的：探讨Wnt/β-连环蛋白 （β-catenin） 信号通路抑制剂3-（4-甲基苯基磺酰胺基） 苯甲酸甲酯（MSAB） 对人子宫内膜基质细胞（HESCs） 纤维化反应的影响， 为MSAB 应用于宫腔粘连 （IUA） 靶 向 治 疗 提 供 依 据 。 方法：体外培养正常 HESCs，分为对照组和转化生长因子 β1（TGF-β1） 组； 体外培养IUA 患者粘连部分的HESCs， 作为IUA 组。采用Western blotting 法检测TGF- β1 作用不同时间（0、12、24、48 和60 h） 后各组细胞中纤维化标志蛋白Ⅰ 型胶原α1（COL1A1） 蛋白表达水平。采用MTT 实验检测各组细胞增殖活性。采用Western blotting 法检测对照组和IUA 组细胞中细胞COL1A1、间质标志蛋白［N-钙黏蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA） ］以及Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin 表达水平。根据MSAB 浓度， 将正常HESCs 分为0（对照组）、0. 25、0. 50、0. 75 和1. 00 μmol·L-1 MSAB 组， MTT 实验检测各组细胞存活率。MSAB 作用后， 将正常HESCs 分为对照组（正常HESCs）、TGF- β1 组（10 μg·L-1 TGF-β1 诱导正常HESCs 24 h 后撤药，更换为完全养基并继续培养24 h） 和MSAB 组（10 μg·L-1 TGF-β1 诱导正常HESCs 24 h 后撤药， 更换为含0. 75 μmol·L-1 MSAB 的完全培养基并继续培养24 h）。采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR） 法检测各组细胞中上皮-间质转化（EMT） 相关转录因子Snail、Slug、Smuc、ZEB1 和ZEB2 和COL1A1 mRNA 表达水平， 采用Western blotting 法检测各组细胞中COL1A1 蛋白、N-钙黏蛋白、α -SMA 蛋白、β -catenin 和 c-myc 蛋白表达水平。结果：与对照组（TGF-β1 作用0 h） 比较， TGF-β1 组作用12、24、48 和60 h 时HESCs 中COL1A1 蛋白表达水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。与对照组比较，IUA 组和TGF-β1 组HESCs 增殖活性差异无统计学意义（Pgt;0. 05）。与对照组比较，IUA 组HESCs 中COL1A1、β-连环蛋白、N-钙黏蛋白和α-SMA 蛋白表达水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。与对照组比较， 0. 75 和1. 00 μmol·L-1 MSAB 组细胞存活率降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。与对照组比较，TGF-β1 组细胞中Snail、Slug 和COL1A1 mRNA 表达水平升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；与TGF-β1 组比较，MSAB 组细胞中Snail、Slug 和COL1A1 mRNA表达水平降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。与对照组比较，作用24 h 时TGF-β1 组细胞中COL1A1 蛋白、N-钙黏蛋白、α -SMA 蛋白、β -catenin 和c-myc 蛋白表达水平升高（Plt;0. 01）； 与TGF-β1 组比较，MSAB 组细胞中COL1A1 蛋白、N- 钙黏蛋白、α-SMA 蛋白、β -catenin 和c-myc 蛋白表达水平降低（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）。结论：MSAB可抑制体外培养HESCs的纤维化反应，该结果为MASB应用于IUA 靶向治疗提供了理论基础。

［关键词］ 子宫内膜纤维化； 转化生长因子β1； 上皮-间质转化； Asherman 综合征； 宫腔粘连

［中图分类号］ R711 ［文献标志码］ A

Asherman 综合征是由于子宫内膜损伤引起的一种以宫腔粘连（intrauterine adhesion， IUA） 为特征的疾病，主要的临床表现有少经、闭经、不孕和反复自然流产［1］，其基本组织学表现是子宫内膜纤维化［2］。纤维化是对急性或慢性细胞损伤的创伤愈合反应，其特征是细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 的累积［3］。正常伤口愈合受一系列复杂的促纤维化和抗纤维化过程的调节，包括3 个独立、连续和重叠的步骤：止血炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段［2］。在伤口愈合时，肉芽组织中的成纤维细胞被激活，成为肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFs），主要负责合成和沉积ECM 成分，同时也表现出收缩特性； MFs 在肉芽组织的收缩、牵引和成熟中起重要作用［4］。虽然MFs 仅在组织生理反应（如正常伤口愈合） 中短暂出现，但在纤维化疾病中不断积累［5］。促纤维化信号的异常激活导致伤口重塑不良［2］。活化的MFs 是纤维化形成的关键效应细胞［6］，可引起胶原蛋白等ECM 过度沉积而导致组织纤维化［3］。MFs 可通过上皮- 间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT） 来源于上皮细胞。发生EMT 的细胞主要表达间质标志蛋白如N- 钙黏蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）［3］。

研究［7-9］ 显示Wnt/β-连环蛋白（β-catenin） 信号通路已成为一种核心促纤维化途径。在多种已发生纤维化的器官中显示出典型的Wnt/β-catenin 信号激活，纤维化子宫内膜基质细胞中Wnt/β-catenin信号也被激活［10］， 但其内在机制尚不清楚。目前已知3- （4- 甲基苯基磺酰胺基） 苯甲酸甲酯［methyl 3- ｛［（4-methyl- phenyl） sulfonyl］ amino｝benzoate，MSAB］ 是一种Wnt 依赖性细胞的有效选择性抑制剂，可抑制Wnt/β-catenin 信号的激活［11］。本研究观察在转化生长因子β1 （transforminggrowth factor- β1， TGF- β1） 诱导的子宫内膜纤维化中， MSAB 是否通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路对子宫内膜纤维化进程进行调控， 为初步阐明MSAB 在子宫内膜纤维化疾病中的作用提供依据。

1 材料与方法

1. 1 细胞、主要试剂和仪器 正常人子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cells， HESCs）和IUA 患者的HESCs 均由吉林省人民医院中心实验室分离传代保存，前者来源于无子宫内膜粘连女性， 后者来源于宫腔镜下行IUA 分解术的患者。DMEM/F12 购自美国HyClone 公司， 标准胎牛血清购自美国Clark 生物公司，磷酸盐缓冲液、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA、TransZol Up和TransScript® miRNA First-Strand cDNASynthesis SuperMix 均购自北京全式金生物技术有限公司，TGF-β1 购自北京翘神州科技股份有限公司，MSAB 购自美国MedChemExpress 公司，实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitativePCR，RT-qPCR） 反应体系SYBR Green 试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，RT-qPCR 引物序列购自苏州金唯智生物科技公司，GAPDH 抗体购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司，Ⅰ型胶原α1（type Ⅰ collagen α1， COL1A1） 抗体、N-钙黏蛋白抗体、α-SMA 抗体和β-catenin 抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司， c-myc 抗体购自安诺伦（北京） 生物科技有限公司， 甘氨酸和TrisBase 均购自美国苏州瑞诺德生物科技有限公司，甲醇购自北京国药集团化学试剂有限公司，放射免疫沉淀法缓冲液（radioimmunoprecipitation assaybuffer，RIPA） 购自中国上海碧云天生物科技有限公司，脱脂奶粉购自加拿大BioSharp 公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA） 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司， SDS-PAGE制备试剂盒购自深圳达科为生物工程有限公司，PVDF 购自美国Millipore 公司。CO2 恒温培养箱购自美国赛默飞世尔科技公司， 倒置荧光显微镜购自 日 本 Olympus 公 司， RT-qPCR 仪 购 自 美 国Applied Biosystems 公司。

1. 2 纤维化细胞模型制备和细胞分组 采用体外纤维化细胞模型模拟IUA 患者粘连部位的HESCs。将正常HESCs 密度调整至0. 75×105 mL-1， 接种于6 孔细胞培养板， 每孔加入2 mL 培养液， 细胞贴壁后设定为0 h。采用 10 μg·L-1 TGF-β1 处理正常HESCs （TGF-β1 组），0、12、24、48 和60 h 后收集各孔细胞总蛋白，诱导0 h 的细胞设定为正常HESCs （对照组）， 采用Western blotting 法检测2 组细胞中COL1A1 蛋白表达水平。采用10 μg·L-1TGF-β1 处理正常HESCs 0、6、12、24、48 和72 h后，MTT 法检测对照组（正常HESCs）、TGF-β1组（TGF-β1 诱导的正常HESCs） 和IUA 组（宫腔粘连患者粘连部分的HESCs） 细胞增殖活性。以10 μg·L-1 TGF-β1 处理HESCs 12、24、48 和60 h后， 细胞中COL1A1 蛋白表达水平高于处理0 h，各组细胞增殖活性比较差异有统计学意义， 表明TGF- β1 诱导纤维化细胞模型建立成功。采用Western blotting 法检测对照组和IUA 组细胞中细胞COL1A1、间质标志蛋白（N-钙黏蛋白和α-SMA 蛋白） 以及Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin表达水平。后续实验选取10 μg·L-1 TGF-β1 处理正常HESCs 24 h，诱导其纤维化。

采用不同浓度（0、 0. 25、 0. 50、 0. 75 和1. 00 μmol·L-1） MSAB 处理正常HESCs 24 h， 采用MTT 法检测正常HESCs 存活率， 选取的MSAB 浓度为细胞存活率达80%～100% 时使用的MSAB 浓度。 因此后续实验选取 0. 75 μmol·L-1MSAB 处理HESCs 24 h。各组细胞处理方式： 对照组为正常HESCs； TGF- β1 组采用10 μg·L-1TGF-β1 诱导正常HESCs 24 h 后撤药，更换为完全养基并继续培养24 h； MSAB 组采用10 μg·L-1TGF- β1 诱导正常HESCs 24 h 后撤药， 更换为含0. 75 μmol·L-1 MSAB 的完全培养基并继续培养24 h；IUA 组为IUA 患者粘连部位的HESCs。

1. 3 MTT法检测各组细胞增殖活性 取对数生长期HESCs，采用胰蛋白酶-EDTA 消化后，制成单细胞悬液， 以每孔3×103 个细胞的密度接种到96 孔细胞培养板中，置于37 ℃孵箱孵育。细胞贴壁后设置为0 h， 各组细胞分别在0、6、12、24、48 和72 h 进行MTT 实验测定，步骤如下：在需要测量的培养孔中加入20 μL MTT 测定液，每孔充分混匀，37 ℃孵育4～6 h。采用无菌吸管吸出上清液， 每孔加入100 μL 二甲基亚砜， 在室温下置于摇床上低速振荡3～5 min，使结晶充分溶解。于酶标仪490 nm 处检测各孔吸光度（A） 值，以A 值表示各组细胞增殖活性。

1. 4 MTT法检测各组细胞存活率 取对数期正常HESCs，采用胰蛋白酶-EDTA 消化后，制成单细胞悬液， 以每孔8×103 个细胞的密度接种至96 孔细胞培养板， 置于37 ℃孵箱中孵育。分为对照组和不同浓度MSAB 组，细胞贴壁后弃掉原培养液，分别加入含0、0. 25、0. 50、0. 75 和1. 00 μmol·L-1MSAB 的DMEM/F12 培养基， 每组设3 个复孔，分别作用24 h 后进行MTT 实验测定。于酶标仪490 nm 处检测各孔A 值， 计算细胞存活率。细胞存活率= （处理组A 值-空白孔A 值） / （对照组A 值-空白孔A 值） ×100%。

1. 5 RT-qPCR法检测各组细胞中 EMT相关转录因子和 COL1A1 mRNA表达水平 TRIzol法提取对照组、TGF-β1 组和MSAB 组HESCs 中总RNA；RNA 定量后参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录操作，合成 cDNA，将 cDNA 置于 -20 ℃ 储存备用。每组反应体系的体积为20 μL，并设置3 个复孔。采用 SYBR Green 试剂盒检测细胞中 Snail、Slug、Smuc、ZEB1、ZEB2 和COL1A1 mRNA 表达水平，采用 U6 作为内部对照引物。实验重复3 次。引物序列： U6 F 5'-AACGAGACGACGACAGAC-3'， U6 R 5'-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3'； COL1A1 F 5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3'， COL1A1 R 5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'；Snail F 5'-GCGAGCTGCAGGACTCTAAT-3'，Snail R 5'-GCCTCCAAGGAAGAGACTGA-3'； Slug F 5'-CCTGGTTGCTTCAAGGACAC-3'， Slug R 5'-TCCATGCTCTTGCAGCTCTC-3'； Smuc F 5'-GTGAAAACGCACTCCAGC-3'， Smuc R 5'-AGAGCAGGCACCATTGATT-3'； ZEB1 F 5'-TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3'， ZEB1 R 5'-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3'； ZEB2 F 5'-GGAGACGAGTCCAGCTAGTGT-3'， ZEB2 R 5'-CCACTCCACCCTCCCTTATTTC-3'。反应程序：94 ℃预变性5 min； 94 ℃ 变性1 min、55 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸1 min， 循环40 次； 72 ℃、10 min； 4 ℃保存。采用2−ΔΔCt法计算靶基因mRNA 表达水平。

1. 6 Western blotting法检测各组细胞中间质和纤维化标志蛋白及 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平 收集各组细胞，加入RIPA缓冲液提取细胞中总蛋白， BCA 蛋白定量法测定细胞中蛋白浓度。取20 μg 各组细胞总蛋白上样行10% SDSPAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF 上，5% 脱脂奶粉封闭1 h 后， 加入GAPDH （1∶ 1 000）、COL1A1 （1∶ 1 000）、N-钙黏蛋白（1∶ 1 000）、α-SMA （1∶ 1 000）、 β -catenin （1∶ 1 000） 和c-myc （1∶ 1 000） 抗体4 ℃ 孵育过夜。采用TBST 缓冲液洗涤PVDF 膜后，加入辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或抗兔（1∶2 000） 二抗在室温下再孵育2 h。TBST 缓冲液洗涤PVDF 膜3 次后，采用极敏感增强型化学发光试剂试剂盒曝光成像，以GAPDH作为内参蛋白， 采用Image J 软件量化条带强度，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值。

1. 7 统计学分析 采用 SPSS 20. 0统计软件进行统计学分析。采用Shapiro-Wilk 检验对各组数据进行正态性检验，各组细胞增殖活性，细胞存活率，细胞中Snail、Slug、Smuc、ZEB1、ZEB2 和COL1A1 mRNA 表达水平及细胞中COL1A1、N-钙黏蛋白、α-SMA、β-catenin 和c-myc 蛋白表达水平均符合正态分布， 以-x±s 表示， 两组间样本均数比较采用两独立样本t 检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD-t 检验。以Plt;0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 TGF-β1处理不同时间后2组细胞中COL1A1蛋白表达水平 与对照组比较，TGF-β1组诱导正常HESCs 12 h 时细胞中COL1A1 蛋白表达水平升高（Plt;0. 05）； TGF- β1 组诱导正常HESCs 24、48 和60 h 时细胞中COL1A1 蛋白表达水平明显升高（Plt;0. 01）。见图1。

2. 2 各组细胞增殖活性 与对照组比较，不同时间点（0、6、12、24、48 和72 h） IUA 组和TGF-β1组细胞增殖活性差异无统计学意义（Pgt;0. 05）。见表1。

2. 3 不同浓度MSAB作用后各组细胞存活率 与对照组比较， 0. 25、0. 50、0. 75 和1. 00 μmol·L-1MSAB 组细胞存活率呈现逐渐降低趋势； 其中作用24 h 后，0. 75 和1. 00 μmol·L-1 MSAB 组细胞存活率明显降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。见表2。

2. 4 对照组和IUA组细胞中间质和纤维化标志蛋白及 Wnt/β -catenin 信号通路相关蛋白表达水平 与对照组比较， IUA 组细胞中纤维化标志蛋白COL1A1 蛋白表达水平明显升高（Plt;0. 01）； 间质标志蛋白N-钙黏蛋白和α-SMA 蛋白表达水平升高（Plt;0. 05）； Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β -catenin 表达水平也明显升高（Plt;0. 01）。见图2。

2. 5 各组细胞中 EMT 相关转录因子和 COL1A1mRNA表达水平 与对照组比较，TGF-β1组细胞中EMT 相关转录因子Snail mRNA 表达水平升高（Plt;0. 05），Slug mRNA 表达水平明显升高（Plt;0. 01），COL1A1 mRNA 表达水平也明显升高（Plt;0. 01），其余转录因子mRNA 表达水平差异无统计学意义（Pgt;0. 05）；与TGF-β1 组比较，MSAB 组细胞中EMT 相关转录因子Snail mRNA 表达水平降低（Plt;0. 05），Slug mRNA 表达水平降低（Plt;0. 01）， COL1A1 mRNA 表达水平降低（Plt;0. 01），其余转录因子mRNA 表达水平差异无统计学意义（Pgt;0. 05）。见表3。

2. 6 各组细胞中间质和纤维化标志蛋白及 Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平 与对照组比较， TGF- β1 组细胞中纤维化标志蛋白COL1A1、N-钙黏蛋白和α-SMA 蛋白表达水平明显升高（Plt;0. 01）， Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin和c-myc蛋白表达水平也升高（Plt;0. 01）；与TGF-β1组比较，MSAB 组细胞中纤维化标志蛋白COL1A1表达水平明显降低（Plt;0. 01）， 间质标志蛋白N- 钙黏蛋白和α -SMA 蛋白表达水平降低（Plt;0. 05），Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin 和c-myc 蛋白表达水平明显降低（Plt;0. 01）。见图3。

3 讨 论

IUA 是导致不孕的主要原因之一 ［1］。对于有生育要求或者有症状的IUA 需要行宫腔镜手术治疗者， 子宫内膜进一步损伤易导致IUA 复发［12］。术后为预防宫腔再次粘连，常采用雌孕激素周期疗法治疗［13］，其预防IUA 的效果有限。因此，探讨高效预防和治疗IUA 的方法十分重要。

TGF- β1 作为TGF- β 超家族的一员， 在癌症［14］、生理愈合［15］、免疫［16］ 和纤维化［17］ 中有重要的调节作用。在肺纤维化和肝肾纤维化等疾病中已证实TGF-β1 为纤维化的驱动因素［18］。研究［19］显示：在IUA 临床样本和动物模型中均发现TGF-β1高表达。TGF- β1 通过TGF- β1/Smad 信号通路诱导或调控EMT， 是EMT 强有力的诱导因子［17］ 。在细胞实验中，通常采用TGF-β1 构建IUA 细胞模型。CHEONG 等［20］ 研究显示： 2 μg·L-1 TGF- β1处理HESCs 16 h 可以引起细胞中COL1A1 和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF） 的表达水平上调； LIU 等［21］ 研究显示：10 μg·L-1 TGF-β1 处理HESCs 72 h 是建立IUA 细胞模型的最佳条件。本研究结果显示： 10 μg·L-1TGF- β1 处理HESCs 12 h 后细胞中COL1A1 蛋白表达水平升高； 处理24、48 和60 h 后细胞中COL1A1 蛋白表达水平明显升高， 提示HESCs 纤维化模型建立成功。

EMT 分为3 种不同的亚型：1 型参与胚胎发生和器官发育；2 型与伤口愈合、组织再生和器官纤维化有关；3 型与癌症进展相关。IUA 的基本组织学表现是促纤维化信号的异常激活导致上皮细胞通过2 型EMT 转化为MFs［22］，表现为迁移能力、侵袭性和抗凋亡能力增强及ECM 累积［23］。发生EMT 时上皮标志分子E-钙黏蛋白表达水平降低，EMT 间质标志分子如N-钙黏蛋白、波形蛋白和α-SMA 表达水平升高［24］。其中α-SMA 既是间质标志物［3］，又是纤维化标志物［25］。近期研究［7-9］ 显示：除TGF-β1 外， Wnt/β -catenin 信号通路也是促进EMT 的有效介质。TGF- β1 不仅通过经典通路TGF-β1/Smad 信号通路诱导EMT，也可以通过与非经典通路MAPK/ERK 、Hedgehog 、PI3K/Akt和Wnt/ β-catenin 信号通路发生串扰引起EMT，最终导致纤维化标志蛋白的沉积［26-27］。本研究结果显示： 与对照组比较， IUA 组细胞中N-钙黏蛋白、COL1A1 和β-catenin 表达水平升高， 提示IUA 组比对照组更易发生EMT 及COL1A1 沉积， Wnt/β-catenin 信号通路与HESCs 纤维化有关。

Wnt/β-catenin 信号通路不仅在肿瘤疾病中发挥关键作用，在许多非肿瘤疾病中也发挥重要作用，如脱发、色素紊乱、伤口愈合、骨骼疾病、神经退行性疾病和慢性阻塞性肺疾病［28］。Wnt/β-catenin信号通路的过度激活与子宫内膜纤维化也有密切关联，其是促进EMT 的有效介质［10］。Wnt/β-catenin信号通路由EMT 相关转录因子启动， 包括Snail、Slug、Twist、ZEB1 和ZEB2［22，29］ 。HWANG等［11］ 研究显示：MSAB 是Wnt/β-catenin 信号传导的选择性抑制剂，可以选择性抑制Wnt 依赖性细胞中Wnt 信号活性，而对Wnt 非依赖性细胞和正常人细胞几乎无影响。本研究结果显示：TGF-β1 诱导的HESCs 纤维化中， 转录因子Snail、Slug 和COL1A1 mRNA 表达水平升高、N- 钙黏蛋白和COL1A1 蛋白表达水平升高；同时β-catenin 和c-myc蛋白表达水平升高。MSAB抑制TGF-β1诱导HESCs纤维化时， 转录因子Snail、Slug 和COL1A1mRNA 表达水平降低， N-钙黏蛋白和COL1A1 蛋白表达水平降低； Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白（β-catenin 和c-myc） 表达水平降低。

综上所述， MSAB 干预后HESCs 纤维化反应降低， 其作用机制与抑制Wnt/β-catenin 信号通路有关。该结果为IUA 的发生发展提供了理论基础，有助于开发IUA 的新型辅助治疗策略。未来应该在细胞水平和动物水平对MSAB 的机制进行深入研究， 为MSAB 靶向治疗应用至临床及开发IUA的新型辅助治疗策略提供依据。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：王飞娜参与研究设计和论文撰写，于歆悦、臧欢欢和刘霖君参与研究数据的获取和分析，刘磊、林秀英和付建华参与论文修改和审校，米旭光和方艳秋参与研究设计。

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