甲咪唑烟酸降解细菌的筛选与鉴定

摘" " 要：为实现环境污染物的生物治理与资源化利用，以花生连作田土壤中的甲咪唑烟酸降解细菌为研究对象，采用水解圈法和降解能力测定进行筛选，对筛选出的菌株进行形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定。结果表明：本研究共筛选出8株甲咪唑烟酸降解细菌，分别为大山芽孢杆菌（Bacillus gaemokensis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、同温层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）、甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）、侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）和恶臭假单胞（Pseudomomas puida）。其中，芽孢杆菌属占了7株，为所筛选的甲咪唑烟酸降解菌中的优势细菌。大山芽孢杆菌的降解能力最强，降解率达到88.23%。综上，这些菌株为研究微生物降解甲咪唑烟酸提供了菌种资源，为未来开发甲咪唑烟酸微生物降解制剂和修复土壤提供了理论基础。

关键词：甲咪唑烟酸；降解细菌；芽孢杆菌属；筛选；鉴定

中图分类号：TQ450.2" " " " 文献标识码：A" " " " "DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.11.008

Screening and Identification of Imazapic Degrading Bacteria

TANG Lin1， WANG Ziyan1， CHEN Xuedong1， LIU Jiayi1

（1. Luoyang Normal University，College of Life Science， Luoyang， Henan 471934， China）

Abstract：To achieve the biological treatment and resource utilization of environmental pollutants， the imazapic degrading bacteria from peanut continuous cropping soil were selected by hydrolytic circle method and degradation ability measurement. The strains were identified in terms of morphology， physiological and biochemical characteristics and molecular biology. The results showed that 8 imazapic degrading strains were selected， which were identified as Bacillu gaemokensis， Bacillus thuringiensis， Bacillus cereus， Bacillus stratosphericus， Bacillus methylotrophic， Brevibacillus laterosporus and Pseudomonas putidis. The dominant strain of bacteria responsible for imazapic degradation was Bacillus sp.. The degradation ability of B. gaemokensis was the strongest， which the degradation rate reached 88.23%. In conclusion，the aforementioned strains have established a theoretical framework for the study of microbial degradation of imazapic， as well as for developing microbial degradation agents and soil remediation strategies.

Key words： imazapic; degrading bacteria; Bacillus sp.; screening; identification

甲咪唑烟酸是一种发芽前除草剂，通常用于控制威胁花生生长的外来一年生害草[1]，具有高效、广谱的特点，一次用药可以控制农作物整个生长时期的杂草[2]。此除草剂对常见的杂草均有较好的除草效果，因此得到广泛应用。甲咪唑烟酸的除草作用机制，主要通过抑制植物相关合成酶的生成，阻止部分相关氨基酸的生物合成，影响蛋白质的正常合成，干扰相关DNA的合成以及细胞的分裂与生长，最终影响植株的正常生长，导致植株死亡[3]。随着甲咪唑烟酸除草剂的广泛应用，田间杂草得到了有效控制，但也给后茬作物带来了残留风险。河南省花生地面积居全国第一，后茬作物以蔬菜和小麦居多。近年调查发现，甲咪唑烟酸对后茬蔬菜影响较大。据报道，甲咪唑烟酸会对土壤的理化性质产生影响，导致土壤酸化。另外，甲咪唑烟酸在土壤中残留时间可达3年以上，对后茬作物的生长和土壤微生态环境破坏较大。我国一年两季种植区大多采用轮作模式，因此在使用甲咪唑烟酸时需要注意使用剂量及浓度[4-5]。

目前，微生物降解已经成为一项有效治理长效残留除草剂的手段[6]。一些能够有效降解除草剂的微生物菌株逐渐被筛选出来并得以分离鉴定[7]。研究表明，除草剂可通过动植物和微生物的生物作用降解，目前除草剂降解菌以细菌的研究较为深入[8]，主要包括假单胞菌属[9]、芽孢杆菌属[10]、产碱菌属[11]和黄杆菌属[12]等。Wang等[13]发现，咪唑烟酸在未灭菌土壤中的降解速率比在灭菌土壤中的降解速率快2.3～4.4倍，表明土壤微生物在除草剂降解过程中起着至关重要的作用。王学东等[14-15]从长期使用咪唑烟酸的非耕地土壤中分离出2株该除草剂的高效降解菌，分别为荧光假单胞菌Ⅱ型（P. fluorescenes biotypeⅡ）和蜡状芽孢杆菌（B. cereus），其在5 d 内对咪唑烟酸的降解率分别达到89.4%和95.6%。张武[16]从长期施用咪唑乙烟酸的土壤中筛选出2株对咪唑乙烟酸具有较好降解能力的芽孢杆菌，其降解率均在75%以上。金雷[17]从长期受咪唑乙烟酸污染的农田土壤中分离到 1 株咪唑乙烟酸降解菌芽孢杆菌属Bacillus sp. QC-13。甲咪唑烟酸类除草剂降解菌目前报道的仅有蜡样芽孢杆菌和假单胞杆菌，其他种类降解菌尚未见报道。按照国家对农村土壤面源污染的“一控两减三基本”政策，生物降解农药成为研究热点，微生物降解菌在降解除草剂和土壤修复方面应用前景广阔。

本研究从使用过甲咪唑烟酸的花生田土壤中筛选出能够降解甲咪唑烟酸的细菌，并对其进行形态学、生理生化特性和分子生物学的鉴定。本研究旨在筛选能够降解甲咪唑烟酸的细菌，为研究微生物降解甲咪唑烟酸的机制、开发甲咪唑烟酸微生物降解制剂和修复土壤奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试土样

土样采集地为河南省驻马店市和洛阳市等使用过甲咪唑烟酸的花生连作田土壤，其中驻马店地区土样共计8份，洛阳地区土样共计14份。采用五点采样法，土样取样深度为10～20 cm，将每一采集地的土壤样品进行混匀处理，风干、碾碎，过40目筛，4 ℃条件下存储备用。

1.2 供试药品

甲咪唑烟酸标准品（质量分数99%）购自MedChemExpress，HPLC级甲酸和乙腈购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，革兰氏染色试剂盒、细菌生理生化发酵管、琼脂糖、2×Taq mix、50×TAE缓冲液、D2000 plus DNA Ladder和Goldview购自北京索莱宝科技有限公司，上下游引物（27F，1492R）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 甲咪唑烟酸降解细菌的分离纯化

将10 g土壤加入至50 mL含药富集培养基中，其甲咪唑烟酸终浓度为240 mg·L-1，在30 ℃、120 r·min-1条件下，恒温振荡培养1个月，每隔7 d补充含100 mg·L-1 甲咪唑烟酸的富集培养基5 mL。含药富集培养基配方为KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，葡萄糖5 g，NH4Cl 0.5 g，加入蒸馏水定容至1 L，利用磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0[18]。

采用土壤稀释涂布法[19]，取100 μL待测液涂布在肉汤培养基上，于30 ℃条件下培养24～48 h。采用十字交叉法测量透明圈直径，每个处理3次重复，挑取有较大透明圈的菌株，划线纯化后保存待用。

1.4 甲咪唑烟酸降解细菌的降解能力测定

将培养好的纯化菌株，以2%接种量接种至含药基础培养基中，甲咪唑烟酸浓度为100 mg·L-1，设置含药对照和培养基对照，每个处理3次重复。在30 ℃、150 r·min-1条件下，振荡培养7 d[20]。含药基础培养基配方为NaCl 1.0 g，（NH4）2SO4 1.0 g，K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加入蒸馏水定容至1 L， pH值调为7.0。

将10 mL 10 μmol乙酸铵加入样品中，摇匀30 s，以4 000 r·min-1转速离心5 min，用0.2 μm Whatman膜过滤上清液，测定甲咪唑烟酸含量[21]。使用高效液相色谱（Agilent 1220）测定甲咪唑烟酸降解菌株的降解能力。降解率公式如下：

降解率=1-（最终含药量/ 对照含药量）×100%

改良的检测条件参照GB T23818—2009《大豆中咪唑啉酮类除草剂残留量的测定》[22]、Senseman等[23]和Tu等[24]的方法。色谱柱为C18，长度250 mm × 4.6 mm，5 μm；柱温（25±3） ℃；流速1.0 mL·min-1；检测波长250 nm；进样量 10 μL；流动相A： 0.1%甲酸，流动相B：乙腈；保留时间11.5 min。

1.5 形态学鉴定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[25]和《常见细菌鉴定手册》[26]进行形态学鉴定。

1.6 生理生化鉴定

使用革兰氏染色、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、吲哚试验、甲基红试验（M.R.）、乙酰甲基甲醇试验（V-P）、H2S试验、柠檬酸盐试验、葡萄糖发酵试验等对各菌株分别进行生理生化指标测定，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[25]和《常见细菌鉴定手册》[26]进行鉴定。

1.7 16S DNA鉴定

将待测细菌接种于LB培养液中，在30 ℃、150 r·min-1条件下，摇床振荡培养24 h，使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒（DP302）（天根生物科技有限公司）提取细菌DNA，提取方法见说明书，并放入-20 ℃冰箱中保存备用。

采用细菌鉴定通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-ACGGCTACCTTACGACTT-3’）[27]。PCR反应体系为50 μL：27F 1 μL，1492R 1 μL，DNA 1 μL，2×Taq PCR mix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应程序为：预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 40 s，退火52～56 ℃ 1～1.5 min，延伸72 ℃ 3 min，共30个循环，延伸72 ℃ 10 min。PCR产物交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，使用软件MEGA 7.0构建降解菌株的16S rDNA的系统发育树[28]。

2 结果与分析

2.1 甲咪唑烟酸降解细菌的筛选

水解圈试验结果表明（表1），从甲咪唑烟酸土壤中筛选出8株细菌对甲咪唑烟酸有降解作用，水解圈直径大小为0.88～1.42 cm，其中3号菌株和6号菌株的水解圈直径最大，分别为1.42、1.38 cm。8株细菌的降解率范围为68.98%～88.23%，其中3号菌株和6号菌株的降解率显著大于其他菌株，降解率分别为88.23%和85.41%，降解效果较好。方差分析结果表明，菌株之间的水解圈直径差异较小，降解率差异显著。由此可知，液相降解率分析法更能准确地筛选甲咪唑烟酸降解菌。

2.2 形态学鉴定

甲咪唑烟酸降解细菌的菌落形态学特征如表2和图1所示，在菌落形状、表面、边缘、透明度、颜色几个特征上存在差异。甲咪唑烟酸降解细菌的微观形态学特征如表3和图2所示，甲咪唑烟酸降解细菌的微观菌体形态均为杆菌，但菌体大小和能否成链存在差异。

2.3 生理生化特性鉴定

甲咪唑烟酸降解细菌的生理生化特性如表4所示，甲咪唑烟酸降解细菌在过氧化氢酶试验和柠檬酸盐试验中的生理生化特性一致，在革兰氏染色、淀粉水解、吲哚试验、甲基红试验、葡萄糖试验、乙酰甲基甲醇试验和H2S试验的生理生化特性存在差异，特别是革兰氏染色和吲哚试验，菌株的反应存在阴阳性表现。

2.4 分子生物学鉴定

将测序结果与NCBI数据库比对，利用MEGA7.0构建的系统发育树如图3所示，甲咪唑烟酸降解细菌共被划分为7个进化簇，7株属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），1株属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。结合形态学鉴定和生理生化鉴定结果，这8株细菌的聚类结果如表5所示。

3 讨论与结论

3.1 讨论

微生物的数量、活性、对环的适应能力等均可影响微生物对除草剂的降解能力[29-30]。本研究中，8株甲咪唑烟酸降解细菌的降解率均达68%以上，但降解菌的降解能力存在种内和种间差异，这与前人[13-17]研究结果一致。本研究中， 8株甲咪唑烟酸降解细菌中7株属于芽孢杆菌、1株假单胞菌，甲咪唑烟酸降解菌种类筛选结果也与前人[13-17]研究结果一致。由此可见，芽孢杆菌是降解甲咪唑烟酸的优势菌。雒晓芳等[31]和刘艳等[32]研究表明，苏云金芽孢杆菌和恶臭假单胞菌对多种农药均有降解作用。原晨虹[33]，杨亚男[34]和陈琳等[35]报道，侧孢短芽孢杆菌（B. laterosporus）、同温层芽孢杆菌（B. stratosphericus）和甲基营养芽孢杆菌（B. methylotrophicus）对植物病害有防治效果。周敏[36]研究表明，大山芽孢杆菌（B. gaemokensis）对亚硝酸盐有降解作用。但未见上述报道的几种细菌对甲咪唑烟酸有降解作用。本研究发现，侧孢短芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌和甲基营养芽孢杆菌对甲咪唑烟酸均具有降解能力，与前人[13-17]报道的降解菌株种类有所不同，这可能与样品采集地域和生境有关。上述菌株的发现，丰富了甲咪唑烟酸生物降解的种类，为甲咪唑烟酸生物降解提供了参考，也为今后甲咪唑烟酸生物降解的研究拓宽了思路。另外，关于甲咪唑烟酸降解微生物的研究较少，目前的报道主要集中于对细菌降解菌的研究，而真菌和放线菌降解菌的研究鲜见报道。本研究缺乏真菌和放线菌降解菌的筛选，今后还需进一步拓宽降解菌的筛选范围。甲咪唑烟酸降解菌的研究目前还处于起步阶段，距离应用还有较大的距离，在今后的研究中还需在菌株筛选、降解机制、发酵工艺优化、制剂开发等方面进行深入研究。另外，未来研究还可以利用基因工程技术来构建多种高效的降解菌株应用于降解土壤农药残留，达到降低土壤农药污染的作用[37]，从而加快甲咪唑烟酸微生物降解制剂的研发，利用微生物来修复土壤环境，减少农业生产中药物残留对农作物及环境的危害。

3.2 结论

本研究从施用甲咪唑烟酸的花生连作田土壤中共筛选出8株对甲咪唑烟酸具有降解能力的细菌，降解率范围为68.98%～88.23%。经形态观察、生理生化特性测定、分子生物学方法鉴定，8株细菌被鉴定为蜡样芽胞杆菌（B. cereus）、大山芽孢杆菌（B. gaemokensis）、侧孢短芽孢杆菌（B. laterosporus）、甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）、同温层芽孢杆菌（B. stratosphericus）、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）和恶臭假单胞菌（P. puida），并以芽孢杆菌属为优势种群，其中大山芽孢杆菌（B. gaemokensis）对甲咪唑烟酸的降解能力最强。本研究关于大山芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和恶臭假单胞菌对甲咪唑烟酸降解的能力为首次报道，为后续研究甲咪唑烟酸降解菌资源多样性和应用功能性奠定了理论基础。另外，微生物降解甲咪唑烟酸的机制、微生物降解制剂的开发、甲咪唑烟酸降解菌株在土壤修复中的应用还有待进一步研究。

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