黄瓜霜霉病菌侵染黄瓜叶片染色方法的筛选及应用

摘" " 要：黄瓜霜霉病是黄瓜生产中常见的真菌病害，其危害严重，为了快速准确地识别黄瓜叶片中黄瓜霜霉病菌，提高病害诊断的准确性和及时性，本研究比较了考马斯亮蓝R-250染液、考马斯亮蓝G-250染液、台盼蓝染色液、甲基蓝染色液、乳酸酚棉蓝染色液5种染色方法对黄瓜霜霉病菌不同侵染阶段的原位观察染色效果。结果显示，考马斯亮蓝G-250染液在20 min内完成染色，不易给黄瓜组织染色，易洗去浮色，在对黄瓜霜霉病菌的染色观察中更稳定，能较好地观察到黄瓜霜霉菌各时期形态特征。综上，本研究建立了一种着色效果好、试验方法简单的黄瓜叶片中黄瓜霜霉病菌的染色方法，为观察黄瓜霜霉病菌的侵染结构提供了技术方法，为黄瓜霜霉病的预测预报提供了理论依据。

关键词：黄瓜霜霉病菌；染色方法；组织透明；原位观察

中图分类号：S432.4" " " " " 文献标识码：A" " " " "DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2024.11.006

Screening and Application of Stains for Cucumber Leaves Infected by Cucumber Downy Mildew Pathogen

LI Yaqi1， WANG Yong2， YANG Lijuan2， ZENG Wenjia1， LIU Huiqin1， GAO Wei2

（1. College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300381， China; 2. Plant protection research institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China）

Abstract：Cucumber downy mildew is a prevalent fungal disease in cucumber production with severe impacts. To rapidly and accurately identify the downy mildew pathogen on cucumber leaves and enhance the precision and timeliness of disease diagnosis， this study compared the in-situ staining effects of five staining methods—Coomassie Brilliant Blue R-250， Coomassie Brilliant Blue G-250， Trypan Blue， Methyl Blue， and Lactophenol Cotton Blue—on different infection stages of the cucumber downy mildew pathogen. The results indicated that Coomassie Brilliant Blue G-250 completed staining within 20 minutes， did not readily stain cucumber tissue， and allowed easy removal of excess dye. It demonstrated greater stability in staining observations of cucumber downy mildew， providing better visualization of morphological characteristics at various stages of the pathogen. In conclusion， this study established a staining method for cucumber downy mildew pathogen in cucumber leaves that offers excellent staining effects and a simplified experimental procedure. It provides a technical approach for observing the infection structures of cucumber downy mildew and theoretical support for forecasting and early warning of the disease.

Key words： cucumber downy mildew pathogen ; staining method ; tissue clearing ; in situ observation

黄瓜霜霉病是农业生产中常见的真菌病害，是一种由古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis Berk.amp; Curt.）侵染所引起的世界性病害，黄瓜霜霉病菌是典型的专性寄生菌，只存活于田间或室内的活体寄主上[1-3]，属于单年流行病害[4]。保护地栽培是我国黄瓜种植的主要方式，其密闭性和黄瓜连茬种植的周期性，为黄瓜霜霉病的发生、流行等提供了有利条件[5-7]。黄瓜霜霉病菌主要靠气流传播，也可通过风雨、农器具、昆虫等传播[8-9]，发病严重时，1周内黄瓜全部枯死，造成绝产。

黄瓜霜霉病主要以化学防治为主，但该病原菌极易产生抗药性，病害传播扩散快，一旦发生难以有效防控，并且大量使用农药极易造成严重的环境污染及农残超标等危害[10]。建立黄瓜霜霉病监测预警系统，在黄瓜霜霉病发生前及时进行有效预防，是控制黄瓜霜霉病发生的有效措施[11-12]。依据黄瓜生长温湿度条件与病害发生间的关系建立的病害发生预测模型，因为只单一考虑环境因素建模，所以在病害的预测中会有较大误差[13-14]。而依据病害症状的计算机视觉识别技术只能在病害发生后进行判别，不能达到早期监测和提前防治病害的作用[15-16]。因此，明确黄瓜霜霉病菌侵染后，黄瓜叶片组织内部显微结构变化，准确描述病害侵染时间序列过程，可为建立更精确的黄瓜霜霉病菌监测预警模型奠定基础。

探索并优化真菌染色技术，对于精确观察植物组织内部真菌的显微结构特征及其与寄主组织相互作用的侵染动态具有至关重要作用[17]。关于黄瓜霜霉病的研究报道，主要集中在病原菌生物学特性、基因表达调控、防治药剂筛选等方面，对黄瓜霜霉病菌不同发病阶段的叶片组织染色效果进行比较的报道较少。朱书生等[18]研究发现，Calcofluor、苯胺蓝、荧光素钠3种荧光染色方法在合适的染液浓度和pH值条件下，均可对孢子囊、休止孢、芽管、孢囊梗等寄主组织外部菌体进行原位染色，曲利苯兰组织透明染色法能观察黄瓜霜霉病菌的整个生长发育阶段，但该方法更适用于胞间菌丝及吸器的染色。为了清晰快捷地找出黄瓜霜霉病菌形态，不同染色方法的选择和应用备受关注。前人的报道中，通常选用考马斯亮蓝、台盼蓝、甲基蓝等染色液进行病原菌染色观察，因此，本研究比较了考马斯亮蓝R-250染液、考马斯亮蓝G-250染液、台盼蓝染色液、甲基蓝染色液、乳酸酚棉蓝染色液5种染色方法应用于叶片组织内黄瓜霜霉病不同发病阶段的观察效果，以便筛选出准确、快速、适合不同发育阶段的染色方法，为黄瓜霜霉病菌的形态鉴定提供依据，同时为研究黄瓜霜霉病的发生规律和早期监测预警提供理论支持，为开展有效防治及杀菌剂的作用机理研究提供有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试品种 感病黄瓜品种长春密刺，天津市农业科学院植物保护研究所种苗病害室保存，长春密刺品种特征为抗枯萎病，不抗霜霉病，耐寒性较强，喜肥。

1.1.2 供试黄瓜霜霉病菌 黄瓜霜霉病发病叶片，采自天津市农业科学院植物保护研究所武清区创新基地（116.97°E，39.43°N）。

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜霜霉病菌孢子悬浮液的制备 采摘发病的黄瓜霜霉病叶片后，用无菌水冲洗干净叶片上老熟的孢子囊和浮尘，沥干水分至拿起叶片不再有水滴落。将处理好的叶片装入自封袋中，放于25 ℃人工气候箱中，黑暗高湿的条件下培养24 h，保证有新的黄瓜霜霉病菌孢子囊长出。取出叶片，挑选长出新鲜霉层的叶片，用小毛刷将霉层刷到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，配置成孢子囊悬浮液，浓度为40×倍光学显微镜下观察到20～25个孢子囊。

1.2.2 黄瓜霜霉病病原菌接种 将长春密刺黄瓜种子在水中浸泡4～6 h，置于铺有1层滤纸和2层纱布的发芽盒中，将水沥干，上面再覆1层纱布，遮光处理，置于25 ℃培养箱过夜。发芽后，播种在育苗盘中，待两叶一心时，将上述配置好的孢子囊悬浮液均匀喷雾到黄瓜叶片上，放于变温培养箱中，先在20 ℃条件下培养12 h，再在25 ℃条件下培养12 h，使用加湿器保湿，分别于接种0、4、6、12、24、36、48、60、72 h后取黄瓜叶片，打成6 mm叶盘脱色观察。

1.2.3 染色剂筛选 在烧杯中将无水乙醇和冰醋酸1∶1混合均匀，分装于24孔细胞培养板中，每孔2 mL混合液。将6 mm 叶盘放置在盛有等量的酒精（95 %）和冰醋酸混合液的24孔细胞培养板中固定24 h ，然后置于饱和的水合三氯乙醛溶液中（1～3 h），待叶片组织透明后取出，用无菌蒸馏水冲洗表面残留液体，分别放入考马斯亮蓝R-250染液、考马斯亮蓝G-250染液、台盼蓝染色液、甲基蓝染色液、乳酸酚棉蓝染色液5种染色液中进行染色处理，观察黄瓜霜霉病菌染色效果。各处理设置如下：处理1，将叶盘置于考马斯亮蓝R-250染液中进行染色观察，染色时间为20 min，染色结束后，将染色后的叶片置于无菌蒸馏水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作为浮载剂，光学显微镜观察；处理2，将叶盘置于考马斯亮蓝G-250染液中进行染色观察，染色时间为20 min，染色结束后，将染色后的叶片置于无菌蒸馏水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作为浮载剂，光学显微镜观察；处理3，将叶盘置于甲基蓝染色液中进行染色观察，染色时间为20 min，染色结束后，将染色后的叶片置于无菌蒸馏水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作为浮载剂，光学显微镜观察；处理4，将叶盘置于台盼蓝染色液中进行染色观察，染色时间为1 h，染色结束后，将染色后的叶片置于无菌蒸馏水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作为浮载剂，光学显微镜观察；处理5，将叶盘置于乳酸酚棉蓝染色液中进行染色观察，染色时间为20 min，染色结束后，将染色后的叶片置于无菌蒸馏水中漂洗，洗去表面浮色后，以水作为浮载剂，光学显微镜观察。

1.2.4 染色剂不同染色时间效果观察 选择考马斯亮蓝G-250作为最优染色剂，设置染色时长为10、20、30、40 min，染色结束后，将染色后的叶片置于无菌蒸馏水中漂洗，洗去表面浮色后，以水做浮载剂，光学显微镜观察。

1.2.5 考马斯亮蓝G-250对黄瓜霜霉病菌发育过程的观察 选择考马斯亮蓝G-250作为最优染色剂，设置染色时长为 20 min，对黄瓜霜霉病菌侵染叶片的发育过程进行观察。

2 结果与分析

2.1 染色剂筛选

2.1.1 考马斯亮蓝R-250染液染色观察 考马斯亮蓝R-250染液通常用于SDS-PAGE电泳中微量蛋白质的染色[19]，本研究将其应用于黄瓜霜霉病菌的染色观察。在对黄瓜霜霉病菌染色中，考马斯亮蓝R-250染液染色较快，可在20 min内着色，染色后的黄瓜霜霉病菌呈蓝色，0～4 h可观察到芽管，4～6 h芽管伸长形成侵染菌丝，6～8 h侵染菌丝继续生长形成分生孢子梗。各时间均可观察到被染成蓝色的叶片组织，说明考马斯亮蓝R-250染液在原位观察黄瓜霜霉病菌时，易将黄瓜叶片组织染色且不易洗去，在光学显微镜中观察时，背景色较复杂但能明显区分黄瓜霜霉病菌各阶段，芽管、侵染菌丝时期清晰可见，分生孢子梗时期边缘不易着色（图1）。

2.1.2 考马斯亮蓝G-250染液染色观察 考马斯亮蓝G-250染液通常用于SDS-PAGE电泳中微量蛋白质的染色[19]，本研究将其应用于黄瓜霜霉病菌的染色中。考马斯亮蓝G-250染液可在20 min内着色，并且着色效果优于考马斯亮蓝R-250染液。应用考马斯亮蓝G-250染液对黄瓜霜霉病菌染色后，0～4 h观察到芽管，4～6 h芽管伸长形成侵染菌丝，6～8 h侵染菌丝继续生长形成分生孢子梗。染色后的菌丝呈蓝绿色，并且染色后黄瓜叶片组织易洗去浮色几乎不被染色，染色后能够清晰地观察到芽管、侵染菌丝、分生孢子梗等（图2）。

2.1.3 台盼蓝染色液染色观察 台盼蓝染色液染色时间较长，可在1 h内使黄瓜霜霉病菌着色，染色后的菌丝呈蓝色，0～4 h可观察到芽管，4～6 h芽管伸长形成侵染菌丝，6～8 h侵染菌丝继续生长形成分生孢子梗。染色后的黄瓜叶片组织常表现出染色不均，黄瓜叶片组织易被染色且不易洗去浮色，在光学显微镜中观察时，背景色复杂不易观察，黄瓜叶片上的叶毛也易被染色，但使用台盼蓝染色液染色后黄瓜霜霉病菌各时期均可被染色观察，但相比于其他染液，染色时间较长，染色效果不理想（图3）。

2.1.4 甲基蓝染色液染色观察 甲基蓝染色液也可在20 min内着色，染色后的黄瓜霜霉病菌呈深蓝色，在显微镜下清晰可见，染色后有助于观察和分析菌丝的形态结构。使用甲基蓝染液染色后，0～4 h可观察到芽管，4～6 h芽管伸长形成侵染菌丝，6～8 h侵染菌丝继续生长形成分生孢子梗。但甲基蓝染色液染色均匀性差，和台盼蓝染色液类似，染色后黄瓜叶片组织背景颜色复杂，染色增加，黄瓜叶片组织易被染色且不易洗去浮色，但黄瓜霜霉病菌各时期均可被染色（图4）。

2.1.5 乳酸酚棉蓝染色液染色观察 乳酸酚棉蓝染色液染液也可在20 min内着色，染色后的菌丝呈蓝色。使用乳酸酚棉蓝染色液染色后，0～4 h可观察到芽管，4～6 h芽管伸长形成侵染菌丝，6～8 h侵染菌丝继续生长形成分生孢子梗。乳酸酚棉蓝染色液可使黄瓜霜霉病菌形态保持较好，不发生变形，但黄瓜叶片组织易被染色且不易洗去浮色，黄瓜霜霉病菌菌丝初期可着色，但随着菌丝生长，出现染色不均匀的现象，随着染色时间的增长，背景色增加，更不易于观察（图5）。

2.2 考马斯亮蓝G-250不同染色时间观察

使用考马斯亮蓝G-250对黄瓜霜霉病发病叶片进行不同染色时间观察发现，染色时间为10 min时，叶片表面开始呈现微弱的蓝色，但病菌侵染区域与正常区域的对比度不明显。部分细胞结构模糊，难以清晰分辨。染色时间为20 min时，叶片整体呈现均匀的蓝色，病菌侵染区域与正常区域的界限清晰可辨。细胞结构清晰，能够观察到病菌菌丝和孢子。染色时间为30 min时，染色效果与20 min相似，但蓝色更深，部分细胞结构因染色过深而显得模糊。染色时间为40 min时，叶片整体颜色过深，导致细胞结构难以清晰观察。病菌侵染区域与正常区域的对比度虽然存在，但染色过深，影响了对细节结构的观察（图6）。

2.3 考马斯亮蓝G-250在黄瓜霜霉病菌侵染黄瓜叶片上的应用

黄瓜霜霉病菌接种到黄瓜叶片上后，相对湿度95 %以上，25 ℃条件下培养2 h，其孢子囊释放孢子在叶片气孔上形成休止孢，一段时间后，休止孢进入气孔，开始生长发育，形成芽管（图7-A），芽管继续生长，形成侵染菌丝（图7-B），侵染菌丝生长发育（图7-C），形成孢囊梗（图7-D），后期孢囊梗顶端产生双叉状分支，产生椭圆形或卵型孢子囊（图7-E），孢子囊成熟后脱落（图7-F），形成乳突释放孢子。

3 讨论与结论

3.1 讨论

朱书生等[18]提出，考马斯亮蓝R-250染液在对黄瓜霜霉病菌进行染色观察时比较模糊，不能使黄瓜叶片底色脱色彻底，称该脱色方法方法更适用于单子叶植物染色观察。本试验中，选择用冰醋酸与无水乙醇1∶1混合液固定叶片，用饱和水合氯醛对固定好的叶片进行透明处理，使用染色液对黄瓜霜霉病菌染色能达到较好的染色效果。李健强等[20]和李映霞[21]利用考马斯亮蓝组织染色法对小麦白粉病菌进行病原菌在组织内侵染过程的染色观察时，观察到菌丝体伸入到寄主组织中产生吸器以及小麦寄主组织结构产生乳突和过敏细胞反应。而本试验使用考马斯亮蓝对黄瓜霜霉病菌染色时，未观察到吸器的产生及寄主组织结构产生乳突和过敏细胞反应，这可能与病原菌不同以及寄主材料差异有关。本研究通过使用无水乙醇和冰醋酸1∶1混合液以及饱和水合氯醛对黄瓜叶片组织透明后，采用考马斯亮蓝R-250染液、考马斯亮蓝G-250染液、台盼蓝染色液、甲基蓝染色液、乳酸酚棉蓝染色液5种染色方法对黄瓜霜霉病菌在黄瓜叶片上的侵染过程进行观察比较，结果发现，以上5种染色方法均可对黄瓜霜霉病菌的芽管、侵染菌丝、分生孢子梗等寄主组织外部菌体进行原位染色。从染色时间上看，考马斯亮蓝R-250染液、考马斯亮蓝G-250染液、甲基蓝染色液、乳酸酚棉蓝染色液均可在20 min内着色，染色时间短，大大节省了试验时间。而台盼蓝染色液需在1 h内完成染色，并且染色效果不稳定。从染色效果上看，考马斯亮蓝R-250染液、甲基蓝染色液、台盼蓝染色液、乳酸酚棉蓝染色液均存在染色后黄瓜叶片组织着色的问题。其中，考马斯亮蓝R-250染液、甲基蓝染色液、台盼蓝染色液对黄瓜叶片组织着色较重，在光学显微镜观察过程中，需要多次调整，乳酸酚棉蓝染色液则不易对菌丝着色，在对黄瓜霜霉病的染色中常表现出菌丝染色不均匀的现象。而考马斯亮蓝G-250染液可以在20 min内着色，也可洗去浮色，对黄瓜霜霉病菌染色过程中，其染色效果较好，是一种很好的染色剂。因此，本研究选择考马斯亮蓝G-250染液进行不同染色时间筛选，染色时间为20 min时，可以清晰地观察到黄瓜霜霉病菌的结构，染色时间过长或过短都不利于显微观察。

3.2 结论

本研究通过对黄瓜霜霉病病原菌在黄瓜叶片上的原位染色观察，可以较好地观察到黄瓜霜霉病菌在寄主内的生长发育过程、黄瓜霜霉病菌在寄主内的侵染过程。黄瓜霜霉病菌作为一种专性寄生真菌，最好的观察方法就是叶片原位观察。通过对不同染色方法的观察比较，建立了一种着色效果好、简便易行、经济有效的黄瓜叶片中黄瓜霜霉病菌的染色方法，进一步明确了黄瓜霜霉病菌的侵染结构。考马斯亮蓝G-250染液可以方便、快捷、准确地进行黄瓜霜霉病菌不同生长发育阶段的特征观察以及杀菌剂对其不同发育阶段影响的观察，为研究病害发生发展规律及防治提供有效的手段，对黄瓜霜霉病的组织病理学及流行病理学研究具有重要意义，为该病害早期的监测预警提供了科学方法。

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