万寿菊花瓣叶黄素含量与颜色系数的相关性分析

摘要 为建立一种快速测定万寿菊（Tagetes erecta）花瓣叶黄素含量的方法，利用色差仪测得万寿菊花瓣的亮度值L*、红绿值a*、黄蓝值b*，并计算a*/b*、（a*/b*）2、色度值、色调值和色光值等颜色系数，同时采用紫外-可见分光光度法结合HPLC 法测定花瓣叶黄素含量，分析叶黄素含量与这些颜色系数的相关性，建立回归方程并进行验证。结果显示，万寿菊花瓣叶黄素含量与a*、a*/b*、（a*/b*）2、色调值和色光值极显著相关；用三次函数模型构建的万寿菊叶黄素含量与a*值之间的回归方程拟合程度最高，且叶黄素含量的预测值与实测值之间差异不显著。结果表明，基于a*值构建的三次函数模型可以快速、无损预测万寿菊花瓣叶黄素含量。

关键词 叶黄素； 万寿菊； 色差仪； 颜色系数； 回归分析

中图分类号 S682.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2024）06-0261-09

叶黄素（lutein）是一种天然色素，属于类胡萝卜素，它不仅具有着色作用［1］，还在保护视觉、预防白内障［2］、治疗心血管疾病［3］、抗氧化［4］和抗癌［5］等方面具有重要功效，已经被广泛应用于医药、保健品、化妆品、食品和饲料添加剂等领域［6］。万寿菊（Tageteserecta）是提取叶黄素的重要原料，其花瓣的叶黄素类（xanthophylls）物质主要包括叶黄素（又名黄体素）和玉米黄质［7-8］，可占总类胡萝卜素含量的88% 以上［9-10］。虽然我国在万寿菊种植、加工和销售等方面取得了快速发展，但在自主知识产权品种研发等方面仍比较落后，培育和选育高叶黄素含量的万寿菊品种是万寿菊产业可持续发展的关键。

目前常用的叶黄素检测方法有高效液相色谱法（HPLC）和紫外-可见分光光度法［11-12］。HPLC 法稳定性强、灵敏性高，能精确检测各种成分在样品中的含量。紫外-可见分光光度法根据被测物质浓度与吸光度成正比来分析色素含量，是一种较为简单的检测方法［13］。但是，HPLC 法和紫外-可见分光光度法均需要进行样本前处理和叶黄素提取步骤，存在试验所需时间长、测试费用较高、操作不便利等缺点［6］。因此，探索研究更简便、快速、无损的万寿菊叶黄素含量检测方法非常重要，而目前关于这方面的研究较少。

色差仪是一种运用国际通用的CIE Lab 颜色空间，通过输出亮度值L*、红绿值a*、黄蓝值b*，直接测量物体表面色度学指标的仪器，具有操作简单、测量速度快、精度较高的优点［14-15］。目前，色差仪被广泛应用于花卉［16］、水果［17］、蔬菜［18］及茶叶［19］等产品颜色的测量。利用色差仪测得的L*、a*、b*值等颜色系数评估色素物质含量的研究也有相关报道。Ameny等［20］研究了马铃薯颜色的L*、a*、b*值与β-胡萝卜素含量的关系；Meiendez-Martinez 等［21］利用L*、a*、b*值评估了不同橙汁颜色和维生素A 活性的相关性；路绪强等［22］建立了西瓜番茄红素含量与果实颜色系数Chroma（色度值）的回归方程。但仍未有利用L*、a*、b*值等颜色系数预测万寿菊花瓣中叶黄素含量的研究报道。

本研究利用色差仪测量万寿菊舌状花花瓣的颜色，通过L*、a*、b*值计算相应的a*/b*、（a*/b*）2、色度值、色调值和色光值等颜色系数，同时利用紫外-可见分光光度法结合HPLC 法测定舌状花花瓣叶黄素含量，分析颜色系数与叶黄素含量的相关性，建立回归方程并进行验证，从而得到一种利用色差仪快速测定万寿菊舌状花花瓣叶黄素含量的方法，为加快万寿菊高叶黄素种质资源检测和优良品种选育提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为商业购买的万寿菊F1杂交种和培育的自交系共16 个基因型（表1，图1）。香草、148、9906、里程碑、6170、6210、丰盛桔色、发现橙色、金盾桔色、9904、贵夫人色素和菊花万寿菊12 个基因型在2022 年7 月中旬播种于72 孔穴盘中，8 月中旬移栽至双色塑料盆中，于华中农业大学花卉基地进行露地栽培（30°28′36.5″N，114°21′59.4″E），常规管理。老印卡、6155、GH、橙玉4 个基因型于2023 年7 月中旬播种，其他栽培管理措施保持一致。

1.2 万寿菊舌状花花瓣叶黄素含量测定

随机摘取盛花期头状花序外轮1～2 层舌状花的花瓣，于−80 ℃超低温冰箱保存备用。使用GenesisSQ super ES-55 型冷冻干燥机（SP Scientific，美国）干燥样品3 d，用SCIENTZ-48 型高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）将干燥后的花瓣样品研磨至颗粒状，叶黄素含量的测定方法参照中国食品添加剂和配料协会团体标准T/CFAA 0005—2021并稍作修改。其中，总叶黄素类物质含量的测定采用紫外-可见分光光度法：采用1/10 000 天平称取0.1～0.2 g 颗粒状花瓣样品于100mL 棕色容量瓶（3 次生物学重复），加入30 mL 萃取剂（正己烷∶丙酮∶甲苯∶无水乙醇=10∶7∶7∶6）和2 mL 含有40% KOH 的甲醇溶液；将容量瓶放在JP-080S 型超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）震荡40 s，然后放入56 ℃水浴锅中皂化20 min；皂化完成后将样品冷却至室温，加入30 mL 正己烷，用10% 无水硫酸钠溶液定容后振摇1 min，于暗处静置1 h 进行色层分离；静置完毕后的上层清液体积即万寿菊总叶黄素类提取液的体积（50 mL）；准确吸取上层清液1 mL 移到25 mL 容量瓶中，用总叶黄素类物质洗脱液（正己烷）定容后摇匀，得到稀释后的万寿菊总叶黄素类物质提取液。将样品溶液置于1 cm比色皿中，用正己烷作空白对照，采用UV-1800 型紫外‐可见分光光度计（岛津，日本）测定样品在474 nm处吸光度值。总叶黄素类物质含量计算公式如式（1）所示：

W0=A×V/（236×m） （1）

式（1）中，W0：总叶黄素类物质含量，g/kg；A：474 nm 时样品吸光度；V：稀释倍数；m：样品质量，g；236：质量浓度为1 g/L 的总叶黄素类物质样液在正己烷中波长474 nm 处的吸收系数。

采用SPD-M20A 型高效液相色谱仪（岛津，日本）检测叶黄素含量占总叶黄素类物质含量的比值。取1 mL上述万寿菊总叶黄素类物质提取液经0.45 μm滤膜过滤后上机检测，固定相为4.6×250 mm 色谱柱（安捷伦，美国），流动相为正己烷∶乙酸乙酯∶异丙醇=73∶27∶1.5，流速为1.5 mL/min，进样量为20 μL，柱温为室温，检测波长为446 nm，检测时间为20 min。叶黄素含量计算公式如式（2）所示：

W=W0×P （2）

式（2）中，W：叶黄素含量，g/kg；W0：总叶黄素类物质含量，g/kg；P：叶黄素峰面积/总叶黄素类物质峰面积。

1.3 万寿菊花瓣L*、a∗、b*值测定

利用SPECTROPHOTOMETER CM-5 型色彩色差仪（KONICA MINOLTA，日本）测量万寿菊舌状花的颜色。待万寿菊进入盛花期（所有小花均盛开），随机选择2 个头状花序，采集外轮1～2 层舌状花的花瓣4 片，取花瓣正面中心点，测得L*、a∗、b*值后取平均值；利用这些值分别计算5 个颜色系数：a*/b*、（a*/b*）2 、色度值（chroma value，CV）、色调值（hue value，HV）和色光值（shade value，SV）。色度值代表所测颜色到亮度轴的垂直距离，色度值越大，彩度越大；色调值反映的是红橙绿蓝紫等颜色类型，180°代表纯绿色，0°代表纯红色；色光值可以反映物质的表面颜色［23-24］。色度值、色调值、色光值计算公式如式（3）～（5）：

CV=（a*2+b*2）½ （3）

HV=tan-1（b*/a*）（a*gt;0，b*gt;0）或180° + tan-1（b*/a*）（a*lt;0，b*gt;0） （4）

SV=2000×a*/L*×（ a*2 + b*2）½ （5）

1.4 数据处理

采用Excel 2022 软件进行数据整理，柱形图绘制；采用SPSS 26.0 软件进行显著性分析、相关性分析、回归分析和t 检验。其中显著性分析采用Duncan’s新复极差法，显著性水平为0.05；相关性分析采用双变量分析、斯皮尔曼（Spearman）相关系数；回归分析模型采用线性、二次、三次和指数函数模型；t 检验采用两样本平均数配对法。

2 结果与分析

2.1 万寿菊花瓣叶黄素含量

采用紫外-可见分光光度法结合HPLC 法测定万寿菊花瓣叶黄素含量，结果如图2 所示。米白色香草的叶黄素含量为0.087 3 g/kg，显著低于其他花色的万寿菊；3 种浅黄色的万寿菊叶黄素含量平均值为0.509 2 g/kg；黄色的万寿菊叶黄素含量平均值为1.635 3 g/kg；桔黄色万寿菊的叶黄素含量为4.277 8～10.091 5 g/kg；桔红色万寿菊的叶黄素含量为13.101 4～24.762 7 g/kg。万寿菊花瓣颜色越深，叶黄素含量越高。

2.2 万寿菊花瓣颜色系数

L*、a∗、b*值等颜色系数可以用于花色的定量描述。L*代表亮度值，L*=0 代表黑色，L*=100 代表白色。米白色香草的L*值最大，为83.83；其次为浅黄色万寿菊，L*值均大于70；黄色、桔黄色和桔红色万寿菊的L*值（59.91～66.21）显著降低。a*值代表红/绿色之间的变化，a*gt;0 表示颜色偏红，a*lt;0 表示颜色偏绿。桔红色的9904、贵夫人色素和菊花万寿菊的a*值均值为25.69，显著高于其他花色的万寿菊；米白色和浅黄色的万寿菊a*值均为负值，表明花色很浅且有绿色成分。b*值反映黄/蓝色程度，正值是黄色，负值是蓝色。米白色的万寿菊b*值为6.93，其他花色万寿菊的花瓣b*值为22.48～38.81。在其他5 个花瓣颜色系数中，随着万寿菊花色由浅至深，a*/b*和（a*/b*）2 值均逐渐升高；各类花色的万寿菊色度值无明显规律性变化；桔红色的万寿菊色调值最小，平均值为0.83，最接近0，即颜色更红，与外观相一致；桔黄、桔红色万寿菊的色光值显著高于其他浅色品种（表2）。

2.3 万寿菊花瓣叶黄素含量与颜色系数的相关性

由表3 可知，万寿菊花瓣叶黄素含量与a*值、a*/b*、（a*/b*）2 和色光值极显著正相关（Plt;0.01），其相关系数分别为0.965、0.989、0.935 和0.944；与色调值存在极显著负相关（Plt;0.01），相关系数为-0.995；与L*值和色度值呈显著相关（Plt;0.05），相关系数分别为-0.685、0.643；而与b* 值之间无显著相关性（Pgt;0.05）。

2.4 万寿菊花瓣叶黄素含量与颜色系数的回归方程

选择相关性极显著的a*值、a*/b*、（a*/b*）2、色调值和色光值分别建立与叶黄素含量的回归方程，结果如表4 所示。在万寿菊花瓣中，a* 值、a*/b*、（a*/b*）2 和色光值与叶黄素含量的线性、二次、三次和指数函数模型拟合程度较好，且与叶黄素含量之间的最佳回归方程均为三次函数，分别为y=0.4917+0.0061x+0.0158x2+0.0004x3 （R2=0.971） 、y=0.5906+3.9629x+8.4610x2+9.4740x3（R2=0.950）、y=0.4618+23.7843x―9.8562x2+8.0052x3 （R2=0.949） 和y=0.5276+5.6148x+2.3259×10-8x2―2.0200×10-13x3（R2=0.948）。

为进一步验证上述4 个三次回归方程预测的准确性，分别测量LYK、6155、CY、GH 这4 种万寿菊花瓣的a*值、a*/b*、（a*/b*）2 和色光值，分别代入回归方程得到相应的叶黄素含量预测值，同时测定花瓣中叶黄素的实际含量。由图3 可知，基于a*值、色光值分别建立的三次回归方程得到的叶黄素含量预测值与实测值较为符合，特别是对于深色万寿菊GH 的叶黄素含量预测。对叶黄素实测值和a*值、色光值模型预测值进行t 检验及总体均数的差异显著性分析，结果如表5 所示：基于a*值、色光值建立的与叶黄素含量之间的回归方程获得的叶黄素预测值与实测值的总体均数之间差异均不显著（Pgt;0.05）；基于a*模型获得的t=0.788 小于基于色光值模型获得的t=1.534；基于a*值模型获得的P=0.448 大于基于色光值模型获得的P=0.223。因此，用三次函数建立的叶黄素含量（y）与a*（x）之间的回归方程得到的万寿菊花瓣叶黄素含量预测值与实测值的符合程度更高，可以快速、有效地预测万寿菊花瓣叶黄素含量。

3 讨论

利用色差仪测得的L*、a*、b*值等颜色系数可以实现颜色表型的数量化描述，且已经广泛用于多种园艺作物的颜色评价和分类，如易小艳等［25］利用色差仪检测了不同处理下柑橘果实的着色变化；Wang等［26］基于L*、a*、b*值对24 个品种的桂花进行了分类；周熠玮等［27］利用色差仪对姜花的杂交后代群体进行了花色检测和分类。本研究中万寿菊花瓣实际颜色与L*、a*、b*值等颜色系数的定义基本一致，且不同花色万寿菊的花瓣颜色系数差异显著，表明颜色系数也可以用于定量描述万寿菊花色表型。

颜色系数的大小与类胡萝卜素和花青素等色素物质的含量相关。前人利用颜色系数预测了番茄果实中的番茄红素含量［28］、橙汁中的类胡萝卜素含量［29］、大白菜和菊花中的花青素含量［30-31］ 等。汪欢笑［32］于北京地区进行了万寿菊表型性状研究，结果显示万寿菊花瓣的叶黄素含量与L*、a*、b*值之间的相关系数分别为―0.779、0.918、―0.258，与本研究的结果一致，表明万寿菊花瓣叶黄素含量和颜色系数之间存在较稳定的相关性，环境因素对其无显著影响。本研究还分析了叶黄素含量与a*/b*、（a*/b*）2、色度值、色调值和色光值等其他颜色系数的相关性，为探究万寿菊叶黄素含量与花瓣颜色的关联性提供了更全面的理论依据。

在建立回归方程预测色素含量方面，国艳梅等［33］利用多个颜色系数分别建立线性回归方程对番茄果实番茄红素进行预测；周蓉等［34］分别建立了红色和橙色番茄果实番茄红素含量与最佳颜色系数间的回归方程；王璐等［24］使用线性、二次、三次函数模型筛选了可用于预测紫色叶用莴苣花青素含量的最佳回归方程。本研究基于筛选得到的与叶黄素含量极显著相关的a*值、a*/b*、（a*/b*）2、色调值和色光值5 个颜色系数构建了多种模型的回归方程，经过检验表明基于a*值和万寿菊叶黄素含量构建的三次回归方程得到的预测值与叶黄素实测值的符合程度最好。此外，本研究中回归方程的建立与验证试验分别在不同年份进行，检验结果的准确性也在一定程度上反映出回归方程适用的广泛性。在实际应用中，针对桔黄和桔红色等深色系的色素万寿菊，可以选择大量的深色万寿菊材料建立回归方程预测叶黄素含量，以进一步提高预测的精准度。

本研究系统地分析了万寿菊花瓣叶黄素含量与L*、a*、b*、a*/b*、（a*/b*）2 、色度值、色调值和色光值等多个颜色系数的相关性，建立了万寿菊花瓣叶黄素含量与a*值之间的最佳回归方程，即y=0.4917+0.0061x+0.0158x2+0.0004x3，为简便、快速、无损、有效地检测万寿菊花瓣叶黄素含量提供了新思路。

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（责任编辑：葛晓霞）

基金项目：中央引导地方科技发展资金项目（YDZX20214400003224）