罂粟STORR基因表达分析及载体构建

摘要：为创新罂粟种质资源，加快单一生物碱种质资源的创制。本文通过对罂粟生物碱合成途径的STORR基因表达模式进行分析，并利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑载体，为创制单一生物碱种质资源奠定基础。

关键词：罂粟；STORR基因；表达分析；载体构建

罂粟是一年生或多年生草本植物，其所含生物碱约100种，目前分离鉴定的有20余种，其中吗啡、可待因、蒂巴因、那可丁、罂粟碱五种生物碱为罂粟主要的生物碱，而不同罂粟资源的生物碱含量存在显著差异。2018年叶凯团队通过全基因组测序，明确了罂粟中吗啡、可待因等生物碱合成途径，为深入研究罂粟生物碱合成机制奠定了基础。

吗啡是异喹啉类生物碱，是罂粟中含量最多的生物碱。研究发现，罂粟中各类生物碱合成代谢较为复杂，特别是BIAs生物碱合成过程[1]。吗啡的生物合成需经多步反应，蒂巴因、可待因是吗啡合成途径中的中间产物，且罂粟生物碱合成分支路径（图1）表明，细胞色素P450单加氧酶和醛-酮还原酶的融合蛋白（STORR）是罂粟中吗啡、可待因等生物碱代谢途径的关键蛋白，调控STORR基因在代谢途径上的表达，可引起吗啡、可待因和蒂巴因含量发生改变。Guo等[2]、Yang等[3]通过研究罂粟全基因组重复，BIAs代谢途径及吗啡合成通路中的可待因酮还原酶（COR）、可待因3-O-去甲基化酶（CODM）和6-O-去甲基化酶（T6ODM）三个关键酶在罂粟基因组中的重复、位置和序列一致性，以及BIA基因簇的全基因组重复事件，进一步证实了STORR基因融合在罂粟生物碱合成中的关键作用。

CRISP/Cas9基因编辑技术是目前基因功能研究和遗传疾病治疗等生命科学领域最前沿的基因编辑技术，广泛应用于植物现代生物技术中，相比于传统育种，其耗时短，工作量小的特点，极大地缩短了新品种选育的时间与进程，为植物基因功能研究及定向育种提供了方法，是植物遗传改良中的有效技术手段。2016年，Alagoz Y等[4]利用CRISPR-SpCas9技术敲除了罂粟中的4’OMT2基因，使吗啡、蒂巴因等苄基异喹啉生物碱含量显著降低，表明CRISPR-SpCas9基因组编辑方法可有效地影响罂粟中代谢物积累水平，为罂粟生物碱代谢调控研究奠定了技术基础。

目前，罂粟中含有吗啡、可待因等多种生物碱，提取成本较高，单一生物碱种质资源缺乏，为加快单一生物碱种质资源创制，本研究拟通过CRISP/Cas9基因编辑技术，定向编辑罂粟STORR基因，为研究单一生物碱种质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用两种罂粟资源种子，代号分别为Z1和G1。挑选颗粒饱满的Z1和G1种子若干，进行田间试验，生长至膨大期进行取样。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取

选取生长良好的Z1和G1罂粟，按照TRIZOL法提取叶片组织的总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA。以提取的总RNA为模板，按照Hiscript®ⅡQ RT

Super Mix for qPCR（+gDNA Wiper）（Vazyme # R223-01）反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA，测定其浓度后稀释，置-20℃保存备用。

1.2.2 罂粟STORR基因表达分析

利用AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix（Vazyme # Q111-02/AA）对罂粟不同品种、不同组织部位进行定量分析。分别提取罂粟Z1和G1的根、茎、叶和蒴果的总RNA，以反转录后得到的cDNA为模板，进行实时荧光定量，STORR基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算，不同罂粟资源中各组织部位的STORR基因的相对表达量差异利用独立样本t检验分析。

1.2.3 罂粟STORR基因引物设计与实时荧光定量

依据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计罂粟STORR基因qPCR引物，STORR-F：5’-ATCAAGTGGAGATGAGCCCG-3’；STORR-R，5’-CCTCAGAACCCAAAACTGCA-3’，进行q-PCR。以Actin为作为内参：Actin-F，5’-TCTCAACCCAAAGGCTAATCG-3’；Actin-R，5’-CCCCAGAATCCAAGACAATACC-3’。实时荧光定量PCR的扩增体系为：AceQ® qPCR SYBR® Green

Master Mix 5μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.6μL，共10μL。扩增程序为：95℃5 min；95℃10s，58℃30s，共 40个循环；95℃15s，60℃1 min，95℃15s；40℃5 min。

1.3 CRISP-CAS9载体构建

1.3.1 gRNA靶点序列设计

参照STORR基因片段，根据靶基因ORF序列及对应DNA序列，以植物组织为模板，分别扩增测序靶基因的mRNA和对应DNA部分序列，确定第一外显子所在区间，利用CRISPR/Cas9靶点设计工具设计靶点序列。按照tRNA策略合成双gRNA靶点表达框。

1.3.2 基因扩增

以合成基因的亚克隆载体为模板，以引物STORR-BsaI-F：5’-GTCGAAGTAGTGATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTAG-3’，STORR-BsaI-R：5’-TTCTAGCTCTAAAACACTGCTCACAACGAGAGTTC-3’进行PCR扩增。扩增体系为：ddH2O 17μL，2×Phanta Ma ×Buffer 25μL，dNTP Mix（10 mM each）1μL，模板DNA 2μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1U/μL）1μL，共50μL。PCR反应程序为：95℃30s；（95℃15s，退火温度45～55℃15s，延伸72℃1 min）×39循环；最后延伸72℃，5 min。

1.3.3 载体构建

用BsaI单酶切pKSE401载体质粒构建载体。酶切反应体系为：3.1 Buffer 5μL，载体质粒3μL，BsaI 1μL，加ddH2O至50μL。将酶切产物纯化后与PCR扩增产物按照Vazyme公司ClonExpress-Ⅱ

One Step Cloning Kit试剂盒进行重组连接反应，重组产物转化大肠杆菌DH5α进行培养，挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时随机挑选1个阳性菌落的扩增产物送测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列，分别为：U626p-F：5’-AAGCTTCGACTTGCCTTCCG-3’，U626P-R：5’-AAGCTTATTGGTTTATCTCA-3’。

1.4 数据分析

数据处理采用WPS Excel 2016和SPSS20统计分析软件进行。

2 结果与分析

2.1 STORR基因组织特异性表达

以膨大期的罂粟根、茎、叶、果为实验材料，利用q-PCR对根、茎、叶、果生物碱合成关键基因牛心果碱差向异构酶（STORR）进行组织特异性分析，结果如图2所示：STORR基因在罂粟不同资源的根、茎、叶、果中均有表达，且茎中STORR基因的表达量最高，叶片中表达量最低。

2.2 不同资源STORR基因的表达分析

由图3可知，不同罂粟资源各组织部位的STORR基因的相对表达量存在显著差异，相对表达量依次为茎〉根〉蒴果〉叶，其中G1茎中的STORR基因较Z1相对表达量平均上调53.07%，根平均上调77.04%。

2.3 罂粟CRISP/Cas9载体构建结果

由图4可知，STORR基因双gRNA合成序列与CRISPR/Cas9载体序列比对结果正确，表明STORR基因CRISPR/Cas9载体构建成功，可用于进行后续基因编辑试验。

3 结论

STORR基因罂粟吗啡、可待因、蒂巴因等生物碱合成的关键基因，调控吗啡等生物碱的生物合成。本试验通过对STORR基因在罂粟不同资源中的表达模式进行研究，结果表明，膨大期时，罂粟STORR基因在茎中的含量显著高于根、叶和蒴果，其次是根，说明罂粟生物碱合成的主要部位是根和茎，通过运输转移至蒴果果壳积累。并且STORR基因作为吗啡、可待因等生物碱合成的上游基因，可调控代谢通路下游COR、CODM和T6ODM等生物碱合成关键基因的表达，进而影响吗啡、可待因、蒂巴因等生物碱的合成及含量。同时，通过构建罂粟STORR基因CRISPR/Cas9基因编辑载体，可以预测能更好地定向敲除罂粟中STORR基因获得转基因植株，进而创制出罂粟单一生物碱新品种，为研究罂粟专一生物碱种质奠定基础。

参考文献

[1] Beaudoin G A W，Facchini P J.Benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in opium poppy[J].Planta，2014，240（1）：19-32.

[2] Guo L，Winzer T，Yang X，et al.The opium poppy genome

and morphinan production[J].Science（New York，N.Y.），2018，362：343-347.

[3] Xiaofei Yang，Shenghan Gao，Li Guo，et al.Three

chromosome-scale Papaver genomes reveal punctuated

patchwork evolution of the morphinan and noscapine biosynthesis

pathway[J].NATURE COMMUNICATIONS，2021，12（1）：6030.

[4] Alagoz Y，Gurkok T，Zhang B，et al.Manipulating the

biosynthesis of bioactive compound alkaloids for next-generation

metabolic engineering in opium poppy using CRISPR-Cas9

genome editing technology[J].Scientific reports，2016，6（1）：1-9.