菟丝子对敌百虫损伤小鼠睾丸间质细胞的缓解作用

摘要：为探讨菟丝子对有机磷农药敌百虫下调小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶P450scc蛋白表达是否具有缓解作用，本试验将30只8周龄Balb/C雄性小鼠随机分为：对照组，敌百虫组，菟丝子组，敌百虫加低、中、高浓度菟丝子组；连续灌胃10 d后，取睾丸组织，用苏木精-伊红（HE）染色、免疫组织化学和Western Blot技术检测敌百虫与菟丝子对小鼠睾丸组织结构和P450scc表达与定位的影响。结果表明：与对照组相比，敌百虫组生精细胞排列混乱，间质细胞数量减少，睾酮合成相关酶P450scc的免疫组化阳性表达减弱（P<0.05），P450scc蛋白表达水平下调（P<0.0001）。菟丝子组比对照组睾丸间质细胞数量多；P450scc阳性表达增强（P<0.0001）；P450scc的蛋白表达水平上调（P<0.0001）。与敌百虫组相比，敌百虫加低、中、高浓度菟丝子组睾丸的

组织形态逐渐趋于对照组；且P450scc的阳性表达也逐渐增强（P<0.01，P<0.0001，P<0.0001）；蛋白表达水平也均被提高（P<0.0001）。说明菟丝子可缓解敌百虫导致的小鼠睾丸间质细胞组织结构的损伤以及睾酮合成相关酶P450scc表达的下调。

关键词：菟丝子；敌百虫；P450scc；睾丸间质；雄性生殖毒性

水果和蔬菜上有机磷农药的残留被认为是导致男性因精子质量降低不育的因素之一[1-2]。其中敌百虫（Trichlorfon，TCF）被广泛用于防治农作物、环境害虫及家畜体内外寄生虫，是兽医中较为常用的有机磷农药[3]。先前的研究表明，有机磷农药损伤雄性生殖可能是损伤了睾丸间质细胞，从而导致睾酮合成

障碍[4-5]。睾酮的合成起始于从胆固醇的侧链上切除6个碳生成孕烯醇酮，该反应由细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（Cytochrome P450 Cholesterol Side Chain Lyase，P450scc，又称 CYP11A1）催化[6-7]。有研究发现，敌百虫会显著抑制P450scc蛋白的表达[8]，P450scc蛋白表达下降会使胆固醇的催化与转运减少，进而导致睾酮合成减少[9]。

菟丝子（Semen Cuscutae）是一种传统中药。现代药理学研究表明，菟丝子总黄酮对生殖系统的调节是通过影响下丘脑-垂体-性腺轴而发挥作用[10]。有研究发现口服含有菟丝子的处方药可以显著增加精子数量和活力[11]。也有研究发现当睾酮水平低于机体正常水平时，菟丝子总黄酮会促进睾丸间质细胞产生睾酮[12]。

本试验通过研究敌百虫和菟丝子对雄性小鼠睾丸组织病理学变化和P450scc蛋白的表达量的影响，揭示敌百虫和菟丝子对雄性生殖性能的作用机制，为敌百虫对人和动物所造成的生殖损伤提供新的理论保障。

1 材料

1.1 试验动物

健康8周龄Balb/C雄性小鼠30只，体重为22～27 g，购自山西省人民医院实验动物饲养中心。

1.2 药品

菟丝子购自北京同仁堂健康药业电子商务有限公司。敌百虫购自南通江山农药化工股份有限公司。

1.3 主要试剂

苏木精购自北京索莱宝科技有限公司。免疫组化试剂盒与DBA显色液购自福州迈新生物技术开发有限公司。兔多克隆抗CYP11A1抗体与Goat Anti-Rabbit IgG均购自北京博奥森生物技术有限公司。β-actin购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.4 主要仪器

生物组织包埋机与生物组织包埋机冷冻台（型号：YD-6 L智能型），浙江省金华市益迪医疗设备厂生产。切片机、摊片机和烤片机，上海徕卡仪器有限公司。电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司。荧光倒置显微镜，德国徕卡显微系统。

2 方法

2.1 菟丝子水提液的制备

称取菟丝子25 g，用蒸馏水清洗3次，然后用350 mL蒸馏水浸泡菟丝子30 min；之后大火加热至沸腾后转为小火再加热30 min，用纱布过滤留上清液；滤渣加150 mL蒸馏水，再次用大火加热至沸腾后转为小火加热30 min，过滤留上清液；合并2次上清液浓缩至100 mL（生药浓度为250 mg·kg-1）[13]。

2.2 试验动物分组与给药

将30只雄鼠置于塑料笼内并保持在标准条件下（光照与黑暗进行12h循环；（25±3）℃；35%～60%相对湿度），并供给维持饲料和水；适应5 d后随机的均分为6组，分别为对照组，敌百虫组（1/10 LD50，45 mg·kg-1），菟丝子组（1 800 mg·kg-1），菟丝子低（900 mg·kg-1）、中（1 800 mg·kg-1）、高（3 600 mg·kg-1）剂量治疗组。给小鼠经口连续灌胃10 d，于每日上午9∶00进行。对照组每日按体重给予等量的生理盐水，敌百虫加菟丝子组先给小鼠灌服敌百虫（1/10 LD50，45 mg·kg-1），1h后灌服相应剂量的菟丝子水提液。

10 d后，二氧化碳安乐死小鼠，取小鼠睾丸组织，部分置于Bouin's固定液中，用于组织形态学观察。部分置于液氮中，用于检测P450scc蛋白的表达。采用免疫组织化学和Western Blot技术检测P450scc在小鼠睾丸中的表达和定位。

2.3 睾丸组织病理学观察

将睾丸在Bouin's固定液中固定24 h。然后将睾丸脱水透明，浸入石蜡中并制成6μm厚的切片。睾丸石蜡切片用苏木精-伊红（HE）染色溶液染色，并在显微镜下观察并分析组织学变化。

2.4 免疫组织化学检测睾丸组织P450scc表达

将制备好的6μm睾丸石蜡切片脱蜡，梯度酒精复水。随后切片在柠檬酸钠抗原修复液（98℃）中浸泡15 min左右。使用免疫组化试剂盒提供的试剂进行免疫组织化学染色，先将切片置于3%H2O2溶液中30 min左右；之后加封闭液，放入烘箱30 min滴加5%牛血清白蛋白稀释的一抗（P450scc，1∶100）50μL，阴性用PBS代替，4℃孵育14 h；孵育完后滴加链霉菌抗生素，烘箱30 min；最后滴加DAB显色液显色。

2.5 Western Blot检测P450scc蛋白表达水平

用含有10μL PMSF的RIPA裂解缓冲液在高通量组织研磨仪中研磨小鼠睾丸5 min（RIPA∶PMSF=

100∶1）。在4℃，11 400 r/min下离心10 min，取上清液；用蛋白质定量试剂盒（BCA法）测定蛋白浓度。加入200μg的蛋白与5×Loading buffer 混匀，用1%SDS调整浓度，沸水浴10 min变性。通过SDS-PAGE分离并电转移到硝酸纤维素（NC）膜上，在室温下用TBST配置的5%的脱脂牛奶封闭2h。之后，将NC膜分别在P450scc（1∶500）、β-actin（1∶2 000）的一抗中孵育，在4℃孵育14h后，用TBST洗涤NC膜，然后放入山羊抗兔IgG（1 000∶2）中孵育2 h。最后将NC膜曝光显色。

2.6 统计分析

所有计算均使用统计学软件GraphPad Prism 8.0进行。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验确定多组间的统计学差异，试验数值为“平均值±标准误”（n=3）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。

3 结果

3.1 菟丝子对敌百虫致小鼠睾丸组织病理学变化的影响

如图1，对照组小鼠睾丸的组织结构正常，曲精小管中支持细胞和各级生精细胞均排列有序，结构清晰，管腔内充满精子，间质细胞均匀地分布在基膜外（图1A）。敌百虫组生精细胞排列紊乱、脱落，生精细胞变性，个别曲精小管管腔中可见脱落的生精细胞，管腔内成熟精子变少。间质细胞较对照组明显减少（图1B）。菟丝子组各级生精细胞排列整齐紧密，且间质细胞明显增多（图1C）。与敌百虫组的组织形态相比，敌百虫加低（图1D）、中（图1E）、高（图1F）浓度菟丝子组睾丸组织形态逐渐趋于对照组。

3.2 菟丝子对敌百虫致小鼠睾丸组织P450scc阳性表达的影响

如图2，免疫组织化学结果表明P450scc主要在睾丸间质细胞中表达。与对照组相比，P450scc表达水平在敌百虫组显著降低（P<0.01），在菟丝子组明显上升（P<0.05）。与敌百虫组相比，敌百虫加低浓度菟丝子组的表达明显升高（P<0.01），中、高浓度菟丝子组的表达极显著升高（P<0.0001）。

3.3 菟丝子对敌百虫致小鼠睾丸组织P450scc蛋白表达的影响

如图3，通过WB检测P450scc的蛋白表达水平。与对照组相比，敌百虫组蛋白表达明显下降（P<0.0001），菟丝子组蛋白的表达显著上升（P<0.0001）。与敌百虫组相比，敌百虫加低、中、高浓度菟丝子组蛋白的表达显著升高（P<0.0001）。

4 讨论

不孕不育症影响了全球约15%的育龄夫妇，其中约半数是由男性因素造成的[14]。精子浓度和活力低被认为是男性不育的主要原因之一[15]，而有机磷农药会引起精子浓度及质量下降[16]，因此有机磷农药引起的生殖毒性一直受到研究人员的密切关注。睾丸间质细胞主要功能为合成睾酮，睾酮具有维持生精的作用。男性生殖的健康与正常的精子发生与睾酮等类固醇激素密切相关[17-18]。为了进一步研究菟丝子缓解敌百虫暴露小鼠生殖损伤的机制，本研究重点关注了睾酮生成相关酶P450scc，P450scc的表达降低会导致胆固醇的催化和转运减少，从而使类固醇激素合成受阻。

有研究发现，小鼠暴露于敌百虫后可使睾丸组织的生精细胞数量减少曲精小管受损[19]，在本研究中45 mg·kg-1（1/10 LD50）敌百虫也会引起生精细胞变性和排列混乱。先前的研究表明，敌百虫暴露后，胆固醇侧链裂解酶P450scc的mRNA及蛋白表达降低[3]，从而导致睾酮合成障碍，这与本研究结果一致，提示45 mg·kg-1（1/10 LD50）敌百虫对睾酮合成途径中的酶有一定的抑制作用。

菟丝子可以促进大鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌[12]。

本研究发现1 800 mg·kg-1菟丝子会使间质细胞数量增多，还可以提高P450scc蛋白的表达。由此可推测，菟丝子对正常小鼠的生殖也有促进作用，可能是通过提升P450scc对胆固醇的催化作用而使睾酮含量升高。

本研究观察到使用菟丝子（1 800 mg·kg-1、3 600 mg·kg-1）对敌百虫（45 mg·kg-1）导致的睾丸结构损伤有明显的缓解作用，生精细胞排列趋于紧密，表明菟丝子可以改善敌百虫引起的睾丸组织结构的病理损伤。暴露于45 mg·kg-1敌百虫的小鼠睾丸P450scc蛋白表达水平在补充菟丝子后显著升高，3 600 mg·kg-1菟丝子缓解作用最为明显。据此推测，敌百虫通过损伤睾丸间质细胞，抑制胆固醇侧链裂解酶P450scc蛋白的表达，导致睾酮合成障碍，使精子密度降低；补充1 800 mg·kg-1和3 600 mg·kg-1的菟丝子可以有效缓解敌百虫对睾丸间质细胞结构的损伤和对P450scc蛋白表达下降的影响。

综上，敌百虫破坏了小鼠睾丸的正常组织结构，下调了类固醇合成相关酶P450scc的表达水平；菟丝子能够使睾丸间质细胞增多，上调P450scc表达水平；菟丝子可以缓解敌百虫引起的睾丸病理变化，并上调P450scc表达水平，其中，3 600 mg·kg-1的作用较好。这提示菟丝子和敌百虫可能均是通过影响睾丸间质细胞和P450scc而对睾酮合成产生影响。

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