利用SSR标记技术检测西瓜种子的遗传纯合度

摘要：为快速高效检测西瓜种子纯度和判定种子真伪，研究对236份西瓜种子进行了DNA快速提取，并设计合成了25对SSR引物，通过PCR扩增与琼脂凝胶电泳技术筛选核心引物，对52份未知纯度西瓜种子进行鉴定。结果表明：筛选的17对核心引物（HY、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5、XG7、XG9、XG10、XG11、XG13、XG14、XG15、XG17、XG19、XG22、XG23）多数多态性好，扩增条带清晰，可用于鉴定西瓜种子或植株的杂合度；利用筛选出的6组核心引物对未知纯度种子进行鉴定，发现其中50份西瓜种子为杂合子，2份西瓜种子纯合度无法鉴定。

关键词：西瓜；SSR标记；纯度鉴定

中图分类号：S651 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）10-0001-05

Detection of Genetic Purity in Watermelon Seeds Based on SSR Markers

ZHOU Chi1，LIN Yan1，2，LI Xin1，ZHANG Qing-zhuang1，RAO Li-qun2，RUAN Wan-hui1

（1. Hunan Vegetable Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology，

Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： This study aims to detect the purity and examine the authenticity of watermelon seeds in a rapid and efficient manner. DNA was extracted from 236 watermelon seed samples， and 25 pairs of SSR primers were designed and synthesized. The core primers were then screened by PCR amplification and agar gel electrophoresis and used to identify 52 watermelon seed samples with unknown genetic purity. The results showed that most of 17 pairs of core primers （HY， XG1， XG2， XG3， XG4， XG5， XG7， XG9， XG10， XG11， XG13， XG14， XG15， XG17， XG19， XG22， and XG23） were polymorphic， with clear amplification bands， and thus can be used to identify the heterozygosity of watermelon seeds or plants. Furthermore， selected six pairs of core primers were used for the identification of seeds with unknown genetic purity， which revealed that 50 watermelon seed samples were heterozygous and 2 samples could not be identified for homozygosity.

Key words： watermelon; SSR markers; identification of genetic purity

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai]

属于葫芦科西瓜属一年生蔓生藤本植物，中国是世界上西瓜生产和消费第一大国[1]。杂种优势在西瓜生产中有着重要的地位，在生产中，杂交种纯度受人工去雄时机、隔离区选择和母本对环境的敏感性等多种因素影响，制种过程很难保证西瓜杂交种子的遗传纯度。然而，使用遗传纯度低的西瓜种子会导致后代性状分离、产量降低和品种遗传退化，直接影响农产品品质及农民收益[2-3]。因此，对杂交F1代种子进行纯度检测和真伪鉴定至关重要[4]。西瓜品种传统鉴定一般采用形态学鉴定法，即DUS（特异性、一致性、稳定性）测试，然而形态学鉴定法易受环境因素影响，特别是在区分近似品种的形态特征时，容易产生人为误差，对鉴定人经验要求较高[5]。

因此，研究一种准确且方便的鉴定纯合度技术尤为重要。

随着农业生物技术的发展，通过分析植物DNA的多态性，在DNA水平上比较品种之间基因组结构与组成的分子鉴定方法越来越受到关注。SSR（Simple sequence repeats）分子标记法具有多态性高、重复性强等优点，广泛应用于分子植物辅助育种和纯度鉴定。SSR分子标记技术不仅可以鉴别纯合子和杂合子，而且操作简便、准确性高，具有较大的应用前景[6]。核心SSR分子标记在我国西瓜遗传多样性分析和杂交种纯度鉴定上的应用已非常广泛。何玉等[7]

利用SSR分子标记技术对西瓜‘W1806’与甜瓜‘M1805’各3个批次及其亲本间的多态性进行引物筛选和种子的纯度鉴定，证明了SSR分子标记法对西瓜的纯度鉴定是可靠的。尤佳琪等[8]筛选的SSR引物适用于‘黑津’和‘申蜜968’杂交种纯度的快速鉴定，并分析比较了各亲本种质SSR引物的多态性表现，构建出亲本材料的遗传特异性DNA指纹图谱。孙波等[9]利用SSR分子标记技术对‘雪龙三号’西瓜品种进行引物筛选和种子纯度鉴定，鉴定结果与大田检测结果吻合率高达99%。程维舜等[10]利用荧光标记SSR技术对西瓜杂交种及其亲本间的扩增谱带多态性进行了引物筛选和种子纯度鉴定，证明SSR标记技术可用于‘武农8号’杂交种纯度室内快速检测。

该研究从236份西瓜种子中提取DNA为模板，参考标准NY/T 2472—2013设计合成25对引物，通过PCR扩增技术，筛选了6组核心引物，用于52份纯合度未知西瓜的纯度鉴定，以期为建立快速准确的西瓜杂合种子遗传纯度检测体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为湖南省蔬菜研究所保存的西瓜种子，共计236份，其中纯合子西瓜种子184份，纯度待测种子52份（表1）。主要试验试剂有2×Taq PCR StarMix、StarMarker D2000、StarStain Red Plus、10×TBE，均购自北京擎科生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5424常温高速离心机（德国艾本德股份公司）；TGyrate迷你涡旋混匀仪[OSE-VX-03，天根生化科技（北京）有限公司]；070-851型PCR仪（德国Biometra公司）；PowerPac Basic电泳仪电源（美国Bio-Rad公司）；Gel-Logic 212 Pro凝胶成像仪（Carestream公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 基因组DNA提取、纯度检测 采用CTAB法提取236份西瓜种子的基因组DNA，采用琼脂糖凝胶电泳方法检测DNA的纯度与完整性，采用NanoDrop法检测DNA浓度。

1.3.2 引物设计 参考标准NY/T 2472—2013设计了25对引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表2。

1.3.3 PCR扩增体系 PCR扩增体系（20 μL）包括：DNA模板2 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，2×Taq PCR StarMix10 μL，加入ddH2O补足至20 μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，54～61℃退火30 s，72℃延伸20 s，30个循环；72℃延伸5 min。PCR产物于4℃条件下保存。对PCR产物进行琼脂凝胶电泳检测，电泳后用凝胶成像仪拍照记录。

1.3.4 核心引物筛选 对236份西瓜DNA样品与25对引物分别进行PCR扩增，观测其电泳条带。在所有引物中寻找能分别扩增2个纯合种西瓜其中1个的引物，再寻找1对2个纯合种西瓜均无条带的引物，将3对符合以上条件的引物组合，对未知纯度的西瓜种子进行筛选。

2 结果与分析

2.1 引物鉴定结果

将25对引物与236份西瓜种子DNA分别进行PCR扩增，引物PCR产物长度见表3。SSR分子标记鉴定中，PCR产物过短容易与引物二聚体混淆，过长则会增加鉴定成本，故后续核心引物筛选试验中剔除HY引物。

由表4可知，XG1可以扩增出所有西瓜种子的DNA样品，XG2、XG3、XG8可扩增出大部分DNA样品且条带清晰明显；XG6、XG12、XG18、XG21电泳具有引物二聚体拖尾现象，故不将其作为核心引物。根据引物的电泳情况，筛选到17对特异性引物（HY、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5、XG7、XG9、XG10、XG11、XG13、XG14、XG15、XG17、XG19、XG22、XG23），大部分多态性好，扩增条带清晰，可用于西瓜种子纯度的鉴定。

2.2 核心引物筛选结果

根据核心引物筛选方法筛选出6组鉴定西瓜种子纯合度的引物组合，由表5可知，52份未知种子中有50份为杂合子，其他2份西瓜种子（47、116）纯合度无法鉴定。扩增检测的部分结果见图1、2。

3 讨论与结论

研究对236份西瓜种子进行DNA快速提取，在236份西瓜材料中，共184份西瓜已知纯合度，52份西瓜纯合度未知。参考标准NY/T 2472—2013设计合成25对引物，根据电泳情况筛选到17对特异性引物（HY、XG1、XG2、XG3、XG4、XG5、XG7、XG9、XG10、XG11、XG13、XG14、XG15、XG17、XG19、XG22、XG23），大部分多态性好，扩增条带清晰，可用于鉴定西瓜种子或植株的杂合度。选择多态性好的引物组成6组核心引物对52份未知纯度西瓜种子进行鉴定，结果显示52份未知纯度种子中有50份西瓜种子为杂合子，2份西瓜种子纯合度无法鉴定。

SSR分子标记技术不仅能鉴定种子是否为纯合子，还能检测杂交种子的“纯度”，即亲本的“纯粹度”。通过SSR分子标记技术筛选的核心引物可鉴定未知纯合度西瓜种子，也可验证已知纯合度的西瓜种子。后期将进行田间验证，以确保所筛选到的SSR分子标记引物鉴定结果可以真实且准确反映西瓜的遗传纯合度。

参考文献：

[1] 孙立新，王晓君，吴敬学，等. 中国西瓜甜瓜生产区域布局变迁及驱动因素研究[J]. 中国农业资源与区划，2023，44（8）：42-51.

[2] 羊杏平，刘广，侯喜林，等 利用RAPD和ISSR 2种分子标记鉴定西瓜杂交种的遗传纯度[J]. 江苏农业学报，2010，26（6）：1313-1318.

[3] 李丽，张力，刘玲，等. SSR标记评价西瓜品种的一致性[J]. 农业生物技术学报，2014，22（5）：590-597.

[4] 刘子记，詹园凤，朱婕，等. 利用SSR标记鉴定西瓜杂交种纯度的研究[J]. 热带作物学报，2016，37（9）：1714-1718.

[5] 马双武，韦小敏，王吉明. 我国西瓜杂交种子纯度鉴定方法综

述[J]. 长江蔬菜，2006（10）：27-30.

[6] 杨会会，李贺威，赵永威，等. 利用多重PCR鉴定西瓜杂交种纯度[J]. 中国瓜菜，2020，33（2）：17-21.

[7] 何玉，杨坤. 利用SSR技术鉴定西瓜甜瓜种子纯度[J]. 中国瓜菜，2020，33（1）：13-17.

[8] 尤佳琪，李超汉，杨红娟，等. 基于SSR标记的西瓜新品种‘黑津’和‘申蜜968’的纯度鉴定[J]. 分子植物育种，2024，22（17）：5648-5656.

[9] 孙波，邹甜，王志伟，等. 利用SSR技术鉴定西瓜品种纯度[J]. 中国瓜菜，2018，31（6）：16-19.

[10] 程维舜，罗茜，洪娟，等. 利用荧光标记SSR鉴定西瓜杂交种的纯度研究[J]. 中国果菜，2020，40（12）：36-41.

（责任编辑：王婷）