复合酵母增香介质发酵雪茄烟叶的工艺优化

摘要：为探究汉逊酵母增香介质与拜耳接合酵母增香介质混合固态发酵对雪茄烟叶香气物质含量的影响，采用气相色谱-质谱联用仪对发酵后雪茄烟叶的香气物质进行定性定量分析。结果表明：对2种酵母增香介质进行拮抗试验发现交叉点无抑菌圈，说明两菌无拮抗效果；对接菌比例、接菌量和烟叶湿度进行工艺优化，发现当接菌比例（汉逊酵母∶拜耳接合酵母）1.1∶1，接菌量19.14%，烟叶湿度31.06%时，香气物质总量为1 200.92 μg/g，比单菌发酵提高了9.31%。其中，叶绿素降解产物、苯丙氨酸降解产物和类胡萝卜素降解产物明显提升。

关键词：汉逊酵母；拜耳接合酵母；增香介质；雪茄烟叶；混菌发酵

中图分类号：TS44+4 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2024）10-0081-06

Optimization of Fermentation Process for Cigar Tobacco Leaves with Composite

Yeast Aroma-Enhancing Medium

DING Jing-yi1，YANG Jin-peng2，YU Jun2，YANG Chun-lei2，CHEN Xiong1，YAO Lan1

（1. School of Life and Health Sciences， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， PRC; 2. Tobacco Research Institute of

Hubei Province， Wuhan 430030， PRC）

Abstract： This study aims to explore the effect of mixed solid-state fermentation of cigar tobacco leaves with Hanseniaspora uvarum aroma-enhancing medium and Zygosaccharomyces bailii aroma-enhancing medium on the aroma components of the product. Gas chromatography-mass spectrometry was employed to qualitatively and quantitatively analyze the aroma components of cigar tobacco leaves after fermentation. The results of the antagonistic experiment on the two yeast species showed no inhibition zone at the intersection， indicating that the two species had no antagonistic effect. The optimization results showed that after fermentation at the Hanseniaspora uvarum： Zygosaccharomyces bailii ratio of 1.1∶1， yeast inoculation amount of 19.14%， and tobacco leaf moisture of 31.06%， the total content of aroma substances reached 1 200.92 μg/g， which was 9.31% higher than that of fermentation with single strains.

Moreover， the products of chlorophyll degradation， phenylalanine degradation， and carotenoid degradation were significantly improved.

Key words： Hanseniaspora uvarum; Zygosaccharomyces bailii; aroma-enhancing medium; cigar tobacco leaves; mixed fermentation

微生物在雪茄烟叶发酵过程中发挥着重要作用，能够改善烟叶的品质，预防霉变，提升烟叶的风味和香气。单个微生物发酵对雪茄烟叶的影响较为单一，因此许多研究者会将不同的微生物混合起来发酵，即混菌发酵[1]。与单菌发酵相比，混菌发酵的产品品质更高[2-6]。王颖等[7]对比了单一菌株和复配菌株发酵后的烟叶化学成分，发现复配菌株发酵后烟叶中石油醚提取物明显增加。杜飞等[8]分别从酒糟和茶叶中筛选出了一株酿酒酵母和一株曲霉菌，混合发酵后其发酵液中醇类、酯类等物质含量增加，烟叶杂气减小，品质明显提升。龙章德等[9]对酿酒酵母与嗜麦芽寡养单胞菌发酵雪茄烟叶的条件进行了优化，发现优化发酵所得的雪茄烟叶总糖、还原糖和石油醚提取物等含量增加，致香成分中类胡萝卜素降解产物与西柏烷类降解产物含量增加，雪茄烟叶香气质量得到提升。该研究利用汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）两种酵母增香介质对固态发酵雪茄烟叶的过程进行优化，探究复合微生物发酵对雪茄烟叶香气总量及香气成分的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雪茄烟叶与烟草花蕾均于2022年在湖北省恩施州采集，烟叶型号为CX-026茄衣。产香酵母菌株为湖北工业大学功能酵母与酿造微生物实验室分离筛选的优质酵母菌株：汉逊酵母和拜耳接合酵母。主要试剂有YPD液体培养基、葡萄糖、异亮氨酸、蛋白胨、无水硫酸钠、氯化钠、二氯甲烷（AR，国药集团化学试剂有限公司）、酵母粉（安琪酵母股份有限公司）、乙酸苯乙酯[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]。

1.2 仪器与设备

主要仪器有电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、HNY-211B恒温培养振荡器（天津市欧诺仪器仪表有限公司）、恒温恒湿箱（天津市欧诺仪器仪表有限公司）、CJ-2D型无菌操作台（天津市泰斯特仪器有限公司）、卤素水分快速测定仪（青岛拓科仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，Agilent 7890A/5975C，安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母种子液的制备 在30℃、200 r/min条件下，分别将汉逊酵母与拜耳接合酵母于YPD液体培养基中活化24 h，再接入新的YPD液体培养基中二代活化12 h得到2种酵母的种子液。

1.3.2 汉逊酵母增香介质和拜耳接合酵母增香介质的制备 将一定量的烟草花蕾烘干磨碎，过60目筛，与去离子水（固液比1∶10）充分接触并搅拌，90℃下水浴2 h，冷却后过滤除渣得到提取液，加入10.12%葡萄糖，115℃高温灭菌20 min，加入0.83%异亮氨酸，过滤除菌，制得烟草花蕾水提液培养基，即增香介质。将2种酵母种子液以3.48%接菌量分别接入烟草花蕾水提液培养基中，在30℃、200 r/min条件下培养12 h得到发酵液，即汉逊酵母增香介质和拜耳接合酵母增香介质。

1.3.3 汉逊酵母与拜耳接合酵母拮抗试验 为了避免雪茄烟叶发酵过程中发生菌种拮抗，影响2种酵母的生长，对汉逊酵母与拜耳接合酵母进行拮抗试验，观察是否会发生排异反应[10]。

1.3.4 雪茄烟叶固态发酵单因素试验 （1）优化接菌比例条件。取100 g雪茄烟叶放入恒温恒湿培养箱，分别考虑接菌比（汉逊酵母∶拜耳接合酵母）为1∶1、1∶2、2∶1，在发酵温度30℃、发酵湿度80%、烟叶湿度30%、接菌量20%条件下发酵6 d，发酵结束后测定雪茄烟叶挥发性香气物质含量。（2）优化接菌量条件。取100 g雪茄烟叶放入恒温恒湿培养箱，在发酵温度30℃、发酵湿度80%、接菌比（汉逊酵母∶拜耳接合酵母）1∶1、烟叶湿度30%条件下，分别取接菌量10%、20%、30%的发酵液喷洒于雪茄烟叶上发酵6 d，发酵结束后测定雪茄烟叶挥发性香气物质含量。（3）优化烟叶湿度条件。取100 g雪茄烟叶放入恒温恒湿培养箱，分别考虑烟叶湿度25%、30%、35%，在发酵温度30℃、发酵湿度80%、接菌比（汉逊酵母∶拜耳接合酵母）1∶1、接菌量20%条件下发酵6 d，发酵结束后测定雪茄烟叶挥发性香气物质含量。

1.3.5 响应面优化试验 在单因素试验的基础上选取接菌比例、接菌量、烟叶湿度作为试验因素，以雪茄烟叶香气总量为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理设计响应面试验（表1），对试验条件进行优化；使用Design-Expert软件对数据进行回归分析，预测最佳发酵条件。

1.3.6 香气物质含量的测定 采用同时蒸馏萃取技术结合气相色谱-质谱联用仪测定发酵后雪茄烟叶的挥发性致香成分[11]。将发酵后的烟叶在70℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥12 h，用粉碎机粉碎后过60目筛网得到烟末。准确称取10 g烟末样品和200 mL饱和食盐水放入同时蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，另一端加入60 mL二氯甲烷。当有机相水浴达到55℃时，打开另一端的加热开关进行加热，至液面出现明显分层时开始计时萃取5 h。记时结束后关闭磁力搅拌器，待油浴与水浴降至室温后，先用旋转蒸发仪将二氯甲烷萃取液浓缩至2 mL，然后用少量无水硫酸钠干燥，过0.22 µm微孔有机滤膜于2.0 mL的色谱瓶中，加入1.202 8 mg/mL乙酸苯乙酯50 μL作为内标，立即上机检测。检测结果通过NIST 14.0数据库进行比对，对香气成分进行定性和定量分析。

1.3.7 GC/MS条件 气相色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样量1 μL，载气为氦气，流速1 mL/min，分流比10∶1，进样口温度250℃；升温程序：40℃保持2 min，以2℃/min升至200℃，保持5 min，以10℃/min升至280℃。质谱条件：传输线温度250℃，离子源温度230℃，电离方式EI，电压70 eV。

1.3.8 挥发性香气成分定性定量分析 采用NIST 14.0质谱数据库与GC-MS得到的质谱图进行相似度对比，进行定性分析，将匹配度最高的作为鉴定标准；采用乙酸苯乙酯内标法进行定量分析，将GC-MS中得到的各物质峰面积代入公式（1），计算香气物质含量。

（1）

式中，C为各香气物质的含量，S1为各香气物质的峰面积，S2为内标乙酸苯乙酯的峰面积，60为加入的内标（乙酸苯乙酯）的总质量，10为烟末样品的总质量。

1.4 数据处理

采用NIST 14.0质谱数据库对数据结果进行分析，使用Desigin Expert 13软件设计响应面试验及对响应面结果进行处理，使用Origin 2021软件制图。

2 结果与分析

2.1 汉逊酵母与拜耳接合酵母拮抗试验结果

由图1可知，汉逊酵母（J4）与拜耳接合酵母（R6）皆呈白色、不透明、扁平、有一定厚度等特征，汉逊酵母表面光滑完整，拜耳接合酵母表面则较为粗糙，边缘呈现颗粒状。二者交点处拜耳接合酵母的特征较为明显，但未发生排异现象；2种酵母相交点无抑菌圈，说明两菌之间无拮抗作用，可以进行混菌发酵试验。

2.2 雪茄烟叶固态发酵单因素试验结果

由图2可知，当汉逊酵母与拜耳接合酵母的接菌比例为1∶1时，香气总量最高（1 110.81 μg/g），此条件下两种菌的协调性较好且能共生，而当其中任意一方的比例增大或减小时，香气总量均下降。当接菌量为20%时，雪茄烟叶的香气总量最高；当接菌量减小或者接菌量提升至30%时，香气总量均下降。综合考虑，20%接菌量是最优条件。烟叶湿度为30%时，香气物质总量最高，但当湿度降低或者升高时，香气总量下降，因此烟叶初始湿度30%是最优条件。综上所述，汉逊酵母∶拜耳接合酵母接菌量1∶1、接菌量20%、烟叶湿度30%分别是3种单个发酵因素的最优条件。

2.2 响应面优化试验结果分析

以雪茄烟叶香气物质总量（Y）为响应值，选取接菌比例（A）、接菌量（B）、烟叶湿度（C）为参数，进行优化试验，试验设计及结果见表2。

实验方差分析是研究多个变量之间影响程度的重要指标[12]。对试验结果进行方差分析（表3），得出3个主效应对香气总量的影响为：烟叶湿度＞接菌比例＞接菌量，该回归模型的P值小于0.01，失拟项大于0.05，说明模型的可靠性比较好，可利用回归方程预测最优发酵条件。

响应面是可以反映各主要因素以及主要因素间交互作用对响应值的影响[13]。各因素间的交互作用对雪茄烟叶香气总量的影响见图3。由图3a可知，接菌比例与接菌量交互对雪茄烟叶中香气物质总量的影响呈现出抛物面分布，接菌比例引起曲面更大幅度的波动，对雪茄烟叶中香气物质总量影响更大，且二者呈现显著性关系。此外，雪茄烟叶香气总量对接菌比例和接菌量交互、接菌比例和烟叶湿度交互的响应均呈现抛物曲面分布。根据试验结果确定最佳发酵条件为：接菌比例1.1∶1，接菌量19.14%，烟叶湿度31.06%，预测在此条件下发酵得到的雪茄烟叶最终香气总量为1 187.25 μg/g。

2.3 复合菌株增香介质对雪茄烟叶香气物质的影响

雪茄烟叶发酵香气物质包括叶绿素降解产物、美拉德反应产物、苯丙氨酸降解产物、西柏烷类转化产物、类胡萝卜素降解产物以及其他香气物质6种类型[14]。对比单菌发酵与最优条件下混菌发酵香气物质含量（表4）可知，混菌发酵后雪茄烟叶香气物质总含量明显提高（1 200.92 μg/g），比单菌发酵提高了9.31%。其中，混菌发酵的叶绿素降解产物比单菌发酵提高了14.38%；与单菌发酵相比，混菌发酵的美拉德反应产物、西柏烷类降解产物含量略有下降，苯丙氨酸产物和类胡萝卜素降解产物含量有所增加，其他香气物质含量明显降低。

3 讨论与结论

研究利用汉逊酵母和拜耳接合酵母两种酵母增香介质对雪茄烟叶发酵工艺和发酵条件进行优化。在雪茄烟叶固态发酵优化的单因素试验中，在汉逊酵母与拜耳接合酵母的接菌比例为1∶1的基础上，增加或减小其中任意一方的比例，香气总量均会降低，可能是因为两菌数量相当时，可以在雪茄烟叶中维持一个良好的环境，对烟叶中的土著微生物起到促进作用，进而提高雪茄烟叶的香气含量。接菌量小于20%时，香气总量下降，可能是因为接菌量较少不足以影响雪茄烟叶的整体香气；而当接菌量提升至30%时，尽管这些外来菌种带来了额外的营养物质和香气成分，但大量的外来菌种会对雪茄烟叶中原有的土著微生物产生影响，从而降低香气含量。烟叶初始发酵湿度对于雪茄烟叶的发酵有重要影响，合适的湿度可以促进微生物在初始发酵阶段的生长，进而加快香气物质的积累[15-16]。湿度降低不仅影响土著微生物的活性，对汉逊酵母和拜耳接合酵母的活性也有所影响；湿度增高会增加霉变的可能，因此烟叶初始湿度为30%是最优条件。

响应面优化试验后，将发酵条件调整为接菌比例（汉逊酵母∶拜耳接合酵母）1.1∶1，接菌量19.14%，烟叶湿度31.06%。对响应面试验结果进行验证，发现混菌发酵的香气物质含量比单菌发酵提高了9.31%。其中，叶绿素降解产物和类胡萝卜素降解产物明显提升，而类胡萝卜素降解产物中巨豆三烯酮和法尼基丙酮的增加最为显著。苯丙氨酸产物中苯EeC3tVSe/H/vRRH4ZLaAfBjakScBFsoos4y1K+uxYPc=乙醛含量降低但苯乙醇的含量却增加，这与毛亚浩等[17]的结果一致，因此混菌发酵对苯丙氨酸降解产物的提高并不明显，推测苯乙醇含量的增加可能是苯乙醛脱氢造成的[18]。与单菌发酵相比，混菌发酵的美拉德反应产物略有下降，这可能是因为吲哚含量的减少。吲哚作为雪茄烟叶中花香香型的代表，浓度太高会产生难闻的气味，而浓度较低时则有花香的气息[19]。因此，虽然混菌发酵导致美拉德反应产物的香气含量略有下降，但它对雪茄烟叶整体香气的优化和提升起到了积极作用。香紫苏醇是雪茄烟叶龙涎香的主要香气成分之一，对烟草中龙涎香特质具有显著影响，是提升雪茄烟叶香气品质的重要因素。李锋等[20]的研究表明，香紫苏醇主要从植物中提取，但也可以由微生物进行生产合成。该研究中混菌发酵的其他香气物质中，香紫苏醇的含量有所下降。

总体而言，相较汉逊酵母增香介质发酵，利用汉逊酵母增香介质与拜耳接合酵母增香介质进行混合固态发酵，能提高雪茄烟叶香气物质总含量和提升雪茄烟叶产品品质。

参考文献：

[1] 杨静，李书贵. 混菌发酵对口含烟原料提质降害研究[J]. 安徽农业科学，2022，50（22）：180-183.

[2] WEI X T，LUO M F，LIU H Z. Preparation of the antithrombotic and antimicrobial coating through layer-by-layer self-assembly of nattokinase-nanosilver complex and polyethylenimine[J]. Colloids and Surfaces B，Biointerfaces，2014，116：418-423.

[3] 宋鹏. 微生物发酵降低卷烟烟气中有害成分及提高卷烟质量的研究[D]. 西安：西北大学，2008.

[4] 许春平，孙懿岩，姜宇，等. 芽孢杆菌生物制剂对复烤后烟叶化学成分的影响[J]. 轻工学报，2019，34（3）：34-41.

[5] 时伟，张熙琳，郑红梅，等. 混菌固态发酵清香型白酒糟制备蛋白饲料的研究[J]. 饲料研究，2024，47（4）：79-84.

[6] 贾冰玉，邹峰余，宋长春，等. 微生物固态发酵条件的优化及其对菜籽粕品质改善的研究[J]. 动物营养学报，2024，36（1）：650-657.

[7] 王颖，马玲玲，吕欣，等. 单一和复配微生物固态发酵对卷烟叶组主要化学成分的影响[J]. 烟草科技，2015，48（11）：47-52.

[8] 杜飞，喻阑清，周家喜，等. 两种产香微生物分离鉴定及其发酵液增香烟草研究[J]. 山地农业生物学报，2021，40（1）：14-21.

[9] 龙章德，苏赞，李季刚，等. 一种改善广西百色地区烟叶品质的混合微生物发酵技术[J]. 轻工学报，2021，36（5）：59-66.

[10] 吴颖，侯潞丹，张杰. 复合微生物菌剂中各菌株间的拮抗试验及培养条件的筛选[J]. 浙江农业学报，2016，28（5）：820-827.

[11] 郭永才，张长安，李彦周，等. 复烤烟叶挥发性香味成分同时蒸馏萃取的优化研究[J]. 农产品加工（上半月），2021（3）：15-18.

[12] 杨波，沈嘉，杨继福，等. 响应面法优化复合酶提高上部烟叶可用性的研究[J]. 湖南农业科学，2021（7）：75-79.

[13] 王子维，陈一桢，舒灏，等. 基于响应面-主成分分析法优化再造烟叶表面改性膜材料的配方研究[J]. 中国烟草学报，2024，30（1）：1-11.

[14] 闫洪洋，黄启蒙，蔡兴华，等. 产香菌株的分离鉴定及其发酵产物在卷烟加香中的应用[J]. 轻工学报，2021，36（6）：47-54.

[15] 宋雯，陈曦，余君，等. 初始含水率和菌群演替在雪茄烟叶发酵产香中的作用[J]. 湖南农业科学，2023（7）：82-88.

[16] 贾云，郭思达，张倩颖，等. 国产雪茄茄芯烟叶工业发酵条件单因素优化研究[J]. 中国烟草学报，2024，30（3）：105-115.

[17] 毛亚浩，张彤彤，余君，等. 混菌发酵对雪茄烟叶化学成分及香气品质的影响[J]. 湖北农业科学，2023，62（4）：140-145.

[18] 任晓红，朱家明，王瑞，等. 恩施主产烟区烤烟香气香型香韵特征[J]. 中国烟草科学，2019，40（2）：87-91，98.

[19] 张婷，柳均，黎妍妍，等. 湖北烤烟香型、香韵及香气物质关系分析[J]. 南方农业学报，2021，52（2）：385-392.

[20] 李锋，陶飞. 香紫苏醇的微生物法生产研究进展[J]. 广州化工，2015，43（24）：5-7，18.

（责任编辑：王婷）