肠道硝酸盐对肺炎克雷伯菌生长的影响及其调控机制

摘要：目的探讨肠道硝酸盐环境对肺炎克雷伯菌生长的影响及具体调控机制。方法构建肺炎克雷伯菌硝酸还原酶narG、narZ单基因和双基因敲除株及硝酸盐二元调控系统NarXL基因敲除株；全自动细菌生长分析仪检测菌株在体外有氧硝酸盐环境下的生长曲线；分光光度计法检测细菌厌氧硝酸盐环境下生长曲线；qRT-PCR检测二元调控系统NarXL在厌氧硝酸盐环境中对硝酸还原酶narG、narZ基因表达影响；EMSA和MST分析NarXL在感应利用硝酸盐环境中的具体调控机制；qRT-PCR检测厌氧硝酸盐环境对narG、narZ基因表达的影响；利用竞争实验检测narG、narZ基因在厌氧硝酸盐环境中的生长优势。结果相比于有氧环境，在厌氧条件下，硝酸盐能够明显促进肺炎克雷伯菌野生株的生长且促进生长的幅度高于narXL 基因敲除株；qRT-PCR显示厌氧条件下narXL敲除株中硝酸还原酶相关基因narG、narZ表达显著降低（Plt;0.0001）；EMSA和MST实验显示NarXL调控子能够直接与narG、narZ启动子区结合；qRT-PCR显示在厌氧硝酸盐环境中硝酸还原酶narG、narZ基因表达量明显升高（Plt;0.0001，Plt;0.01）；生长曲线和竞争实验表明硝酸还原酶narG基因敲除株在厌氧硝酸盐环境中生长和竞争生长能力均明显变弱（Plt;0.01）。结论肺炎克雷伯菌二元调控系统NarXL 可感应肠道硝酸盐浓度变化直接正调控硝酸还原酶基因narG、narZ表达从而促进细菌生长。

关键词：肺炎克雷伯菌；NarXL；硝酸还原酶；厌氧生长；肠道环境

肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）是一种广泛存在动物或环境中的兼性厌氧菌，亦是人体的正常菌群［1］。在人体，肺炎克雷伯菌主要定植在胃肠道及鼻咽等部位，一定条件下引起肺炎、脑膜炎、化脓性肝脓肿、尿路感染和菌血症等感染［2， 3］。

炎症性肠病（IBD）是以肠道炎性病变为主的慢性疾病，是感染性疾病发生的高危因素。艰难羧菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、COVID-19在IBD患者中的感染率较正常人群增加［4-8］。临床流行病学发现IBD患者肠道中肺炎克雷伯菌携带率、丰度及发生肺炎克雷伯菌性肝脓肿的几率较正常对照人群升高（6.72 vs 4.06 万人/年）［9］。但具体机制并不清楚。课题组利用葡聚糖硫酸钠（DSS）构建IBD小鼠模型，经消化道途径感染肺炎克雷伯菌后也发现：IBD小鼠组粪便、大肠、小肠及肝脏中细菌载量明显上升，同时肠道内硝酸盐浓度增加。