肺炎克雷伯菌钼酸盐转运体modA基因缺失株的构建及其生物学特性

摘要：目的利用同源重组技术构建肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株钼酸盐转运系统modA基因缺失株和回补株，探讨modA基因对肺炎克雷伯菌厌氧硝酸盐呼吸生长及表型的影响。方法利用自杀载体pKO3-Km质粒构建modA基因缺失株，同时扩增包含modA基因启动子、开放阅读框（ORF）和终止子区域的整条序列片段，将其克隆至pGEM-T-easy质粒中获得重组质粒modApGEM-T-easy，电转化至modA缺失株中得到回补株C-modA，通过体外厌氧硝酸盐呼吸生长测定、竞争力指数实验、生物膜结晶紫定量实验、黏度定量实验以及菌株形态Image J测量法比较分析NTUH-K2044野生株、modA基因缺失株、回补株的厌氧硝酸盐呼吸生长、细菌竞争力、生物膜合成能力及超黏表型、菌株形态改变。结果利用自杀载体pKO3-Km质粒成功构建肺炎克雷伯菌modA基因缺失株ΔmodA；随后将重组质粒modA-pGEM-T-easy电转化入ΔmodA中，得到回补株C-modA；相较于肺炎克雷伯菌野生株（WT）、C-modA，modA基因缺失株厌氧硝酸盐呼吸生长受抑制；ΔmodA相对野生株WT的体外厌氧培养竞争力明显减弱（Plt;0.05）；ΔmodA厌氧生长生物膜合成减少，与WT、C-modA差异具有统计学意义（Plt;0.05）；modA基因缺失株厌氧条件下黏液表型明显被削弱，相对WT、C-modA差异具有统计学意义（Plt;0.01）；厌氧条件下ΔmodA菌体形态由正常的短杆状变为球型，与WT、C-modA长度差异有统计学意义（Plt;0.0001）。结论钼酸盐转运系统编码基因modA与肺炎克雷伯菌的厌氧硝酸盐呼吸、细菌体外竞争力、生物膜形成、超黏表型以及菌体形态变化等致病力因素相关。

关键词：肺炎克雷伯菌；ModA蛋白；厌氧生长；菌体形态

肺炎克雷伯菌作为临床上继大肠埃希菌后的主要条件致病菌，可引起多部位的感染，包括尿路感染、菌血症、肺炎、肝脓肿和脑膜炎等，尤其是K1、K2血清型，目前已成为临床细菌性肝脓肿的主要致病菌，其日益严峻的耐药形势也令人堪忧［1-3］。肠杆菌科兼性厌氧菌在人体肠道炎性环境中主要通过攫取一系列电子受体如硝酸盐（NO3-）、亚硝酸盐（NO2-）等进行厌氧呼吸而扩张，从而增加异位感染的易感性，而钼酸盐转运体ModABC可能在其中发挥了重要作用［4， 5］。有研究显示，大肠埃希菌进行厌氧硝酸盐呼吸的关键酶是硝酸还原酶，而硝酸还原酶的活性中心为含有钼（Mo）的钼辅因子MoCo，Mo 的转运则离不开钼酸盐转运系统ModABC［6-8］。通过对高毒力肺炎克雷伯菌NTUHK2044（K1血清型超黏表型）［9］全基因组分析，发现该菌株中也存在着完整的MoCo合成途径以及多达9个硝酸还原酶编码基因。课题组前期蛋白质谱研究数据显示，编码肺炎克雷伯菌毒力控制因子CRP的基因被敲除后，细菌蛋白ModA的表达量出现明显下降［10］。CRP作为全局调控因子，其对肺炎克雷伯菌的菌毛、生物膜形成、体外生长和致病发挥着重要作用［11］。Liu等［10］研究也显示在易感条件下，cAMP-CRP能够通过调控相关基因的表达以改变细菌的形态，而这对增强细菌致病力有重要意义。那ModABC系统对肺炎克雷伯菌体外厌氧生长及毒力又会有怎样的影响？本研究通过同源重组敲除肺炎克雷伯菌钼酸盐转运系统modA基因［12］，分析该基因对肺炎克雷伯菌NTUH-K2044厌氧硝酸盐呼吸和生物膜、超黏表型等毒力因素形成的作用，及在此过程中与菌体形态改变这一致病因素的关系。本研究将有助于为临床治疗耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染提供新思路。