西门塔尔肉牛源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

摘要：为了了解承德地区西门塔尔肉牛腹泻大肠杆菌流行情况及对常用抗菌药物的耐药性情况，本试验2022—2023年从承德地区散养户和规模化牛场中采集不同日龄患有腹泻病的西门塔尔肉牛的肛拭子样品、粪便样品及死亡肉牛肝脏病料样品共计172份，对采集的病料样品进行大肠杆菌分离鉴定，并测定分离的大肠杆菌的致病性和常用药物的耐药性。结果显示，从采集172份病料组织样品中分离得到58株致病性大肠杆菌菌株，58株致病性大肠杆菌对青霉素、磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素等7种抗生素的耐药率在44.8%以上，对其他6种抗生素具有不同程度的耐药性。结果表明：该地区散养户和规模化牛场中流行的大肠杆菌分离菌株具有致病性，对临床中常用的抗生素产生了不同程度的耐药性。

关键词：西门塔尔肉牛；大肠杆菌；致病性；耐药性

相关研究表明，大肠杆菌（Escherichia coli）是动物养殖过程常见的致病菌之一，该菌具有多种血清型和不同的类型，可以引起牛、羊、马、鸡、鸭、猪和兔等多种动物和人类发病，该菌感染途径比较广泛，如消化道、呼吸道、污染的饲料和饮水及环境等多种途径感染均可以感染多种动物和人，引起动物严重的腹泻、肠炎、肺炎、腹膜炎等一系列的疾病，严重者可以导致动物死亡，给动物养殖业造成严重经济损失[1-2]。研究表明，近几年来在牛、羊等动物中致病性大肠杆菌的分离率或检出率逐年上升，该菌不仅可以引起牛、羊动物的消化道感染，个别菌株可以引起牛羊的肺炎，以犊牛和羔羊较易感，可以引起急性死亡，死亡率较高，危害着我国牛养殖业健康发展[3-4]。大肠杆菌病可以导致多牛的急性败血症和慢性感染（肠炎、腹泻），急性败血症可致死亡，慢性感染可致使动物精神萎靡、食欲减退等，严重影响生长和生产性能[5-6]。国内相关研究表明，临床中分离的不同动物源的致病性大肠杆菌，已经对临床中不同种类的抗菌药物（β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮等）产生严重的耐药性，且呈现多重耐药性，且对临床治疗带来一定的困难[7]。因此，在临床中治疗动物巴氏杆菌病应该根据药敏试验结果正确地选择和合理使用抗菌药物。本试验从承德地区散养户和规模化牛场中采集患有腹泻病的西门塔尔肉牛的病料组织样品172份进行大肠杆菌鉴定，并检查其致病性和耐药性，为该地区养殖场中西门塔尔肉牛大肠杆菌病的防控理论支撑。

1 材料与方法

1.1 病料来源

本试验2022—2023年从承德地区（隆化、围场）散养户和规模化牛场中不同日龄患有腹泻病的西门塔尔肉牛的肛拭子样品、粪便样品及死亡肉牛肝脏病料样品共计172份（表1）。

1.2细菌分离和培养

将采集的患病（死）西门塔尔肉牛的病料组织（肛拭子、粪便及死亡肉牛肝脏）样品用无菌PBS进行处理，在超净工作台中按照1∶100比例分别划线接种于伊红-亚甲蓝培养基，在37 ℃条件下培养12～18 h后，挑取典型带金属光色单个菌落接种于鉴别培养基上（大肠杆菌显色培养基）培养12～18 h后，挑取典型浅绿色单个菌落进行革兰染色，显微镜下观察分离菌株的形态学。

1.3 细菌生化试验

对临床分离的菌株接种营养肉汤中培养至对数期，参照细菌生化显色全套试剂盒说明书，对临床中分离的每一株菌株进行生化特性鉴定。

1.4 细菌PCR鉴定

取1.3中分离培养至对数期分离菌株的菌液进行编号，以水煮法提取基因组DNA为模板，参考文献反应体系和反应程序，用细菌16S rRNA通用引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）进行PCR检测[7]，取检测阳性的分离菌株PCR产物送测序分析，测序分析结果，参照同源性≥97%进行判定[7]。

1.5 动物攻毒试验

取1.3中培养菌株菌液，调整菌液浓度为107～8CFU/mL，每1株分离菌株为攻毒组，通过灌胃攻毒方法攻毒2只小鼠（0.25 mL/只），对照组2只小鼠通过同样的方法给予等量的无菌的PBS。攻毒组和对照组的小白鼠攻毒后，观察攻毒组和对照组的小白鼠发病和死亡情况。

1.6 药敏试验

取1.3中分离培养至对数期分离菌株的菌液（107～8CFU/mL），在无菌条件下均匀涂布在90 mm普通营养琼脂中，贴上药敏纸片后37 ℃条件下培养12～18 h后，测量抑菌圈浓度，参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年推荐药敏试验进行结果判断，分析其耐药性。

2 结果

2.1 细菌分离和培养

从172份病料样品中（肛拭子、粪便死亡肉牛肝脏）分离得到菌株，在伊红-亚甲蓝培养基（带金属光色的菌落）和大肠杆菌显色培养基（蓝色的菌落）分别长出典型的菌落，革兰氏染色可见典型的杆状阴性菌形态学结构，细菌生化显色全套试剂盒判定结果与大肠杆菌的生化特性一致。通过统计，从172份病料组织中分离得到89株菌株，初步鉴定为大肠杆菌。

2.2 细菌PCR鉴定

以水煮法提取89株分离菌株的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA 通用引物进行PCR鉴定，结果显示， 89株菌株均扩增出大约为1 429 bp目的条带，测序结果显示，89株分离菌株与标准的大肠菌比，其同源性均大于98.9%，均可以判定为大肠杆菌。

2.3动物攻毒试验

攻毒组的小鼠在攻毒后2～3 d出现不同程度的发病情况，如精神沉郁、采食量减少、扎顿和腹泻等，个别攻毒小鼠攻毒后出现急性死亡。剖检死亡的小鼠取肝脏组织分离得到大肠杆菌。致病性试验结束，对照组未见临床症状和死亡情况。通过致病性试验统计58株可引起小鼠死亡的致病性大肠杆菌。

2.4药敏试验

临床分离菌株的药敏试验显示， 临床分离的58株西门塔尔肉牛源致病性大肠杆菌对对青霉素、磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素等7种抗生素的耐药率在44.8% ～100%之间；对头孢噻呋、头孢喹肟、恩诺沙星等6种抗菌药耐药率在10.3%～31.0%之间。

3 讨论

大肠杆菌为危害多种动物常见的病原菌之一，该菌具有多种血清型，广泛存在养殖环境中，可以通过多种途径（饲料、饮水、垫料等）=可以感染多种动物、野生动物和人类，在一定条件下该菌可以通过多种途径在不同动物之间及动物与人类之间相互传播，对人和动物的危害较大[8]。相关研究表明，大肠杆正常情况下不会发病，当外界环境或者有应激因素时，当动物机体出现不同程度的抵抗力下降时，可以引起牛严重的败血症、腹泻、肠炎、脱水等一系列的临床症状，甚至引起急性死亡[9]。本试验研究表明，从采集的172份患腹泻病西门塔尔肉牛病料组织中分离得到58株对小鼠具有致病性的大肠杆菌菌株，说明大肠杆菌可能是西门塔尔肉牛腹泻病的主要病原菌之一，在该地区肉牛场中广泛流行，可能存在潜在的威胁，应该注意防控。目前，由于大肠杆菌血清型众多，且疫苗效果不理想，抗生素成为防治该病的主要措施，随着抗生素的滥用，导致其严重耐药性问题[10]。本试验结果显示，临床分离=致病性大肠杆菌对常用抗生素的产生严重的耐药性。说明该地区分离的致病性大肠杆菌耐药性严重。因此，应该引起重视，合理使用抗菌药物，减少耐药性产生和定期对养殖环境进行消毒，并进行采取综合性防控。本研究为该地区散养户和规模化牛场中西门塔尔肉牛大肠杆菌病的防控提供研究基础。■

参考文献：

[1] 李搏珍.牛致病性大肠杆菌卵黄抗体的制备及效力评估[D].南阳师范学院， 2023.

[2] 曲栓.犊牛腹泻大肠杆菌和奇异变形杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析[D].西北农林科技大学， 2023.

[3] 王琪，张惠玲，刘日蓉，等.蒲公英水煎液对犊牛源多重耐药大肠杆菌耐药性的消除作用[J].中国兽医杂志， 2024， 60 （3）： 126-131.

[4] 黄方园.四川部分地区肉牛源产ESBLs大肠杆菌的耐药性调查分析[D].四川农业大学， 2022.

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中国动物检疫， 2022， 39 （12）： 26-30.

[6] 贾垌，张迪，张兆天，等.京津冀部分地区致犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因、耐药基因检测及药物敏感性分析[J].中国畜牧兽医， 2022， 49 （12）： 4820-4831.

[7] 张召兴，李佩国，陈玥，等.2018年～2019年河北地区蛋鸡源大肠杆菌流行病学调查与分析[J].中国预防兽医学报，2020，42（3）：228-233.

[7] 史唯地，康立超，刘彩霞，等.犊牛源肠外致病性大肠杆菌分离鉴定、致病性及耐药性分析[J].中国畜牧兽医， 2023， 50 （12）： 5022-5031.

[8] 贾垌.京津冀地区犊牛源大肠杆菌的毒力因子鉴定和耐药性分析[D].河北农业大学， 2022.

[9] 李红丽，闫巍文，闫益波，等. 牛源大肠杆菌对小鼠的致病性[J].中国兽医学报，2023，43 （9）：1845-1850.

[10] 王小立.河北地区牛源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析[D].河北科技师范学院， 2022.