田阳区仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测

摘要：为了了解百色市不同地区规模化养殖场及散养户中不同日龄断奶仔猪源副猪嗜血杆菌流行情况和对临床中常用抗生素的耐药性情况，为临床中仔猪源副猪嗜血杆菌防控及合理用药提供参考依据。本研究于2022-2023年采集田阳区养殖场及散养户中患呼吸道疾病的断奶仔猪鼻咽拭子及死亡仔猪胸腔积液和肺脏样品组织287份，对采集的287份病料样品采用细菌分离鉴定进行副猪嗜血杆菌鉴定，分别采用人工攻毒小鼠试验和K-B药敏纸片法检测其分离菌株的致病性和对常用抗生素的耐药性。结果显示：从田阳区不同乡镇规模化养殖场及散养户中采集的217份病料样品中分离到92株副猪嗜血杆菌（42.4%），分离的62株副猪嗜血杆菌对小鼠具有致病性（死亡率在40%～100%之间），且对青霉素、阿莫西林、氨苄西林等10种抗生素的耐药率为51.6%以上，本研究为田阳区不同乡镇规模化养殖场及散养户中仔猪副猪嗜血杆菌病的综合防控提供参考。

关键词：仔猪；副猪嗜血杆菌；分离鉴定；致病性；耐性

在猪的养殖过程，仔猪的呼吸道疾病是临床中常见的疾病之一，其中细菌性因素是引起仔猪呼吸道疾病的主要因素之一，其中副猪嗜血杆菌最为常见[1-3]。仔猪副猪嗜血杆菌病主要有不同血清型的副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis，Hps）引起仔猪的呼吸道传染病，该菌可以感染不同阶段的仔猪，其中以4～8周玲的仔猪最易感，其死亡率高达80%以上，给养猪业造成严重的经济损失[3-5]。仔猪副猪嗜血杆菌主要表现为呼吸困难、纤维素性胸膜炎及关节炎等为主的一系列的临床症状，在临床中仔猪副猪嗜血杆菌与相关病毒性疾病（圆环病毒、蓝耳病毒及猪瘟）混合感染，不仅给临床中相关疾病的诊断带来一定困难，还可以导致其猪的死亡，具有高的感染率和死亡率[6-7]。国内外相关研究表明，仔猪副猪嗜血杆菌病具有多种血清型，且有地域流行性，给仔猪副猪嗜血杆菌病疫苗制备带来一定的困难[8]。本研究对采集田阳区不同养猪场中疑患呼吸道疾病（似患副猪嗜血杆菌病）的病料组织样品进行副猪嗜血杆菌分离鉴定，并研究其分离菌株的致病性和对临床中常用药物的耐药性，为进一步指导田阳区不同乡镇规模化养殖场及散养户中合理使用抗生素治疗仔猪副猪嗜血杆菌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2022—2023年采集田阳区养殖场及散养户中患呼吸道疾病（类似副猪嗜血杆菌病临床症状的）仔猪的鼻咽拭子样品、肝脏样品、胸腔积液样品和肺脏样品共计287份。

1.2 细菌分离与培养

将采集的各种病料组织（鼻咽拭子、肝脏、胸腔积液和肺脏等样品）287份进行编号1～287号，并放在无菌PBS中处理（8 000 r/min离心5 min），取处理的上清液在超净工作台无菌中按照1：100比例分区划线接种于副猪嗜血杆菌鉴别培养基（巧克力培养基）上，在含有5% CO2厌氧的环境中培养箱中37 ℃恒温条件下培养12～18 h后，挑取副猪嗜血杆菌鉴别培养基（巧克力培养基）上单个典型菌落在无菌条件下接种于TSB液体培养基中37 ℃振荡（100 r/min）12～18 h后，按照革兰氏染色试剂盒说明书进行染色和显微镜观察。

1.3 生化试验鉴定

取1.2中纯化培养的分离菌株，参照副猪嗜血杆菌特定生化鉴定试剂盒说明书，将1.2中纯化培养的分离菌株，加入细菌生化鉴定试剂盒37 ℃恒温培养24～48 h后鉴定其生化特性。

1.4 致病性试验

参考文献[9-10]的方法，将分离的副猪嗜血杆菌按照1.2中方法培养至对数期（采用分光光度计测定），在无菌的条件下计数，并调整纯化培养的副猪嗜血杆菌浓度为108 cfu/mL，分离的副猪嗜血杆菌菌株的1株通过腹腔注射（剂量为0.25 mL/只）攻毒5只小鼠为攻毒组，未进行攻毒的5只小鼠以同样的方法给予等量的TSB液体培养基，致病试验期为7 d，在攻毒试验期间，每天观察2次，观察其攻毒组和对照组的小鼠发病与死亡情况。

1.5 药敏试验

对分离菌株进行药敏试验，其操作方法参照美国临床检验标准委员会（NCCLS）2020年推荐的标准K-B纸片法进行结果判定。

2 结果

2.1 细菌分离培养

采集的各种病料组织（鼻咽拭子、胸腔积液和肺脏）287份经分离培养结果显示，分离的菌株在副猪嗜血杆菌鉴别培养基（巧克力培养基）上长出典型的菌落，通过TSB培养基纯化培养，通过革兰氏染色镜检，结果显示，分离得到的菌株培养特性和形态学均符合副猪嗜血杆菌标准菌株的培养特性、形态学。

2.2生化试验鉴定

分离的92株分离菌株的生化鉴定结果显示，分离的92株分离菌株的生化特性与细菌生化鉴定试剂盒说明书的副猪嗜血杆菌的生化特性一致。

2.3 致病性试验

攻毒试验期间，经过观察攻毒组小鼠和对照组的小鼠，其中攻毒组小鼠在攻毒后2～5 d出现死亡，个别小鼠表现为呼吸困难、腹围增大等，剖检死亡的小鼠可见肺脏出现了不同程度的水肿、出血，且腹腔出现严重渗出液。采集死亡小鼠的病料组织（肝脏、肺脏及心血等样品）中分离得到了与攻毒一致的副猪嗜血杆菌，攻毒试验结束，未攻毒组健康存活。其中62株副猪嗜血杆菌能引起小鼠死亡（40%～100%），为致病性副猪嗜血杆菌。

2.4 药敏试验

药敏试验结果由表1可知，62株副猪嗜血杆菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林等10种药物的耐药率为51.6%～91.9%，对头孢噻呋、头孢噻肟、环丙沙星等4种药物耐药率为6.5%～40.3%。

3 讨论

仔猪副猪嗜血杆菌广泛存在于自然界的养殖环境中，当饲养管理不当如应激（如天气骤变、转群、运输）导致其免疫力下降引起发病，可以通过多种途径（直接接触传播、空气传播、饲料饮水传播等）在不同猪只之间传播，为临床中常见的条件致病菌之一[8-9]。副猪嗜血杆菌病可以引起猪严重的呼吸道感染，具有发病比较急、死亡率较迅速等特点，且在临床中常常出现混合感染，尤其对仔猪的危害较大[10]。本试验结果表明，采集的各种病料组织（鼻咽拭子、肝脏、胸腔积液和肺脏等样品） 217份中分离到62株致病性的副猪嗜血杆菌分离菌株，其对小鼠的死亡率40%～100%。说明副猪嗜血杆菌是引起百色市不同地区规模化养殖场及散养户中仔猪呼吸道感染的主要的病原菌，均为致病性菌株且均在百色市不同地区规模化养殖场及散养户中流行严重，因此，对仔猪副猪杆菌病应进行有效的防控，可以考虑接种多价的副猪杆菌疫苗。仔猪副猪杆菌是临床中常见的呼吸道性细菌病之一，在猪的养殖过程中主要通过抗生素进行防治，目前在养殖过程中抗菌药物的滥用，导致其临床中分离的副猪嗜血杆菌的耐药性呈现日渐上升的趋势，且出现严重的耐药性，同时降低其治疗效果[11]。药敏试验结果表明，62株致病性副猪嗜血杆菌对临床中常用的10种抗生素耐药率为51.6%以上，说明从该地区养猪场中分离的副猪嗜血杆菌对临床中常用的药物产生耐药严重性。因此，应该引起重视，通过药敏试验进行分析其耐药性，注意抗生素的合理使用，降低其耐药性，提高治疗效果，同时应该对养殖场和散养户制定有效消毒制度，减少环境感染。■

参考文献：

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