不同谱系D型流感病毒HEF蛋白N-糖基化位点和B细胞表位预测分析

摘要：D型流感病毒（IDV）是一种近年来新发现的正粘病毒科D型流感病毒属成员，可引起牛、猪、豚鼠等多种动物的呼吸道疾病，具有潜在的人兽共患性。基于HEF基因遗传多样性，IDV可分为5个不同的谱系，分别是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和 D/CA2019谱系。不同于甲型、乙型流感病毒，IDV的潜在N-糖基化位点主要集中分布在HEF基因上。为系统了解不同谱系毒株HEF蛋白的N-糖基化位点和B细胞表位，从GenBank数据库获得151条全长HEF基因序列，通过使用MEGA-X生物信息学软件构建遗传进化树，并用在线工具进行各毒株N-糖基化位点和线性B细胞表位预测分析。结果表明IDV的HEF蛋白具有6～8个潜在的N-糖基化位点，其中有2个N-糖基化位点（N146和N613）在不同谱系间相同，有6个N-糖基化位点（N28、N54、N249、N346、N390和N513）在不同谱系间存在差异。B细胞表位在不同谱系间有3个保守的表位和8～9个各谱系独特的表位。线性B细胞表位的预测将有助于设计激活体液反应的多表位疫苗，预测结果还需要体外和体内实验证实来证明该应用的可行性。

关键词：D型流感病毒；谱系；HEF蛋白；N-糖基化位点；B细胞表位；预测

正粘病毒科（Orthomyxoviridae）有四种类型的流感病毒（influenza viruses），分别命名为A、B、C和D型流感病毒（IAV、IBV、ICV和IDV）。已知IAV、IBV和ICV会导致人类呼吸道疾病[1-2]。IDV是一种新发现的正粘病毒科成员，最初于2011年在美国俄克拉何马州的一头患有严重呼吸道症状的病猪中分离出来[3]。目前已在美洲、欧洲、非洲、亚洲的多个国家和地区猪群、野猪群、牛群等检测到该新型病毒[4-12]。IDV比IDC具有更加宽泛的宿主范围，已在多种动物物种中检测到，除了牛、猪和野猪外，还包括山羊、绵羊、马、骆驼等[13-17]，在小鼠、豚鼠和雪貂中也建立了动物模型。IDV感染会导致牛的轻度呼吸道疾病，并与牛呼吸道综合征相关[18]，对养牛业产生重大经济影响。

IDV的病毒基因组与ICV的基因组有约50%的相似性，与IAV和IBV相比，IDV的基因组由7条单链负义RNA片段组成，编码9种蛋白质，分别是血凝素-酯酶-融合蛋白（HEF蛋白）、聚合酶PB2、PB1和P3、核蛋白、基质蛋白M1和CM2以及非结构蛋白NS1和NEP[3]。研究表明IDV的HEF蛋白具有与ICV HEF蛋白相似的受体结合、受体降解（乙酰酯酶）和膜融合等生物学功能，HEF由HEF1和HEF2两个亚基组成，分为受体结合区（receptor binding domain，R）、酯酶活性区（esterase domain，E）以及融合活性区（fusion domain，F）[19]。

HEF是IDV中最易变异的基因组节段，HEF蛋白具有很好的免疫原性，主要用于该病毒的遗传演变分析。根据HEF的序列差异，IDV可分为5个不同的遗传演化谱系，即D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019。在欧洲和美洲，主要流行D/OK和D/660 谱系；在日本，主要流行D/Yama2016和D/Yama2019谱系[20]。此外，D/ CA2019 谱系只在美国的加利福尼亚州报道[21]。HEF蛋白是IDV的唯一糖基化蛋白，其糖基化位点的变化可能影响病毒的复制力、致病性和稳定性等。因此，通过生物信息学方法预测分析比较IDV不同谱系HEF蛋白理化性质、结构、潜在N-糖基化位点和B细胞抗原表位，对于研究IDV复制、致病性、抗病毒药物以及多表位疫苗研制等具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 毒株信息

从GenBank数据库检索，共获得151条全长的HEF基因序列（截止至2023年3月30日），具体见表1。通过使用MEGA-X软件采用最大似然性法（maximum likelihood）进行系统进化分析，选择Tamura-Nei为最适替换模型，设置自展值（bootstrap replicates）为1000，构建遗传进化树。

1.2 HEF蛋白理化性质与蛋白结构预测

对不同谱系D型流感病毒HEF蛋白通过在线软件网站ProParam（https：//www.expasy.org/protparam），利用Expasy工具分析其基本物理和化学性质。蛋白跨膜预测使用TMHMM Server v.2.0 （https：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具；蛋白信号肽预测，采用SignalP4. 1 Server （http：//www.cbs.dtu dk/services/SignalP/）在线工具。

1.3 HEF蛋白N-糖基化位点预测

用N-糖基化位点在线预测软件（https：//services.healthtech. dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）对不同谱系D型流感病毒HEF蛋白进行预测，阳性阈值定为0.5以上。

1.4 HEF蛋白线性B细胞表位预测与验证

利用在线工具软件ABCpred（https：//webs. iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）和 Bepipred（http//tools.iedb. org/bcell/）预测B细胞表位。ABCpred软件预测氨基酸长度设置为18，阈值设置为0.80；Bepipred软件预测设置阈值为0.35，肽段长度为5～30 个氨基酸。综合分析上述两种在线工具软件预测结果筛选候选线性B细胞表位。

2 结果

2.1 基于HEF基因的D型流感病毒谱系划分

GenBank中可检索到151株完整的HEF基因序列，其中12株来源于感染猪的IDV，139株来源于感染牛的IDV。基于血凝素酯酶融合（HEF）蛋白的核苷酸序列运用生物软件MEGA-X分析，IDV可分为5个不同的谱系（图1），即D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019。D/OK谱系包含的毒株最多，151株HEF基因序列中有69.54%（105/151）的毒株属于该谱系，其次是D/660谱系为23.18%（35/151），D/OK谱系和D/660谱系流行于美洲、欧洲和亚洲地区。D/Yama2016谱系和D/CA2016谱系的毒株最少，均有3株序列，占比仅1.99%，分别流行于日本和美国地区，其他地区未见分离报道。D/Yama2019谱系里的5株流行株分别来自日本、中国和土耳其地区。11株国内流行株分别属于D/OK谱系和D/Yama2019谱系，其中9株属于D/OK谱系，并与其他国家分离的毒株在遗传进化树上彼此分离，形成独立的小分支。猪源的12株IDV HEF基因序列，除1株（D/swine/Kentucky/17TOSU1262/2017）属于D/660谱系外，其余11株均属于D/OK 谱系，由图1可见猪源和牛源毒株聚集在一起，没有形成独立的分支，表明IDV在猪和牛之间可能可以相互传播。

IDV的5个谱系 （D/OK、D/660、D/CA2019、D/Yama2016和D/Yama2019）分别用蓝色、紫色、黄色、绿色和橙色标记，各谱系的代表株和中国分离株分别用红色和亮蓝色标记。

2.2 HEF蛋白理化性质与结构预测

根据ProParam分析可知，IDV各谱系HEF蛋白均由644个氨基酸组成，该蛋白相对分子质量在71575.2～71761.02之间，pI值在5.39～6.22之间，不稳定性指数在36.42～37.56之间（>40判定为不稳定蛋白），平均亲水系数在-0.075～-0.138之间，归为稳定性亲水蛋白。由 TMHMM 软件和SignaIP软件分析显示，IDV 各谱系HEF蛋白信号肽区为1～16位氨基酸，D/OK谱系胞外区、跨膜区和胞内区序列分别位于第17～636，637～660 和 661～664 位氨基酸（图 2），其他谱系跨膜区分别为17～644或17～640位氨基酸。

2.3 不同谱系D型流感病毒的N-糖基化位点预测分析

经N-糖基化位点在线软件预测（糖基化可靠性阈值大于0.5），结果如表2所示。IDV HEF蛋白有8个潜在的N-糖基化位点，分别位于N28，N54、N146，N249，N346，N390、N513和N613位点，各谱系分别具有其中的6～8个潜在N-糖基化位点。IDV各谱系毒株HEF蛋白中有2个最保守的潜在N-糖基化位点分别为N146和N613；其次是N28和N54位点均只有1株糖基化可靠性阈值小于0.5，N28位点只有D/Yama2019谱系的D/bovine/CHN/JLSL/2021糖基化可靠性阈值小于0.5，N54位点只有D/OK谱系的D/bovine/Mississippi/C00148N/2014在该位点天冬酰胺（N）突变为天冬氨酸（D）而不具有潜在的N-糖基化位点；D/Yama2019和D/ CA2019 谱系所有毒株具有N249位的潜在N-糖基化，D/Yama2019谱系毒株和D/660谱系的D/bovine/France/2986/2012因在该位点的天冬酰胺（N）突变为丝氨酸（S）而缺失了N-糖基化位点，D/OK谱系中有4株N-糖基化可靠性阈值小于0.5；D/Yama2019、D/Yama2016和D/ CA2019谱系的N346位比较保守，其N-糖基化可靠性阈值均大于0.5，D/660谱系中有1株T348突变为I348而不具有该位点的N-糖基化，D/OK谱系中有2株N346突变为H346而不具有该位点的N-糖基化；N390位只有D/Yama2019谱系N-糖基化可靠性阈值均大于0.5；N513位和N346位有D/Yama2019、D/Yama2016和D/ CA2019谱系N-糖基化可靠性阈值大于0.5，D/660和D/OK谱系各有1株第513位天冬酰胺（N）突变为天冬氨酸（D）以及D/OK谱系中有3株N513位临近位点有突变而不具备该位点的N-糖基化。

糖基化主要有N-X-T和N-X-S两种形式，在IDV各谱系中8个潜在的N-糖基化位点中有6个位点（N54、N146，N249，N346，N390和N513）是N-X-T形式，N28位点只有D/Yama2016谱系是N-X-T形式，其他4个谱系均为N-X-S形式，只有N613位点在各谱系中均为N-X-S形式。IDV各谱系潜在的N-糖基化位点数量也不相同，D/Yama2016谱系最少为6个，D/OK谱系中除了6株来源于中国的毒株具有7个潜在的N-糖基化位点外都是6个，D/ CA2019和D/660谱系（其中1株D/bovine/France/2986/2012为5个）具有7个潜在的N-糖基化位点，D/Yama2019谱系除1株D/bovine/CHN/JLSL/2021外其他都有8个潜在的N-糖基化位点。

2.4 HEF蛋白B 细胞抗原表位预测

ABCpred和BepiPred在线工具软件对HEF蛋白氨基酸序列进行分析，得到的B细胞表位序列及分值，D/OK谱系代表株（JQ922308）分别用ABCpred和BepiPred软件分析预测结果见表3和表4，其中表中加粗部分有12个表位为ABCpred和BepiPred预测的重叠表位可认为是 D/OK谱系HEF蛋白的B细胞抗原表位，每个潜在的表位都高于2个软件包设置的阈值，具有合适的长度和较高的抗原性。用同样的方法获得了其他4个谱系HEF蛋白的B细胞抗原表位（表5）。256FGCGD260、278NRVAA291和404YTKGETPFVK DYLSPP415这3个保守的B细胞抗原表位为IDV 的5个不同谱系共有；42YSMKTEPMTGF TNVTK57和302PGTYSI- KS309为 D/OK、D/Yama2019、D/Yama2016和D/CA2019这4个谱系共有，479GYFWGRSNGGGGGA492为D/660、D/Yama2019、D/Yama2016和D/CA2019这4个谱系共有。

3 讨论

IDV最早发现于有流感样病征的美国猪群，进一步的研究表明IDV在牛群中比在猪群中更普遍，这种病毒可能利用牛作为主要宿主，并与牛的呼吸道综合征密切相关[18]。在我国，IDV最早于2014年在山东的养牛场被发现[22]，随后研究人员在南方一些省份（广东、江苏、安徽和福建）的牛群或猪群中检测到该病毒[23-24]，这些毒株均属于D/OK谱系。2021年10月—2022年2月从中国广州市各地屠宰场采集的250份健康牛鼻拭子样本中鉴定出一株（D/bovine/CHN/JY3001/2021）属于D/Yama2019谱系的毒株，结果表明国内牛群中存在D/OK谱系和D/Yama2019谱系IDV毒株[25]。

IAV热稳定性和耐酸能力对其跨种传播能力具有重要作用。Yu等[26]通过反向遗传学研究表明HEF蛋白对IDV的热稳定性和耐酸能力起到关键作用，发现IDV较IAV、IBV和ICV具有较强的热稳定性和酸稳定性，因此推测IDV具有较广泛的组织嗜性和宿主感染性。本研究对5个不同谱系的IDV HEF糖蛋白经N-糖基化位点相关软件预测，最早发现的IDV毒株D/Swine/Oklahoma/1334/2011属于D/OK谱系，其HEF蛋白含有6个潜在的N-糖基化位点（N28，N54，N146，N346，N513，N613），日本流行的D/Yama2016谱系毒株一样只有6个潜在的N-糖基化位点；随着新的IDV谱系的发现，其潜在的N-糖基化位点也增多，D/660、D/ CA2019 和D/Yama2019谱系增加到7个，潜在的N390位N-糖基化位点为D/Yama2019谱系内毒株所特有，D/Yama2019谱系部分毒株甚至具有8个潜在的N-糖基化位点。潜在的N-糖基化位点增加可能进一步增强IDV毒株的热稳定性和耐酸能力，引起其免疫原性、组织嗜性、致病性以及宿主范围等发生变化。

抗原表位预测在疫病疫苗设计和基础科学研究中具有重大意义，在疫苗研究中使用生物信息学分析蛋白结构和预测表位成为大多数实验室的首选方案，获得的预测结果比常规试验更加准确和高效。基于人工神经网络的B细胞表位数预测的ABCpred和B细胞表面积预测IEDB[27]具有较高的抗原表位预测精度而成为最常用的2个预测工具。Wang等[28]采用ABCpred、IEDB和LBtope预测了24株ADV HE蛋白的B细胞抗原表位获得了5个保守的抗原表位。本研究预测的HEF蛋白B 细胞抗原表位均位于胞外区，在5个不同谱系中预测各获得11～12个抗原表位，其中有3个抗原表位是5个谱系的保守抗原表位，还有3个抗原表位是其中4个谱系的保守抗原表位。预测的抗原表位为选择合适肽段设计和制备多表位疫苗提供了理论依据，但仍需试验进行验证其免疫原性和免疫保护效果。

IDV在世界范围内的家畜（如牛和猪）中传播，扩散到包括猪在内的其他哺乳动物宿主。研究显示，人血清中也有D型流感病毒的特异性抗体，尤其是牛场工作人员血清阳转率非常高，这表明IDV存在感染人的风险[29]。因此，需要对IDV流行病学进行持续调查，尤其是人群中IDV流行情况，同时对其诊断方法、遗传进化规律、致病机制以及疫苗研发等相关问题进一步研究。■

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