褪黑素预处理对挤压综合征大鼠海马体中一氧化氮及其合酶的影响

【摘要】目的 探讨褪黑素（MT）预处理应用于挤压综合征（CS）大鼠对其海马体中一氧化氮（NO）合成及氧化应激指标的影响。方法 选取健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠30只，依据随机数字表法分为空白组（10只）、对照组（10只）、褪黑素组（10只）。褪黑素组大鼠尾静脉推注10 mL/kg体质量褪黑素溶液，空白组和对照组大鼠均无处理。给药30 min后建立CS大鼠模型。3组大鼠均进行麻醉处理，将对照组和褪黑素组大鼠双侧后肢根部用卡式止血带压迫4 h后恢复血流灌注，其中空白组大鼠麻醉后不进行任何处理。

3组大鼠均饲养至再灌注4 h。比较3组大鼠再灌注4 h后海马体中诱导性一氧化氮合酶（iNOS）和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达、NO含量、iNOS含量、氧化应激指标水平。结果 与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠海马体中的iNOS与NF-κB蛋白表达水平均升高，与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中的iNOS与NF-κB蛋白表达水平均降低；与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠的海马体中NO与iNOS含量均升高，与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中NO与iNOS含量均降低；与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠海马体中丙二醛（MDA）含量均增加，超氧化物歧化酶（SOD）活性均降低，与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中的MDA含量降低，SOD活性升高（均P<0.05）。结论 CS大鼠应用MT预处理能够抑制其海马体组织的氧化应激反应，并调节iNOS与NF-κB蛋白表达水平，降低iNOS的含量，抑制NO合成，减轻缺血再灌注损伤。

【关键词】挤压综合征 ; 缺血再灌注损伤 ; 褪黑素 ; 海马体 ; 一氧化氮 ; 氧化应激

【中图分类号】R642 【文献标识码】A 【文章编号】2096-3718.2024.17.0024.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.17.008

挤压综合征（crush syndrome， CS）主要是由富含肌肉的四肢或躯干受到外界持续挤压而引起，以酸中毒、高钾血症、急性肾损伤等为特点的临床综合征。受挤压肢体突然解除压迫后能够重新获得血液灌注，再灌注过程中会产生大量的氧自由基，引起机体氧化应激反应、炎症反应等，造成缺血再灌注损伤（IRI）。CS对原位器官与远隔器官都会造成损伤，若治疗不及时，会引起横纹肌溶解、急性肾损伤和多器官衰竭等，最终导致患者死亡[1]。目前，关于CS对远隔器官造成损伤的研究主要集中于肾脏和心脏，而其他部位较少[2]。海马体是大脑的重要结构，主要与学习、记忆、认知功能等相关，其损伤会引起认知功能障碍，这可能是CS引起脑组织损伤，导致认知功能障碍的原因。研究表明，当肌肉组织受到长期挤压后，诱导性一氧化氮合酶（iNOS）表达水平上升，会催化一氧化氮（NO）大量合成，导致NO含量增加，从而加重IRI [3]。褪黑素（MT）是由松果体分泌的一种调节激素，具有抑制炎症反应、清除氧自由基、抑制细胞凋亡、调节昼夜节律等作用。研究表明，MT能够抑制iNOS表达，降低NO的含量，有效减轻细胞氧化应激反应，抑制线粒体凋亡，进而减轻IRI[4]。基于此，本研究旨在探讨MT预处理应用于CS大鼠，对其海马体中NO合成及氧化应激指标的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague Dawley（SD）雄性大鼠[湖北省实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2020-0018]，大鼠6～8周龄，平均（7.1±0.6）周；体质量220～250 g，平均（228.90±8.46） g。饲养于牡丹江医学院实验动物中心，在恒温（22～26 ℃）且湿度适宜（40%～47%）的受控环境中，确保无噪音和光线干扰，同时提供充足的食物和水，以满足其生理需求。大鼠均按清洁级标准饲养，适应性饲养1周。本研究经牡丹江医学院动物医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 褪黑素（北京索莱宝科技有限公司，规格：1 g/瓶）；10%水合氯醛溶液（上海原叶生物科技有限公司，规格：100 mL/瓶）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；NO测定（硝酸还原酶法）试剂盒（南京建成生物科技研究所）；丙二醛测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。迷你双垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCZ-24DN）；多功能凝胶图像分析系统（上海天能生命科学有限公司，型号：2500R GIS）；全自动酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，型号：Cytation5）；高速冷冻离心机（力康生物医疗科技控股有限公司，型号：Neofuge 15R）；低温保存箱（三洋贸易株式会社，型号：MDF-436）。

1.3 研究方法

1.3.1 动物分组和干预 取健康SD雄性大鼠30只，依据随机数字表法分为空白组（10只）、对照组（10只）、褪黑素组（10只）。取100 mg褪黑素粉末溶于4 mL无水乙醇中，利用生理盐水稀释至100 mL，持续电磁力搅拌至粉末完全溶解，配制成褪黑素溶液。褪黑素组大鼠于5 min内尾静脉推注10 mL/kg体质量褪黑素溶液，空白组和对照组大鼠均无处理。给药后30 min造模。

1.3.2 CS大鼠模型构建 空白组大鼠只进行麻醉处理，对照组和褪黑素组大鼠均进行造模处理。采用10%水合氯醛溶液以3 mL/kg体质量对每组大鼠行腹腔注射麻醉后，对照组和褪黑素组大鼠参考Murata[5]的造模方法加以改进，使用卡式止血带对大鼠的双后肢根部进行挤压，压力相当于3 kg重物，当观察到大鼠的足趾由红润变为苍白呈缺血状，表示造模成功。对大鼠双侧后肢压迫4 h后，松开止血带，恢复血流灌注。再灌注4 h后，快速对3组大鼠进行断头取材。

1.3.3 大鼠海马体中iNOS蛋白和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达水平的测定 取大鼠海马体于-80 ℃冰箱中备用，使用低温超声裂解，离心（4 ℃，12 000 r/min，20 min）获取蛋白上清液。利用BCA法测定iNOS、NF-κB蛋白浓度。利用蛋白质印迹法检测iNOS、NF-κB蛋白表达水平，蛋白样品经加热变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；加入一抗iNOS、NF-κB（1∶500）和β-肌动蛋白（β-actin），以及标记有辣根过氧化物酶的二抗，通过化学发光法显色，利用凝胶图像分析系统记录图像。通过分析图像中蛋白条带的灰度值，以目的蛋白/β-actin蛋白的强度比值表示目的蛋白的表达水平。

1.3.4 大鼠海马体中NO含量的测定 将大鼠海马体组织与生理盐水按1 g∶9 mL的比例混合，并通过机械搅拌制成10%组织匀浆液，采用硝酸还原酶法测定匀浆液中NO的含量。取适量10 %组织匀浆液，以3 500 r/min离心10 min，取300 μL上清液。按照试剂盒说明书制备反应混合液，静置10 min，以3 500～4 000 r/min离心15 min，取适量上清液，向其中加入显色剂混匀，室温静置15 min后，在550 nm波长下使用酶标仪测定各孔的光密度（OD）值，测定NO的浓度。

1.3.5 大鼠海马体中iNOS含量的测定 10%组织匀浆液制备方法同上文1.3.4。取0.5 mL 10%组织匀浆液于离心管，将离心管置于液氮中10 min，室温放置，反复冻融3次。在冰浴条件下，超声3 s，间歇4 s，共4次。离心（12 000 r/min，4 ℃，30 min）后取上清，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠海马体组织中iNOS的含量。

1.3.6 大鼠海马体组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 10%组织匀浆液制备方法同上文1.3.4。取适量匀浆后分别按照试剂盒说明书测定MDA含量、SOD活性。MDA含量=[（样品管OD值－对照管OD值）/标准管OD值]×标准品浓度/匀浆液中蛋白浓度；SOD活性=[（对照管OD值－样品管OD值）/对照管OD值]/50%×（反应液总体积/匀浆液取样量）/匀浆液中蛋白浓度。

1.4 观察指标 ⑴大鼠海马体组织中iNOS蛋白与NF-κB蛋白表达水平。利用蛋白质印迹法检测3组大鼠再灌注4 h后海马体组织中iNOS蛋白与NF-κB蛋白表达水平。⑵大鼠海马体中NO与iNOS含量。再灌注4 h后，采用硝酸还原酶法测定大鼠海马体中NO含量；利用ELISA法检测大鼠海马体组织中的iNOS含量。⑶大鼠海马体氧化应激指标水平。分别测定3组大鼠再灌注4 h后海马体组织中MDA含量与SOD活性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件分析数据，计量资料经S-W法检验证实符合正态分布且方差齐，以（ x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠海马体组织中iNOS蛋白与NF-κB蛋白表达水平比较

与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠海马体组织中的iNOS蛋白、NF-κB蛋白表达水平均升高；与对照组比，褪黑素组大鼠海马体组织中的iNOS蛋白、NF-κB蛋白表达水平均降低，差异均有统计学意义（均P<0.05），见图1、表1。

2.2 3组大鼠海马体组织中NO与iNOS含量比较

与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠的海马体中NO与iNOS含量均升高；与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中NO与iNOS含量均降低，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表2。

2.3 3组大鼠海马体组织MDA含量与SOD活性比较

与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠海马体内MDA含量均增加，SOD活性均降低；与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中的MDA含量降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义（均P<0.05），见表3。

3 讨论

CS又称为横纹肌溶解症，通常发生在地震、山体滑坡等自然灾害和战争、踩踏等人为灾害中，死亡率较高，是仅次于直接灾害的第二大死亡原因[6]。CS治疗以补液为主要措施，早期输液可以治疗高钾血症，预防患者休克和急性肾衰竭，但很难对IRI诱导的氧化应激反应、炎症反应等起作用。在血液再灌注过程中，氧自由基水平升高，细胞因子和其他炎症因子的参与，以及NO大量合成等均会加重缺血组织损伤，甚至导致器官衰竭。

MT是一种激素和自由基清除剂，主要在松果体中合成，具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等。研究表明，MT可以减轻CS大鼠的氧化应激损伤，并提高大鼠的存活率[7]。MT作为活性氧清除剂，可以保护线粒体结构的完整性，抑制炎症反应，有助于减轻血液再灌注导致的组织损伤，增加机体MT含量可能成为改善IRI的有效方法[8]。

NO作为一种重要的信号传递分子，参与机体多种生理反应。在病理状态下，iNOS被激活，能够催化NO大量合成，诱导氧化应激反应，造成脑组织损伤。NF-κB是一种核转录因子，被激活后可调节多种炎症因子的表达，加重缺血组织的损伤，还可促进氧自由基的释放，在缺血再灌注损伤过程中起着重要调节作用[9]。NF-κB是NO合成过程中的转录调节因子，在NO的合成过程中起着重要的作用。激活后的NF-κB会上调iNOS的表达，并诱导机体合成大量NO，可能加速神经元的损伤或死亡[10]。在本研究中，与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠海马体组织中的iNOS蛋白与NF-κB蛋白表达水平均升高；与对照组比，褪黑素组大鼠海马体组织中的iNOS蛋白与NF-κB蛋白表达水平均降低。这提示MT预处理能有效抑制大鼠海马体中iNOS蛋白与NF-κB蛋白的表达。分析其原因可能为，CS大鼠双侧肢体解除压迫后，血流再灌注导致炎症因子和氧自由基大量产生，通过血液循环诱导大鼠海马体中的NF-κB的蛋白表达，上调iNOS蛋白表达。MT可以阻断NF-κB的转录过程，进而抑制其蛋白表达，并降低iNOS蛋白的表达水平[11]。

本研究结果显示，与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠的海马体中NO与iNOS含量均升高；与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中NO与iNOS含量均降低。这提示MT预处理可以降低大鼠海马体中iNOS的含量。分析其原因为，iNOS是NO合成过程中的关键酶，在催化NO合成中发挥重要作用，而MT预处理降低大鼠海马体中iNOS含量，影响NO合成过程，进而导致NO含量降低。

SOD是一种关键的抗氧化酶，能够通过歧化反应清除细胞内的超氧自由基，其活性升高能有效减轻细胞内氧化应激反应；MDA是自由基与脂质发生氧化反应的终产物，其含量升高反映了氧化应激损伤加重。在本实验中，与空白组比，再灌注4 h后，对照组和褪黑素组大鼠海马体内MDA含量均增加，SOD活性均降低；与对照组比，褪黑素组大鼠海马体中的MDA含量降低，SOD活性升高。这提示MT预处理可以减轻大鼠海马体中的氧化应激反应程度。

综上，MT预处理可以抑制CS大鼠海马体内氧化应激反应，并通过下调iNOS蛋白与NF-κB蛋白表达，降低iNOS的含量来影响NO的合成，降低NO含量以减轻IRI，发挥保护海马体组织的作用。但本研究仍存在考察指标较少、褪黑素最佳给药剂量不明确的局限，后续应针对给药剂量开展深入研究，并增加相应的考察指标。

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基金项目：2021年度黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（编号：2021-KYYWF-0511）

作者简介：王兆宇，2021级在读硕士生，研究方向：临床麻醉。

通信作者：张月顺，硕士研究生，主任医师，研究方向：临床麻醉。E-mail：zhangyueshun1968@163.com