畲药十二时辰醇提物外用对大鼠佐剂性关节炎的抗炎作用研究

【摘 要】 目的：探讨畲药“十二时辰”醇提物外用对类风湿性关节炎模型大鼠的治疗作用。方法：SD大鼠随机分为正常对照组，模型组，高、低剂量十二时辰治疗组和阳性对照组。采用大鼠右后足趾皮内注射完全弗氏佐剂制作类风湿性关节炎模型，致炎后采用十二时辰醇提液浸泡涂抹方式给药，模型组及阳性对照组分别给予生理盐水或扶他林涂抹，持续给药28 d。于给药前和给药后每7 d测定足趾容积，给药结束，HE染色检测各组大鼠的组织病理学改变，Elisa方法测定血清IL-1β及RF含量。结果：模型组大鼠在各时间点的足趾肿胀度显著高于正常对照组（P<0.05），血清IL-1β及RF含量显著升高（P<0.01），足趾关节病理破坏明显；高剂量十二时辰醇提液外用可显著降低大鼠的足趾肿胀度（P<0.05），降低血清IL-1β及RF含量（P<0.01），改善关节病理损伤。结论：畲药十二时辰醇提液外用可降低佐剂性关节炎大鼠足肿胀，改善病理损伤，降低血清炎症因子IL-1β及RF含量。

【关键词】 重瓣铁线莲；十二时辰；外用；类风湿性关节炎

【中图分类号】R29

【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2024）17-0023-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.17.zgmzmjyyzz202417007

Research on the Anti-inflammatory Effect of External Application of the Ethanol Extract of

Clematis florida on Adjuvant-induced Arthritis in Rats

ZHOU Chunquan LEI Ting ZHAO Li ZHANG Jizhou JIANG Chang HAN Jing^* WANG Gong^*

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China

Abstract：Objective To explore the therapeutic effect of external application of the ethanol extract of She medicine “Shi Er Shi Chen” （Clematis florida） on rats with rheumatoid arthritis. Methods SD rats were randomly divided into the normal control group， the model group， the high-dose Clematis florida ethanol extract treatment group， the low-dose Clematis florida ethanol extract treatment group， and the positive control group. Rheumatoid arthritis model was established by intradermal injection of complete Freund’s adjuvant into the right hind paw of the rat. After inflammation induction， the rats were treated with ethanol extract of Clematis florida by soaking the paw into the extract. The model group and the positive control group were treated with saline or diclofenac sodium cream， respectively. The rats were continuously administered for 28 days. The hind foot volume was measured before and every 7 days after administration and the paw swelling rate was calculated. HE staining was used to detect the histopathological changes of the foot tissues at the end of the treatment， and Elisa method was used to measure the serum IL-1β and RF levels. Results The paw swelling degree of rats in the model group was significantly higher than that in the normal control group at each time point（P<0.05）， and the serum IL-1β and RF levels were significantly increased（P<0.01）. HE staining showed that the pathological damage of toe joint was obvious. External application of high-dose Clematis florida ethanol extract could significantly reduce the paw swelling degree of rats （P<0.05）， decrease the serum IL-1β and RF levels （P<0.01）， and improve the pathology damage of toe joint.Conclusion External application of Clematis florida ethanol extract can reduce the paw swelling and improve the pathological damage in adjuvant-induced arthritis rats， as well as decrease the serum levels of inflammatory factors IL-1β and RF.

Key words：Clematis florida; She Medicine “Shi Er Shi Chen”；External Application; Rheumatoid Arthritis

“十二时辰”为毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb.Var.plena D.Don的干燥根，是福建省福安民间畲族习用药。据《福安畲医畲药》^［1］记载，此药性温，味辛，具有通经活络、通关窍、祛风除湿、活血止痛、理气通便、利尿等功效，在闽东畲族地区被广泛用于风湿骨痛及跌打损伤等病症，民间主要用法是将十二时辰泡酒，药液涂抹于关节肿痛部位，取得较好的疗效。本课题组前期对十二时辰醇提液皮肤用药的急、慢性毒性进行了观察，未发现十二时辰醇提液的皮肤急、慢性毒性，表明十二时辰醇提液是较安全的外用药^［2-3］。但迄今尚未见评价十二时辰提取物外用药效的研究。本研究采用弗氏完全佐剂关节炎大鼠模型，观察十二时辰醇提液外用对关节肿胀及血清炎症因子的作用，为十二时辰进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0008，SPF级，体重（180±20）g，光照周期12 h/12 h下饲养，自由饮食。实验前适应性喂养3 d。

1.2 试药 十二时辰生药（批号：20221023）购自福建福安。经鉴定为毛茛科植物重瓣铁线莲的干燥根。将药材粉碎，用70%乙醇加热 90 ℃回流提取2次，70 ℃减压浓缩，制备成生药量2.7 g/mL的醇提液备用。

1.3 试剂 扶他林（GSK Consumer Healthcare S.A.；质量注册证号：20181225）；弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA，批号：P2036，购自Beyotime公司），白介素-1β（IL-1β）及类风湿因子（rheumatoid factor，RF）购自凯基生物科技有限公司。HE染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.4 大鼠佐剂性关节炎模型制备及分组给药 SD大鼠随机分为5组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、十二时辰高剂量组、十二时辰低剂量组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠于左后足趾注射0.1 mL完全弗氏佐剂FCA致炎。十二时辰给药组于致炎后第二天即分别给予高、低剂量醇提液（2.7 g/mL和1.35 g/mL）浸泡涂敷于患侧足趾，阳性对照组每只足趾外涂扶他林0.2 g，每日1次，持续给药28 d。模型对照组及正常对照组给予生理盐水外涂。

1.5 大鼠足趾肿胀度检测 在给药前与给药后每7 d，采用足趾容积测量仪检测足爪容积，对比各组大鼠不同时间点足体积变化情况，按下列公式计算各组大鼠足趾肿胀度：足趾肿胀度=（造模后足趾容积-造模前足趾容积）/造模前足趾容积

1.6 血清炎症因子测定 最后一次检测足趾容积结束，大鼠在戊巴比妥钠麻醉状态下处死，进行腹主动脉采血5 mL，5000 g离心10 min，分离血清，采用Elisa方法按照试剂盒说明书测定血清IL-1β及RF含量。

1.7 HE染色 大鼠采血后处死，取左侧踝关节标本，置于4%多聚甲醛中固定，然后在EDTA脱钙液中置于恒温摇床进行脱钙处理，进行常规脱水石蜡包埋，切5 μm厚片。大鼠切片使用二甲苯进行脱蜡，然后经梯度乙醇脱水，在苏木素染液中染色5 min，1%盐酸乙醇分化处理30 s，0.2%氨水中反蓝处理，用0.5%伊红染色10 min，每步染色完成后用蒸馏水冲洗，最后经梯度乙醇脱水处理，然后采用中性树胶封片。在光镜下拍照并分析图像。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析进行统计检验，组间两两比较在符合正态分布且方差齐时采用LSD-t检验；符合正态分布且方差不齐时采用Games-Howell法检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 十二时辰醇提物对大鼠足趾肿胀度的作用 与正常组大鼠相比，模型对照组大鼠足趾肿胀明显，与正常组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01）；造模后给予十二时辰外用涂敷给药，高剂量组大鼠足趾肿胀度较模型组显著降低，自给药第21天开始与模型组比较有显著差异（P<0.05，P<0.01），治疗效果与阳性对照组比较无显著差异（P>0.05）。十二时辰低剂量给药组足趾肿胀度无明显改善。

2.2 十二时辰醇提物对关节炎大鼠血清IL-1β及RF的作用 与正常对照组比，关节炎模型大鼠血清IL-1β与RF含量显著升高（P<0.01），十二时辰高剂量给药组可显著降低血清IL-1β与RF含量（P<0.01），低剂量给药组可降低血清IL-1β含量，但对RF含量无作用。与阳性对照组比较，十二时辰高、低剂量组对IL-1β含量的降低效果不如阳性对照药（P<0.01）；十二时辰高剂量组对RF含量的作用与阳性对照组无显著差异（P>0.05）。

2.3 十二时辰醇提物对大鼠足趾关节病理损伤的作用 正常对照组大鼠关节滑膜组织结构正常，无炎症细胞浸润，关节骨质无损伤，关节结构完整；模型组大鼠关节腔内滑膜组织增生严重，炎症细胞大量浸润。十二时辰高剂量组滑膜组织增生较模型组有一定程度的改善，关节骨质基本正常，与阳性对照组病理损伤程度近似（图1）。

3 讨论

类风湿关节炎（rheumatoida rthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎病变为基本的病理改变，随着病程的进展，会侵袭关节软骨，造成关节结构的破坏^［4］。大鼠佐剂性关节炎模型能较好地模拟人的类风湿关节炎症状及病理表现，是用于评价和筛选抗炎免疫类药物的经典模型^［5］。本研究在模型大鼠足趾注射弗氏完全佐剂，可诱发关节肿胀，发生与RA类似的滑膜组织增生、炎症细胞浸润、关节软骨破坏等病理表现，同时，血清炎症因子IL-1β及类风湿因子RF显著升高。IL-1β是一种重要的血清炎症因子，主要由单核巨噬细胞产生，参与局部组织的炎症反应，在炎症、免疫激活、细胞分化与死亡的过程中，其表达水平会显著提高。IL-1β是类风湿关节炎炎症反应中的关键因子，参与了关节损伤和骨质破坏的过程。高水平IL-1β与类风湿关节炎的疾病活动性和严重程度相关，它被视为是评估类风湿关节炎病情的一个有效指标^［6］。RF是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。RF在RA患者中的阳性率较高，是RA的诊断指标之一。RF的滴度与RA的活动性和严重性相关，可用来监测病情的变化^［7］。

十二时辰是毛茛科铁线莲属植物，该属许多植物因含有特殊的代谢物而具有一定的药用价值^［8］。既往研究表明，十二时辰含有氨基酸、蛋白质、糖类、皂苷、生物碱、黄酮、有机酸、挥发油等化学成分^［9］，其含有的皂苷类成分被证实具有一定的抗肿瘤作用^［10］，从十二时辰原植物重瓣铁线莲中分离得到的三萜皂苷具有体内外的抗炎药效^［11］。十二时辰作为一种民族药，在闽东畲族地区有着广泛的应用，民间主要用途是泡酒外用治疗关节肿痛。本研究结果显示，外用高剂量十二时辰醇提液可显著减轻佐剂性关节炎大鼠的足趾肿胀，改善病理损伤，并且对血清IL-1β和RF的升高有显著的抑制作用。这些结果表明，十二时辰外用具有较好的改善类风湿性关节炎症状的药效。

本研究结果为十二时辰的临床实际应用提供了理论上的佐证，为十二时辰药效和药理机制的进一步研究以及相关产品的开发奠定了理论基础。

参考文献

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（收稿日期：2023-12-06 编辑：刘 斌）