一株秸秆降解菌株的筛选及降解效果研究

文章编号1000-5269（2024）05-0118-07 DOI：10.15958/j.cnki.gdxbzrb.2024.05.16

摘要：目前，农作物秸秆还田面临着时间长、腐熟慢、腐殖质转化低等问题，还田过程中添加秸秆降解功能菌株能有效地解决这一弊端。以腐败秸秆和土壤作为菌源，分离筛选得到一株对木质纤维素有较好降解能力的菌株TP-125，结合形态学和分子生物学将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，摇瓶培养获得TP-125的最佳指数生长期为22h；通过产酶培养基发酵，菌株TP-125的滤纸酶活在第5天达到最高，为16.76U/mL；内切β-葡聚糖酶活在第6天达到最高，为22.16U/mL。将筛选出的优势降解菌TP-125发酵为菌液同市场上所售3种腐熟剂对比，接种至油菜、玉米、辣椒和薏仁米4种秸秆，掩埋至土中进行降解腐熟。腐熟14d后，结果显示：TP-125的综合秸秆降解效果稳定且不弱于其他3种市售的腐熟剂，对油菜秸秆纤维素、木质素和半纤维素的降解率达28.30%、30.80%和53.40%，腐殖质碳含量最大，达到328.22g/kg。综上所述，菌株TP-125在降解农作物秸秆方面有较好的应用潜力，可作为农作物秸秆腐熟剂的候选菌株。

关键词：农作物秸秆；纤维素降解菌；分离鉴定；枯草芽孢杆菌 中图分类号：X712 文献标志码：A

秸秆是成熟农作物茎叶（穗）部分的总称，是重要的可再生能源［1］，其组分包含少量的果胶、灰分、蛋白质、纤维素（30%～50%）、半纤维素（15%～35%）和木质素（10%～25%）等［2-3］。据统计，1981—2020年我国农作物秸秆总量增长了4.39×108t，总体呈不断增长的趋势［4］。2022年，全国秸秆资源总量8.56×108t，可收集秸秆资源量7.22×108t，秸秆综合利用率达到87.6%［5］。目前，国内秸秆资源化利用以五料化利用为主，包括肥料、饲料、基料、燃料和原料［7-8］，分别占全部利用量的54%、23%、5%、14%、4%［9］。由此可见，目前秸秆肥料化仍然是我国的主要秸秆综合利用方式。

研究表明秸秆直接还田仍存在众多弊端，如秸秆中的病虫卵容易引发作物病虫害，秸秆腐解过程中会吸收原有土壤水分、氮素、磷素，最终影响作物出苗、生长，造成减产［10］。秸秆经充分腐熟处理后可以有效解决秸秆BQBS4Eg+inIt5DxKE+fsU6JKjNn2sPkWF4FEcho6+go=直接还田所携带虫卵导致的病虫害等问题，同时能有效提升土壤肥力，增加土壤中腐殖质含量和结合态腐殖质总含量，还能促进植物生长，提高作物产量［11-14］。

目前，利用微生物降解秸秆是一种极具发展潜力的方法，通过微生物途径对秸秆进行快速腐熟还田具有重要意义。对大自然中分离出的纤维素降解菌的报道以探究菌株的酶活或者其产品的生产潜力较多，如李金业等［15］从柑橘废弃物堆肥中筛选出高效木质素降解菌用于固体废弃物的资源化利用；LI等［16］将一种新分离的木质纤维素降解菌RaoultellaornithinolyticaTH-21用于生产2，3-丁二醇；王秋颖等［17］由食用菌菌渣高温堆肥中分离木质纤维素高效降解菌，并测定其酶活判断其应用于菌渣高温堆肥处理的潜力。因此，本研究以腐败秸秆和腐质土壤作为菌源，以期分离筛选获得对木质纤维素有较好降解能力的功能微生物，实现ZPj/eSxPYrhxqqvkaNdK2y3lW8gHg6+ePe9b2cmVcq4=秸秆的快速腐熟，为秸秆肥料化提供切实可行的方案，同时也为木质纤维素降解机制研究奠定基础。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1供试样本

菌株分离样本采于贵州贵安新区的腐败秸秆和土壤。

1.1.2培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高温灭菌25min。

驯化培养基：秸秆10g（粉碎过40目筛，50℃烘干至恒重），蒸馏水100mL，pH7.0，121℃灭菌20min。

选择培养基：羧甲基纤维素钠10g，磷酸二氢钾2g，硫酸铵4g，硫酸镁0.244g，蛋白胨1g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.0，121℃灭菌20min。

产酶发酵培养基：羧甲基纤维素钠20g，葡萄糖10g，氯化钠1.5g，硫酸铵2g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1L，pH7.5～8.0。

1.2实验方法

1.2.1菌株的分离筛选

1）纤维素降解细菌的驯化

采集腐败的油菜秸秆和贵州省某农田的腐殖化土壤作为筛菌样品来源，以油菜秸秆作为唯一碳源对环境样品中的微生物进行驯化。分别称取各环境样品10.0g加入含有90.0mL无菌蒸馏水中，震荡培养30min制备成悬浮液，再吸取10mL悬浮液加入驯化培养基中，30℃、150r/min震荡培养2d，此步骤重复2次完成驯化。

2）纤维素降解细菌的分离纯化

采用平板稀释涂布法进行菌株的分离。驯化结束后，取1.0mL各培养液分别置于15mL离心管中，用无菌水梯度稀释成10-5～10-8的菌液。每个稀释梯度各吸取200μL菌液涂布于LB固体培养基上，将培养基放入30℃恒温培养箱倒置培养2d。观察在培养基上长出的菌落，根据菌落的大小、颜色和表面纹饰等特征，挑取体型较大的菌株，在LB固体培养基上进行多次纯化，以获得纯菌株为准。

3）纤维素降解细菌的初筛

利用刚果红显色实验对菌株的纤维素降解能力进行筛选。将分离纯化得到的菌株接种于刚果红显色培养基上，30℃下恒温培养2d。培养结束，测量菌株直径（d），再用1g/L刚果红染液染色30min，染色结束后，弃去染色液，用1mol/L氯化钠溶液脱色30min，量取水解圈直径（D）。计算水解圈直径与菌株直径比值D/d，当D/d>2时，则认为该菌株的纤维素降解能力较好。

4）纤维素降解细菌的复筛

将初筛得到的水解圈直径与菌落直径比值较大的菌株接种于羧甲基纤维素钠产酶培养基中进行纤维素酶活测定。

1.2.2菌株的鉴定

结合形态学和分子生物学联合分析对具有纤维素降解能力的菌株进行鉴定。将筛选得到的细菌在LB固体培养基上划线培养24h，参考《伯杰细菌鉴定手册》记录菌株的形态学鉴定，包括菌落大小、正反面颜色、生长速度，菌落质地、菌落表面纹饰和菌落边缘状态。用Solarbio/索莱宝公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA，引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息如表1所示。PCR反应体系为25μL：包括50mmol/LMgSO412.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O9.5μL。程序：95℃预变形5min，94℃变形30s，57℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环；PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将测得的序列在美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）上进行序列比对和同源性分析，以确定测序结果准确性。确定序列无误后，剪掉初始部位序列和终止部位序列，用MEGA7.0软件采用最大似然法（maximumlikelihoodmethod）构建系统发育树。

1.2.3菌株生长曲线的绘制

将菌株种子液接种至LB液体培养基中，于30℃、150r/min的恒温振荡培养，每隔2h取一次菌液，测量OD600的吸光度。以培养时间t为横坐标，OD600的吸光度为纵坐标，绘制菌株的生长曲线，以观察其生长周期，确定其各菌的对数生长期。

1.2.4菌株纤维素酶活测定

滤纸酶活是指纤维素酶消耗滤纸而显示的纤维素酶总活力，反映的是所测样品中纤维素酶组分协同作用的总效果。滤纸酶活力越高，纤维素酶总活力越高。本实验选用DNS法测定酶活力。

1）粗酶液的制备

将菌株在LB液体培养基中培养至对数生长期，作为下一步细菌产酶培养用的种子液。将种子液以5%接种量接种至50mL产酶发酵培养基中，30℃、150r/min连续培养一周。每日取发酵液5mL，4℃、10000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。

2）滤纸酶活测定

比色管中分别加入1cm×6cm滤纸条，加入1.5mL柠檬酸钠缓冲溶液和0.5mL粗酶液，以煮沸灭活10min的酶液为对照。50℃水浴1h后向各试管加入3mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸5min后取出，立即用流水冷却至室温后定容至20mL，于紫外分光光度计波长540nm处测定吸光度。在葡萄糖标准曲线上查出还原糖含量，通过公式换算酶活力值。

3）内切β-葡聚糖酶活测定

获得粗酶液后，比色管中分别加入1%羧甲基纤维素钠1mL，后续实验步骤同2）。

4）葡萄糖标准曲线的绘制

取7只试管依次加入1.0mg/mL的葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2mL，并从1到7进行编号，所有试管加入无菌水定容至2mL，立即摇匀，其余步骤与样品测定一致。所测数据以葡萄糖浓度为y轴，吸光度差为x轴画出标准曲线。葡萄糖标准曲线如图1所示。图1中R2>0.95，证明其吸光度与葡萄糖浓度的线性关系可靠，可以作为标准曲线。

1.2.5菌株降解效果测定

1）将发酵好的种子液按5%接种于发酵培养基中发酵48h制成菌液备用。收集油菜、玉米、辣椒、薏仁米秸秆若干，用粉碎机粉碎至1～2cm大小，称取100g粉碎的秸秆装入40目的尼龙袋中，100g粉碎的秸秆按20mL菌液添加，保持湿度为70%。以不处理的秸秆作为对照，市场上购买的菌剂（市场一号、市场二号、市场三号）作为阳性对照，每组3个平行，3次重复。各秸秆腐熟剂成分见表2。接种完菌剂的秸秆同尼龙袋一起埋入土壤，以土壤全部覆盖尼龙袋即可。14d后取出秸秆，测定4种秸秆的木质纤维素降解率以及腐殖质含量变化来评估菌株TP-125对秸秆的降解效果。

2）纤维素、半纤维素、木质素及腐殖质的测定

实验采用范式洗涤法对秸秆纤维素、半纤维素、木质素进行测定［19］，使用焦磷酸钠-氢氧化钠提取、重铬酸钾氧化法测定秸秆腐殖质含量。

2结果与讨论

2.1降解菌的分离、筛选、鉴定

实验中以腐败秸秆和腐殖化土壤为样本菌源，通过驯化培养，分离、筛选得到1株纤维素降解能力较好的细菌，命名为TP-125。利用刚果红染色法对细菌TP-125进行纤维素降解能力鉴别，结果如图2（a）所示，菌落直径d=0.57±0.20cm，水解圈直径D=1.63±0.13cm，水解圈直径与菌株直径的比值（D/d）达到2.86。细菌TP-125在LB生长迅速，如图2（b）所示。菌落形状为圆形，呈乳白色，表面隆起、有光泽，菌落直径2mm左右，边缘整齐。利用16SrRNA基因构建系统发育树，如图3所示。菌株TP-125与菌株Bacillussubtilis聚到一起，形成明显的分支。结合菌株的形态学和分子生物学将菌株TP-125鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。

2.2菌株TP-125的生长曲线测定

菌株TP-125的生长曲线如图4所示。菌株在0～10h处于迟缓期，菌种逐渐适应培养环境，新陈代谢活动变得活跃；10～28h处于对数期，菌株代谢活动最为旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定；28h后菌株转为稳定期，新增细胞数目与死亡细胞数目达到动态平衡，繁殖速度逐渐减慢。根据菌株TP-125的生长曲线检测，确定该菌种的最佳培养时间为22h。

2.3菌株TP-125的纤维素酶活测定

菌株TP-125的滤纸酶活与内切β-葡聚糖酶活测定结果如图5所示。在不同培养时间下，TP-125的酶活有所不同。TP-125的滤纸酶活与内切β-葡聚糖酶活呈先增加后降低的趋势，其中TP-125的滤纸酶活在第5天最高，酶活为16.76U/mL。TP-125的内切β-葡聚糖酶活在第6天最高，酶活为22.16U/mL。

2.4秸秆腐熟降解实验

2.4.1纤维素降解率对比

TP-125对油菜、玉米、辣椒、薏仁米4种秸秆纤维素降解率结果如图6所示。油菜秸秆处理组，纤维素的降解率排序为市场一号＞TP-125＞市场三号＞自然腐熟＞市场二号，市场一号达39.54%，TP-125达28.30%，优于市场二号和三号的表现。玉米秸秆的纤维素降解实验中，各处理组的排序为市场三号＞市场二号＞TP-125＞自然腐熟＞市场一号，TP-125对玉米秸秆的降解率达29.29%。薏仁米秸秆的纤维素降解实验中，TP-125的降解效果最好，达48.86%，优于所有市场上购买的菌剂。辣椒秸秆的纤维素降解率的排序为市场一号＞市场三号＞TP-125＞市场二号＞自然腐熟，TP-125的降解率达到24.42%。

在秸秆腐熟降解实验中，各个秸秆处理组对不同腐熟剂的处理效果有所不同，有的甚至会低于自然腐熟的效果，如油菜秸秆降解实验中市场二号处理组，玉米秸秆降解实验中市场一号组，薏仁米秸秆降解实验中市场一号处理组。其中，市场二号对油菜秸秆的降解效果只有3.21%，自然腐熟达19.84%，与自然腐熟的结果相差最大。该结果与周淑霞等［20］得到的不同有机物料腐熟剂对麦秸的降解结果相似，经分析可能与秸秆结构、微生物不同有关。而TP-125在不同秸秆的纤维素降解实验中，均有优于自然腐熟的表现。

综上所述，TP-125对油菜、玉米、辣椒、薏仁米4种不同秸秆的降解效果都较好，降解效果稳定。TP-125明显增加了秸秆中纤维素的降解率，对纤维素的降解率不弱于市售腐熟剂，且具有降解多种秸秆的潜力。

2.4.2半纤维素、木质素降解率含量变化

油菜秸秆降解实验中的木质素、半纤维素的降解率结果如图7所示。半纤维素的降解实验中，TP-125处理组的降解效果（降解率达53.40%）排第二，仅弱于市场二号（降解率达62.94%）。木质素的降解实验中，TP-125处理组降解效果最好，木质素的降解率达到了30.80%，其次是市场二号，木质素的降解率达23.66%。

木质素作为硬固的结壳类物质包裹在木质纤维素的最外层，是木质纤维素类生物质具有异质性和坚韧的抗性的重要原因［21］。降解实验中，TP-125处理组以单菌株优于腐熟剂中的复合微生物。这与MEI等［22］分离出的一株淀粉芽孢杆菌SL-7的结果相似。实验15d后，木质素的降解率可达28.55％。经分析，其原因可能与芽孢杆菌所产锰过氧化物酶（MnP）、木质素过氧化物酶（Lip）、漆酶（Lac）有关，所以TP-125菌株的木质素强降解率可能源于其芽孢杆菌所产的大量木质素过氧化物酶。

2.4.3腐殖质含量变化

油菜秸秆的降解实验中，各处理组最终腐殖质总碳量的结果如图8所示。腐殖质中碳是其中的主要物质，测定腐殖质总碳量可判断各处理组的油菜秸秆降解效果。各处理组腐殖质总碳量大小为TP-125＞自然腐熟＞市场一号＞市场三号＞市场二号。菌株TP-125处理组腐殖质碳含量最大，达到328.22g/kg，优于其他各处理组。

3结论

由腐败秸秆和土壤中通过驯化选择培养筛选得到一株能有效降解秸秆木质纤维素的细菌TP-125，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。本研究筛选分离细菌TP-125，以多种农作物秸秆为实验对象进行秸秆降解，重点监测了油菜秸秆的木质素、半纤维素和腐殖质的降解效果。研究结果可为油菜秸秆的资源化利用提供技术支撑。对于腐熟快、专一性、本土化的农作物秸秆腐熟剂的研发有极大帮助。

通过对TP-125滤纸酶活与内切β-葡聚糖酶活的测定，滤纸酶活最高可达16.76U/mL，内切β-葡聚糖酶活最高可达22.16U/mL，具有木质纤维素降解潜力。秸秆腐熟降解实验结果显示：筛选出的优势菌株TP-125对秸秆有一定的降解效果，对于油菜秸秆，其纤维素、木质素和半纤维素的降解率分别达28.30%，30.80%和53.40%，具有降解油菜秸秆的潜力。与市售腐熟剂相比，TP-125对油菜秸秆中木质素的降解效果有明显优势。总之，TP-125作为单菌株与市售腐熟剂对比，对不同秸秆的降解能力稳定，可作为农作物秸秆腐熟剂的候选菌株。但本实验未对秸秆降解过程中的变化进行测定分析，其过程中TP-125的具体产酶趋势与酶对木质纤维素的降解途径有待研究解决。

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（责任编辑：周晓南）

Abstract：

Atpresent，cropstrawreturningtothefieldisfacedwithsomeproblems，suchaslongtime，slowmaturityandlowhumustransformation，whichcanbeeffectivelysolvedbyaddingstrawdegradationbacteriaintheprocessofreturningcropstrawtothefield.Inthisstudy，usingrottenstrawandsoilasbacterialsources，astrainTP-125withgoodabilitytodegradelignocellulosewasisolatedandscreened.Combinedwithmorphologyandmolecularbiology，thestrainwasidentifiedasBacillussubtilis，andthebestexponentialgrowthperiodofTP-125was22h.Throughenzyme-producingmediumfermentation，thefilterpaperenzymeactivityofstrainTP-125reachedthehighestonthe5thday，whichwas16.76U/mL.TheactivityofEndo-β-glucanasereachedthehighestlevelonthe6thday，whichwas22.16U/mL.ThefermentationbrothofthedominantdegradingbacteriaTP-125wascomparedwiththreekindsofripeningagentssoldonthemarket，andinoculatedintorape，corn，pepperandbarleystraw，buriedinthesoilfordegradationandmaturity.After14daysofmaturity，theresultsshowthatthecomprehensivestrawdegradationeffectofTP-125isstableandnotweakerthantheotherthreematurityagentsofthemarket，amongwhichthedegradationeffectofCoixseedstrawisthebest，andthedegradationratesofcellulose，lignin，andhemicelluloseinrapeseedstrawis28.30%，30.80%，and53.40%，respectively，thecarboncontentofhumusisthehighest，reaching328.22g/kg.Tosumup，strainTP-125hasagoodapplicationpotentialinthedegradationofcropstrawandcanbeusedasacandidatestrainforcropstrawdecompositionagent.

Keywords：

cropstraw;cellulolyticbacteria;isolationandidentification;bacillussubtilis

收稿日期：2024-07-03

基金项目：中央财政生态资源保护（农作物秸杆综合利用）资助项目（P52000020230009V6）

作者简介：冉一智（2002—），男，贵州大学资源与环境工程学院2020级环境工程专业在读本科生，E-mail：18311793690@163.com.

*通讯作者：李江，E-mail：jli82@gzu.edu.cn.