北沙参化感作用对其种子萌发及幼苗生长的影响

摘要：探究北沙参根系研磨液及其根际土壤浸提液对北沙参种子萌发及幼苗生长的影响，以初步确定北沙参化感自毒作用的存在。本试验先制备0.05 g/mL的北沙参根系研磨液（RT）和0.50 g/mL的根际土壤浸提液（ST），继而测定其对北沙参种子萌发、幼苗生长及其生理生化指标的影响。结果表明：RT与ST对北沙参种子萌发有显著抑制作用：其幼苗生长也受到较大影响，根长、株高、根粗与鲜重大多显著降低，叶片总叶绿素含量显著下降，类胡萝卜素含量显著升高。两处理幼苗叶片的PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、电子传递速率（ETR）、PSⅡ潜在活性（Fv/Fo）、光化学猝灭系数（qP）、实际光化学效率[Y（Ⅱ）]均受到明显抑制；幼苗渗透调节系统受到显著影响，叶片脯氨酸、可溶性蛋白含量显著升高，可溶性糖含量显著降低：幼苗叶片的抗氧化系统响应胁迫后超氧化物歧化酶活性显著降低，抗坏血酸过氧化物酶活性显著升高，丙二醛含量显著增加。综之，北沙参根系研磨液及其根际土壤浸提液中存在化感自毒物质，影响北沙参种子萌发与幼苗生长，且化感自毒作用可能是北沙参连作障碍产生的主要原因之一。

关键词：北沙参；化感自毒；连作障碍；种子萌发：幼苗生长

中图分类号：S567.5+3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024） 08-0087-09

北沙参为伞形科多年生植物珊瑚菜（Glehnialittoralis Fr. Schmidt ex Miq.）的干燥根，其主要化学成分为香豆素类、多糖类和聚炔类等，具有消炎抗菌、养阴清肺等功效，是临床常用的中药。山东莱阳是北沙参的道地产区，其气候、土壤等条件适宜北沙参生长，种植历史可以追溯到几百年前。目前北沙参的市场需求量日益上涨，其种植规模在不断扩大，山东莱阳、内蒙古赤峰和河北安国等地都是北沙参的主产区。然而，在现阶段栽培过程中，连作障碍问题严重影响了北沙参的产量与质量，其药用品质显著下降，严重阻碍北沙参产业发展。目前的研究发现，药用植物普遍存在连作障碍问题，而土壤理化性质改变、土壤根际微生物生态失衡以及化感自毒作用被认为是连作障碍产生的主要原因。

化感自毒作用是指成熟植物通过向环境中释放化学物质来影响其自身物种幼苗生长的现象。在化感作用研究过程中，用适当溶剂提取化感物质进行生物测定对研究其作用机理非常重要。大量研究发现，用植物水浸液或其土壤浸提液浇灌种子、幼苗可以模拟连作时的自毒环境，证实植物的自毒活性。董艳鑫等研究表明，西洋参根及其连作土壤浸提液可明显抑制西洋参幼苗生长。周武先等研究发现，党参根茎研磨液和根际土壤浸提液达到一定浓度时会对川党参幼苗生长产生显著抑制作用。但目前关于北沙参根及其根际土壤的自毒性以及其对种子萌发、幼苗生长的影响尚不清楚，这不利于北沙参连作障碍问题的解决。为此，本研究用一定浓度的北沙参根系研磨液及其根际土壤浸提液浇灌北沙参种子及幼苗，研究其对种子萌发和幼苗生长特性、光合作用、渗透调节、抗氧化酶系统活性等生理生化过程的影响，以期明确北沙参化感自毒作用的存在以及化感作用对北沙参的生理效应，旨在为探索北沙参连作障碍机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

处于生长收获期的三年生北沙参及其根际土壤于2022年11月14日采自山东省烟台市莱山区莱山街道友谊村（121°35＇92＂E，37°37＇26＂N，海拔1 350 m）的北沙参种植田。采集土壤样品时先去除根周围的地表土，然后挖出北沙参植株并收集粘附在根上的土壤，再将北沙参及其根际土壤分别装入自封袋中做好标记，低温条件下带回实验室。土壤样品混匀后，自然风干过2 mm筛。北沙参清洗后放人4℃冰箱保存。北沙参种子来源于烟台大学珊瑚菜种质资源库。

1.2 试验方法

1.2.1 北沙参根系研磨液的制备

称取北沙参根茎250 g，用蒸馏水洗净后切碎，置于陶瓷研钵中，加入少量石英砂充分研磨，加入蒸馏水1L，超声处理1h后静置24 h，用4层无菌纱布过滤，然后将滤液以10 000 r/min离心10 min，取上清液即得到0.25g/mL的北沙参根系研磨原液。将其保存于4℃冰箱中备用，试验使用时稀释至0.05 g/mL。

1.2.2 北沙参根际土壤浸提液的制备

称取过筛、风干后北沙参根际土壤500 g，加入蒸馏水定容至IL，超声处理后充分搅拌静置24 h，用滤纸抽滤后取上清液，得到0.5 g／mL的北沙参根际土壤浸提液。将其保存于4℃冰箱中备用。

1.2.3 种子及幼苗化感作用试验

北沙参种子沙藏破眠后，流水冲洗处理干净，均匀放置在铺有两层滤纸的培养皿中，每皿30粒种子，分别加入各处理液5 mL。试验设置根系研磨液（RT）、土壤浸提液（ST）2个处理，以蒸馏水为对照（CK），各处理重复3次。将培养皿置于恒温25℃、光照黑暗各12 h的培养室内进行培养，培养过程中按需加入适量处理液以保持培养皿内滤纸的湿度。

另萌发一批用于幼苗化感作用试验的北沙参种子，将露白发芽、大小基本一致的播种至上口径26 cm、底径22 cm、高20 cm的育苗盆中，每盆30粒，将其放置于恒温25℃、光照黑暗各12 h的培养室内进行培育。试验设置根系研磨液（RT）、土壤浸提液（ST）2个处理，以蒸馏水为对照（CK），各处理重复3次。每隔3-4 d每盆分别浇灌300mL处理液，并保持栽培基质湿润。培育1个月后破坏性取样，进行相应指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 种子萌发指标测定

每天统计一次种子萌发数，待萌发数量连续3d保持不变时停止统计，并计算种子发芽率、发芽势和发芽指数。

发芽率（%）=正常发芽种子数／供试种子总数×100;发芽势（%）=发芽达到最高峰时的发芽种子数／供试种子总数×100;

发芽指数=∑（Gt/Dt）。式中，Gt为发芽试验终期内每天的子发芽数，Dt为发芽天数。

1.3.2 幼苗生长指标测定

培育1个月后，每处理随机选取5株幼苗，测其株高、根长、根粗、鲜重等生长指标。取新鲜叶片，用丙酮乙醇混合法测定叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量；用NBT光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性：用紫外分光光度法测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性；用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量；用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量：用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量：用蒽酮法测定可溶性糖含量：使用Max-Imaging - PAM调制叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数：用NBT和DAB染色法分别表征北沙参幼苗叶片超氧阴离子（O-·2）及过氧化氢（H2O2）的积累（试剂盒由武汉赛维尔生物科技有限公司生产）。

1.4 化感效应效果评价

用化感效应指数（RI）反映不同处理液对种子萌发、幼苗生长的化感作用效果。采用Wil-liamson的方法进行统计分析：当T≥C时，RI=1-C/T;当T＜C时，RI=T/C-I，式中C为对照值，T为处理值。RI＞0，表示处理对其具有化感促进作用；RI＜0，表示处理对其具有化感抑制作用；RI=0，表示处理对其无化感作用。

1.5 数据处理及分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010处理，SPSS 27软件进行统计分析，显著性差异采用单因素方差分析方法，多重比较采用Duncan's法，用GraphPad Prism 9.5.1绘图。

2 结果与分析

2.1 RT和ST对北沙参种子萌发的影响

由表1可知，北沙参根系研磨液（RT）和根际土壤浸提液（ST）处理下北沙参种子的萌发受到不同程度的影响，与对照组相比差异均显著。RT处理下北沙参种子的发芽率、发芽势以及发芽指数与CK组相比极显著下降，分别降低34. 33%、54.18%和64.53%：ST处理下发芽率、发芽势以及发芽指数受到显著或极显著抑制，分别降低9fR5IRlsT0NVlGAVOQm0Ew==13.44%、29. 18%和26 .22%。

两个处理下北沙参种子萌发的化感效应指数均为负值，说明RT和ST对北沙参种子萌发均存在抑制作用。RT处理的化感作用综合效应指数RI为-0.51，表明RT对种子萌发有明显抑制作用：ST处理的RI为-0.23，其对北沙参种子萌发也具有抑制作用，但与RT相比影响较小。以上结果表明，北沙参根系研磨液及其根际土壤浸提液一定程度上均能够抑制北沙参种子萌发。

2.2 RT和ST对北沙参幼苗生长的影响

由表2可以看出，北沙参根系研磨液（RT）和根际土壤浸提液（ST）处理极显著抑制北沙参根长，与CK相比，分别降低57.90%和41.22%。两处理下北沙参幼苗株高均显著小于CK，分别降低58.03%、36.98%。RT对北沙参幼苗根粗与鲜重有显著影响，较CK分别降低21 .21%、38.10%；ST处理根粗、鲜重与CK相比略有减小，与RT相比略有增加，差异均不显著。

两处理下幼苗根长、株高、根粗与鲜重的化感效应指数均＜0，说明RT与ST对北沙参幼苗生长均表现出明显的抑制作用。其中RT对幼苗根长、株高的抑制作用最强，RI均为-0.58; ST处理根粗、鲜重的RI稍大，抑制作用较小。RT的化感作用综合效应指数小于ST，降低40.91%，说明RT的自毒作用较ST更强。以上结果表明，RT与ST对北沙参幼苗生长均有一定的化感自毒作用。

2.3 RT和ST对北沙参幼苗叶片光合色素含量的影响

如图1所示，与CK相比，北沙参根系研磨液（RT）处理下幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著下降，分别降低13. 95%、13.51%和13.84%，其中叶绿素a和总叶绿素含量达极显著水平：类胡萝卜素含量显著增加，升高3.03%。根际土壤浸提液（ST）处理下叶片叶绿素a、总叶绿素含量与CK相比极显著下降，分别降低8.34%和8.84%；叶绿素b、类胡萝卜素含量受到的影响较小，差异不显著。以上结果说明，两处理对北沙参幼苗叶片光合色素含量均有不同程度的影响：北沙参根系研磨液可以通过抑制叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量以及提高类胡萝卜素含量来影响光合作用，根际土壤浸提液可以通过减少叶肉细胞中的叶绿素a和总叶绿素含量来影响光合作用。与土壤浸提液相比，北沙参根系研磨液对光合色素含量的影响更大。

2.4 RT和ST对北沙参幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

由图2可以看出，北沙参根系研磨液（RT）和根际土壤浸提液（ST）对北沙参幼苗叶片的PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、电子传递速率（ETR）、PSⅡ潜在活性（Fv/Fo）、光化学猝灭系数（qP）、实际光化学效率[Y（Ⅱ）]均有显著抑制作用。RT处理下北沙参幼苗叶片的Y（Ⅱ）值较CK显著降低，降幅为22.38%；Fv/Fm、ETR、Fv/Fo和qP值较CK极显著下降，其值分别为0.67、0.35、2.17和0.63。ST处理下北沙参幼苗叶片的Fv/Fm值稍有下降（5.59%），而ETR、Fv/Fo、qP和Y（Ⅱ）值均显著低于CK，分别降低27. 70%、16. 38%、11.93%和21.85%。以上结果说明，北沙参根系研磨液与根际土壤浸提液能够对植株的PSⅡ反应中心产生影响，进而导致光合能力下降，影响正常生长，且土壤浸提液比根系研磨液处理产生的影响小。

2.5 RT和ST对北沙参幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

由图3可知，北沙参根系研磨液（RT）和根际土壤浸提液（ST）对北沙参幼苗叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均有显著影响。与CK相比，RT与ST处理下北沙参幼苗叶片的可溶性糖含量显著下降，分别降低13.98%和13.58%：可溶性蛋白含量显著增加，增幅分别达到91.0%和4.93%：脯氨酸含量显著升高，两处理分别达到132.90 μg/g和67.00 μg/g，RT处理增幅较大，较CK提升3.9倍，差异达到极显著水平。以上结果说明，RT与ST能够显著影响北沙参幼苗叶片渗透调节物质的形成。

2.6 RT和ST对北沙参幼苗叶片抗氧化系统的影响

由图4可知，北沙参根系研磨液（RT）和根际土壤浸提液（ST）处理下北沙参幼苗叶片的丙二醛（MDA）含量及抗氧化酶活性均受到不同程度的影响。RT与ST处理叶片MDA含量较CK分别升高31 .65%和22.49%，差异达极显著水平，说明两处理对北沙参幼苗叶片的细胞膜有一定毒害作用（图4A）。如图4B所示，RT与ST处理显著抑制北沙参幼苗叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性，且RT的抑制作用更强，达极显著水平。与CK相比，RT与ST处理极显著提升抗坏血酸过氧化酶（APX）活性，增幅分别达到2.52倍和1.76倍（图4C）。

NBT与DAB染色分别显示了O-·2与H2O2的定位与分布情况（图5）。与CK相比，NBT染色后RT与ST处理北沙参幼苗叶片的部分部位呈现出蓝色斑点，且RT处理的分布更为广泛。与CK相比，DAB染色后RT与ST处理北沙参幼苗叶片稍有棕色印记，且多分布在叶脉部位，但染色不明显。以上结果说明，北沙参根系研磨液与根际土壤浸提液会破坏北沙参幼苗的生物膜系统，同时对其抗氧化系统造成损伤。

3 讨论与结论

化感自毒作用普遍存在于药用植物栽培过程中。在人参、地黄和三七等药用植物的重茬地中发现，化感自毒作用产生的化感物质逐渐积累，到一定量时会产生毒害作用，因此化感自毒作用是导致药用植物连作障碍的主要原因之一。

种子萌发和幼苗生长阶段对外部环境变化较为敏感，常用于分析化感自毒作用效应。Wang等利用stFzO0loYcFfV25T4N3CbA==苜蓿根系分泌物处理蒺藜、苜蓿种子及其幼苗，发现两组处理的发芽率、发芽势、根长和株高等生长指标均受到显著抑制。本研究发现，RT与ST处理下北沙参种子萌发受到显著影响，两处理均降低北沙参种子的萌发率，延长萌发时间，显著抑制种子活力，说明北沙参种子在萌发过程中受到一定的化感自毒作用。这可能是由于北沙参自身分泌的化感物质，干扰了种子内部的物质能量转换，造成细胞损伤，进而阻碍种子萌发，这与多花黄精植株及根际土水浸液对其种子萌发影响的效果基本一致。同时，本研究中，RT与ST处理北沙参幼苗生长的综合效应显示，根长、株高、根粗和鲜重也均受到抑制。这与陈君良等研究兰州百合根系分泌物对百合幼苗的自毒作用结果类似，说明北沙参化感自毒作用抑制其幼苗生长，也进一步证明了北沙参化感自毒作用的存在。

化感自毒作用可以通过抑制光合色素的产生以及影响光合传递链导致植物光合能力减弱，进而抑制植物生长。薛启等发现，藿香不同部位浸提液能够显著降低藿香幼苗的叶绿素含量。本试验中，RT与ST处理下北沙参幼苗叶片的叶绿素含量显著下降，这与前人的研究结果一致：而RT处理下北沙参叶片的类胡萝卜素含量则显著升高，这可能是由于化感自毒作用胁迫下类胡萝卜素含量的提高有助于接受过剩的激发态叶绿素分子，避免植物体内积累大量活性氧，起到保护细胞的作用。此外，RT与ST还显著抑制北沙参幼苗叶片的ETR、Fv/Fo、qP以及Y（Ⅱ），表明叶片的PSⅡ反应中心结构受到损坏，PSⅡ光能转换效率、电子传递能力被抑制，导致其光合能力显著下降。这与高旭等在豌豆幼苗相关试验中的结果一致。

渗透调节是植物在胁迫状态下维持正常生长代谢的重要调节方式，而渗透调节能力与渗透调节物质的积累量密切相关。本研究中，北沙参幼苗叶片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸这三种渗透调节物质，经RT与ST处理后，其含量均受到显著影响，其中可溶性蛋白和脯氨酸含量与CK相比显著升高，而可溶性糖含量则显著降低。这可能是由于两种处理液中的化感物质损伤了植物体内的膜系统，导致北沙参体内积累大量可溶性蛋白与脯氨酸来提升渗透调节能力，同时调节可溶性糖的合成，使其体内渗透调节物质总量维持在一定水平，从而维持渗透调节系统的正常运行。这一结果与陈新栋等关于灌丛凋落叶对垂穗披碱草幼苗化感作用的研究结论类似。

在胁迫环境下，植物组织中的活性氧（ROS）含量会大量增加，而ROS的积累会损害植物膜结构及生理功能。研究发现，化感自毒作用能够诱导植物细胞内ROS积累，损伤细胞膜结构，导致膜脂过氧化产生丙二醛（MDA）。本试验结果表明，RT与ST处理下北沙参幼苗叶片的MDA含量与CK相比显著增加，说明自毒作用造成了膜脂过氧化损伤，细胞膜系统受损加剧。该结果与刘苹等关于花生根系分泌物对叶片膜脂过氧化影响的研究结果一致。此外，正常条件下植物能够借助自身抗氧化酶的作用来清除产生的活性氧，从而抵御胁迫环境对植株本身产生的毒害作用。本试验中，与CK相比，RT与ST处理北沙参幼苗叶片的SOD活性被显著抑制，APX活性显著升高。这可能是由于SOD与APX对于两种处理液中的化感物质的敏感程度不同所致，该结果与陆心宇关于化感自毒物质对黄瓜抗氧化系统影响的研究结果类似。同时结合DAB与NBT两种ROS染色结果可以推测，其SOD的活性氧清除机制遭到破坏，无法将O-·2歧化为H2O2，而APX又可以清除H2O2，因此导致DAB和NBT染色显示出两种处理下H2O2的积累不明显，O-·2积累较为明显，也说明北沙参的化感自毒作用会使其抗氧化系统受到不可逆的损伤。

本研究采用三年生北沙参及其根际土壤制备北沙参根系研磨液以及土壤浸提液，发现两种处理液均能够对北沙参种子萌发及幼苗生长产生抑制作用。这证实了北沙参化感自毒作用的存在，并说明化感自毒作用可能是北沙参连作障碍产生的重要原因之一。

基金项目：山东省重点研发计划项目（2019GSF108220）