黄瓜逆境胁迫响应基因CsABI5的克隆与表达分析

摘要：脱落酸不敏感蛋白5（abscisic acid insensitive 5，ABI5）属于bZIP转录因子家族，广泛参与植物生长发育和逆境胁迫响应。本研究采用同源克隆的方法获得了黄瓜CsABI5基因，对其进行了生物信息学分析和组织特异性表达分析，并分析了其在盐胁迫和ABA处理下的表达情况。结果表明，CsABI5基因的CDS为1 230 bp，编码409个氨基酸，其编码蛋白的分子量为44. 88 kDa，理论等电点为9.53，亲水性平均系数为-0.603，属于亲水性碱性蛋白。多序列比对显示该蛋白与其他物种的ABI5蛋白具有较高的相似性，C端均含有典型的保守bZIP结构域。系统发育树显示葫芦科的ABI5聚为一支，CsABI5与甜瓜的CmABI5亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）测定发现，CsABI5在黄瓜营养器官和生殖器官中均有表达，在果刺中相对表达量最高。四叶期幼苗受100 mmol/L NaCI和100 μmol/L ABA处理后CsABI5表达量显著上调，均在处理6h升至最高。本研究结果可为抗逆黄瓜品种的选育提供参考。

关键词：黄瓜：ABI5蛋白：盐胁迫：生物信息学分析：表达特性

中图分类号：S642.2：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024） 08-0030-07

脱落酸（abscisic acid，ABA）是植物五大内源激素之一，不仅在植物生长发育过程中发挥着重要作用，还能响应极端温度、干旱、盐碱等各种环境胁迫，是平衡植物生长代谢的关键因子。通过对拟南芥突变体的研究，鉴定到许多对ABA不敏感（ABA-insensitive，ABI）的基因，例如ABI1、AB12、ABI3、ABI4、ABI5。其中，ABI1和ABI2是两个高度同源的蛋白磷酸激酶，是ABA信号通路中的负调控因子：ABI3和ABI4分别属于B3蛋白家族和AP2/ERF家族：ABI5属于碱性亮氨酸拉链类（basic leucine zipper，bZIP）转录因子，具有一个典型的bZIP结构域。目前，在拟南芥、水稻、小麦、玉米、苹果等植物中对ABI5基因功能均开展了相关研究，明确其在调控种子萌发、开花时间、根生长以及响应逆境胁迫等生命活动中发挥着重要作用。此外，ABI5还与其他植物激素信号通路中的因子相互作用，以调控植物生长发育。

黄瓜（Cucumis sativus）是葫芦科一年生草本植物，是中国设施栽培蔬菜中的第二大作物。研究发现，在拟南芥中过表达黄瓜RELATED TOABI3/VP1（CsRAV1）基因能提高转基因植株对ABA的抗性：黄瓜CHY ZINC-FINGER ANDRING PROTEIN1（CsCHYR1）基因的表达受ABA诱导，并且通过与NAC转录因子CsATAF1相互作用调节植株的耐旱性。ABI5在植物生长发育中发挥着重要功能，然而在黄瓜中却鲜有报道。本研究采用同源克隆方法从黄瓜中克隆了CsABI5基因，并对其进行了生物信息学分析以及在不同器官中和NaCl、ABA处理下的表达模式分析，以期为抗逆黄瓜品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用华北型黄瓜自交系9930，2023年8月种植于上海农林职业技术学院五厍实训基地。选择长至5片真叶的黄瓜植株，取其根、茎、子叶、真叶；选择长至20节位的黄瓜植株，取其花瓣、果刺、果皮和卷须。选择具有4片真叶的幼苗，一部分用100 mmol/L NaCl溶液浇灌进行盐胁迫处理，浇灌量约500 mL;另一部分用100 μmol/LABA喷施植株叶片，并均在处理0、1、3、6、12 h取叶片。所取样品液氮速冻后置于-80℃冰箱中备用。

1.2 基因克隆

基于黄瓜9930 V2版基因组（http：//cucurbit-genomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_long/v2/）设计特异性引物CsABI5_F（5’- AT-GAATITCAGAAACTITGAGGATATCC-3’）和CsABI5_R（5’- CCATGGGCCAGTCAGTGTTC-3’）。使用植物RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技股份有限公司）提取黄瓜叶片的总RNA，反转录合成cDNA，选用高保真酶PrimeSTAR Max Premix（宝日医生物技术有限公司）进行PCR扩增，电泳回收后将目的片段连接至pClone007 Blunt Vector克隆载体（上海擎科生物科技有限公司），转化DH5α感受态细胞，12 h后挑取单菌落进行PCR筛选，对阳性克隆进行测序验证。扩增体系：PrimeSTARMax Premix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2μL，模板DNA 200 ng，ddH，O补充至50 μL。扩增程序：94℃5 min;98℃10 s，55℃15 s，72℃1 min，35个循环；72℃5 min。

1.3 CsAB15的生物信息学分析

通过ExPACy网站的ProtParam对CsABI5蛋白的理化性质进行预测分析。通过Cell-PLoc 2.0网站对CsABI5的亚细胞定位进行预测。利用SOPMA网站对CsABI5的二级结构进行预测。利用PlantCARE对CsAB15的转录起始点上游2 000bp的序列进行启动子元件预测。利用MEME对CsABI5的保守基序（Motif）进行预测。将CsABI5的蛋白序列提交到NCBI网站，进行序列比对，下载不同物种的bZIP蛋白序列（表1），利用DNA-MAN对9种植物的ABI5蛋白序列进行比对，通过MEGA X对21种bZIP蛋白序列构建系统进化树。使用TBtools对进化树和Motif进行可视化展示。

1.4 CsABI5的表达分析

分别提取黄瓜各器官的总RNA，检测合格后反转录成cDNA。根据CsABI5编码区序列设计引物RT-CsABI5F（5’-CTAAGGCACAAGGAAATTT-CACAT-3’）和RT - CsABI5R（5’- CGGCAGTC-CATATGTTTTTAAGAA -3’），进行RT - qPCR实验，检测CsAB15在黄瓜不同器官中以及NaCl和ABA处理后的表达情况。使用康为世纪的Ultra-SYBR Mixture试剂盒进行分析，PCR体系和程序见试剂盒说明书。用黄瓜Actin（Csa6C484600）基因作为内参，采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 CsABI5基因克隆及其编码蛋白理化性质

以黄瓜cDNA为模板，对CsAB15基因的编码区进行扩增，电泳后获得一条约1 200 bp的条带（图1）。测序结果表明，CsAB15基因的CDS长度为1230 bp，编码409个氨基酸。CsABI5蛋白的分子式为C1943 H3131 N579 0612 S15，分子量为44. 88kDa，理论等电点为9.53，亲水性平均系数为-0.603，属于亲水性碱性蛋白。CsABI5蛋白二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成，其中无规则卷曲占比最高（57.46%），其次是α -螺旋（31.78%），延伸链（8.80%）和β-转角（1.96%）占比较小。Cell-PLoc 2.0预测CsABI5蛋白定位于细胞核中。

2.2 CsABI5的进化分析

将克隆得到的黄瓜CsABI5序列与其他9个物种的ABI5序列进行同源性分析，结果（图2）显示：CsABI5与其他物种的ABI5蛋白相似系数介于32.1% - 96. 8%，与甜瓜CmABI5的相似性最高，其次是与冬瓜、野生灰籽南瓜、苦瓜、印度南瓜和美洲南瓜的ABI5蛋白，相似系数分别为96.8%、94. 4%、82. 9%、82. 5%、82. 2%0和82. 2%.此外，这些序列在C端均含有典型的bZIP结构域。

利用21条不同植物的bZIP家族蛋白序列构建系统进化树，结果（图3）表明，21个蛋白分为3组，所有葫芦科植物的ABI5聚在Ⅱ组，拟南芥的ABI5单独聚为Ⅲ组，其余物种的bZIP蛋白聚在Ⅰ组。CsABI5与甜瓜的CmABI5亲缘关系最近。用MEME对21条蛋白序列的保守基序进行分析，结果（图3）显示，所有蛋白序列均含有Motif5、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 9、Motif 1，其中Motif 1是bZIP结构域。

2.3 启动子元件分析

由表2可见，CsAB15启动子区除了含有核心元件TATA和CAAT外，还包含1个脱落酸响应元件（abscisic acid responsive）、1个防御胁迫响应元件（defense and stress responsive）、1个干旱响应元件（drought-inducibility）、2个赤霉素响应元件（GA-responsive）以及10个光周期响应元件（lightresponsive）。表明该基因可能在响应逆境胁迫中发挥着重要作用。

2.4 CsAB15基因在黄瓜不同器官中的表达模式

利用RT-qPCR对CsABI5基因在黄瓜不同器官中的表达量进行分析，结果（图4）显示，CsAB15在黄瓜所有器官中均表达，但在果刺中的表达量最高，其次是子叶、茎、根、卷须、果皮、花瓣和叶。

2.5 CsABI5基因在盐胁迫和ABA处理下的表达模式

将黄瓜幼苗用100mmol/L NaCl和100μmol/L ABA处理，利用RT - qPCR检测CsAB15在处理不同时间的表达水平，结果（图5）表明：CsABI5在NaCl处理后，表达量先升高，处理6h达到最高，是未处理的4.6倍，之后表达量快速下降，12 h后基本恢复到初始水平。ABA处理可诱导CsAB15显著上调表达，处理6h的相对表达量最高，是未处理的15.1倍，之后也快速下降。

3 讨论与结论

bZIP转录因子是植物生长发育中重要的一类调节因子，能够响应多种生物和非生物胁迫，并赋予植物多种胁迫抗性。本研究采用同源克隆的方法在黄瓜中克隆到一个bZIP转录因子Cs-ABI5，CsAB15基因的CDS全长1230 bp，编码409个氨基酸。CsABI5蛋白的二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成，含有保守的bZIP结构域。进化分析显示CsABI5与甜瓜的CmABI5亲缘关系最近，这与经典的系统分类结果一致。

拟南芥abi5突变体对ABA处理不敏感，种子萌发不受ABA抑制，而AB15过表达植株对ABA超敏感。ABI5可以直接结合靶基因启动子的ABA响应元件抑制种子的萌发，能通过调控FLOWERING LOCUSC（FLC）的表达控制开花时间，能通过调控葡萄糖的合成抑制根分生组织的生长。水稻AB15-Likel（ABL1）在根、茎、叶等多个器官中表达，并受ABA以及盐、干旱和渗透胁迫等的诱导。玉米ZmAB15受高温、低温、脱落酸、水杨酸、氯化钠等多种胁迫诱导表达，过表达ZmAB15植株呈现出明显的胁迫敏感表型。拟南芥AB15在受到ABA诱导后，表达量增加，在6h后升至最高。本研究结果表明，黄瓜CsABI5受100 μmol/L ABA诱导显著上调表达，处理6h时表达量最高，与拟南芥中的结果相似。另外，在CsABI5启动子区发现了脱落酸响应元件、防御胁迫响应元件、干旱响应元件，Cs-ABI5可能通过这些元件响应胁迫信号。

CsABI5在黄瓜各器官中均有表达，在果刺中相对表达量最高。草莓FaABI5同样在所有器官中表达，但在根中相对表达量最高。而拟南芥AB15主要在成熟种子和花朵中表达，营养组织中几乎不表达。这说明虽然ABI5在不同植物中的功能相对保守，但表达部位存在差异。

综上，本研究通过同源克隆获得了黄瓜CsA-BI5基因，其编码蛋白含有保守的bZIP结构域，与甜瓜CmABI5亲缘关系最近，启动子区含有多种逆境应答元件，在100 mmol/L NaC1和100μmol/L ABA处理6h内上调表达且表达水平逐渐升高，之后表达量快速下降。本研究结果可为CsABI5参与黄瓜逆境胁迫响应相关研究提供理论依据，并为黄瓜耐逆品种选育奠定基础。

基金项目：上海市“科技创新行动计划”农业领域项目（20392001300）