苹果6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因MdPGLA的克隆及功能分析

摘要：6-磷酸葡萄糖酸内酯酶（PGL）是氧化戊糖一磷酸途径的关键酶，在糖代谢以及植物免疫反应中发挥着重要作用。本研究基于前期转录组测序结果筛选出对轮纹病有强烈响应的基因MD01 G1226300，并对该基因进行克隆鉴定与功能分析。结果表明，接种轮纹病菌6d后，‘鲁丽’苹果的病斑面积显著小于其亲本‘皇家嘎啦’和‘藤牧1号’；qRT-PCR分析发现MD01 G1226300被强烈诱导表达，但在‘鲁丽’中的表达水平显著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1号’。生物信息学分析结果表明，MD01 G1226300的cDNA全长762 bp，编码253个氨基酸，MDOIG1226300蛋白相财分子量为28.04 kDa，理论等电点为5.85，为稳定的亲水性蛋白，属于SugarP_isomerase超家族，存在6个可能的活性位点，无跨膜结构域且整体位于膜外区，三级结构主要由α螺旋和B折叠形成：通过同源序列比对分析后命名为MdPCLA，与梨PbPGL4进化关系最近，氨基酸序列同源性为70. 13%。超表达MdPGIA的转基因苹果愈伤组织对轮纹病的抗性以及抗性相关基因的表达水平显著低于对照，表明MdPGIA负调控苹果对轮纹病的抗性。本研究结果丰富了苹果中PGL家族基因响应生物胁迫的理论体系，为苹果抗病分子机制解析和通过遗传性状改良创制抗病苹果新种质提供了参考基因。

关键词：苹果：MdPGIA；轮纹病：基因克隆：功能验证

中图分类号：S661.1：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024） 08-0016-07

苹果（Malus domestica Borkh.）是温带地区种植面积最大、经济价值最高的水果之一，但其产量和品质常受病虫害影响，严重制约苹果产业的健康发展。由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起的苹果轮纹病（apple ring rot）又称粗皮病，易造成果实腐烂，引起树势衰弱或整株死亡，是我国苹果主产区最严重的病害之一。在生产上，果农为控制病害多采取喷施农药等化学方法，易导致轮纹病菌抗药性提高，且造成严重环境污染。因此，探索防治轮纹病新策略、选育抗轮纹病新品种是苹果遗传育种亟待解决的重要问题，对推动我国苹果产业高质量发展具有重要意义。

磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）是细胞中重要的初生代谢途径，是碳源合成植保素、木质素等次生代谢途径的必经中间途径，具有重要的生理功能，可为核苷酸合成和芳香氨基酸产生提供还原剂NADPH、5-磷酸核酮糖以及4-磷酸赤藓糖。PPP途径可分为两个阶段：氧化阶段和非氧化阶段。氧化PPP（oxidativePPP，OPPP）将6-磷酸葡萄糖转化为5-磷酸核酮糖，后者成为非氧化PPP的底物。OPPP是细胞代谢的一个中心分支，为生物合成代谢提供NADPH和磷酸糖。在植物细胞中，OPPP分支存在于细胞质和质体中，由6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶（6PGL）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）组成。在拟南芥中，这些酶由核基因组中的小基因家族编码，包括6个G6PD、5个6PGL和3个6PGD亚型。拟南芥PGL1、PGL2、PGIA和PGL5四个基因编码了6-PGL的细胞质亚型，这些基因可能在细胞质中具有冗余作用。PGL3包含一个N端延伸和一个C端过氧化物酶体靶向基序（PTSI），同时具有质体和过氧化物酶体靶向信号。PGL与植物的生长发育和逆境胁迫反应密切相关。在强抗寒的冬小麦品种Dn1中，Ta6PGL与小麦的抗寒性相关，低温条件下该基因的表达量上升，通过介导PPP途径显著提高植株的抗寒性，在拟南芥中，所有组织中的PGL3表达一致，发育种子中的表达略有升高，并且该基因的转录在整个发育过程中相对较高且稳定。PGL3的表达水平与植物应对生物和非生物胁迫相关。拟南芥pgl3-1突变体表现为植株矮小，抗性相关基因表达水平显著提高，抗病性增强。

本研究基于前期苹果接种轮纹病菌后的表型及转录组测序结果，筛选出对轮纹病有强烈响应的基因MDOIG1226300，该基因与拟南芥AtPGL3同源性较高。为进一步解析基因功能，本研究从接种轮纹病菌后的苹果果实中克隆得到MDOIG1226300，并进行生物信息学分析，随后通过苹果愈伤组织同源转化验证其在苹果对轮纹病抗性中的功能，以期为苹果抗病性遗传改良提供重要的参考基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苹果品种为‘鲁丽’、‘皇家嘎啦’和‘藤牧1号’。所有试材定植于山东省果树研究所天平湖基地（36°13＇N，117°01＇E）。连续3年对上述试材进行抗病性调查及鉴定，取样前15 d不喷施农药，其他按常规管理进行。遗传转化所需‘王林’苹果愈伤组织于MS培养基中在24℃黑暗条件下培养。室内人工接种所用菌株为山东省果树研究所果树病虫害监测与防控创新团队自‘富士’苹果果实中分离出的轮纹病菌葡萄座腔菌（Botryospheria dothidea）.

1.2 试验方法

1.2.1 苹果果实病菌接种

取28℃培养箱中菌丝生长旺盛且一致的轮纹病菌，苹果果实用灭菌后的牙签扎深5 rum的小孔，塞满菌丝，培养6d后取样，样品液氮速冻后-80℃保存备用。

1.2.2 不同品种苹果果实中MDOIG1226300的表达分析

本研究设计qRT-MDOIG1226300-F/R引物（表1），使用BIO-RAD实时荧光定量PCR仪和FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche，USA）进行qRT-PCR，分析MDOIG1226300在接种及未接种轮纹病菌的‘鲁丽“皇家嘎啦’‘藤牧1号’苹果果实中的表达模式。以苹果Mdactin为内参基因。每处理6个样品，3次重复。采用2-AAC‘法计算基因表达水平。

1.2.3 MDOIG1226300的克隆与载体构建

用RNA Prep Pure Plant Kit试剂盒（TIANGEN，北京）提取苹果果实的总RNA，在苹果GDDH13_1—1数据库下载MDOIG1226300的全长序列，设计特异性引物（表1）。采用反转录试剂盒（RevertAidTMFirst-Strand cDNA synthesis Kit， Thermo， USA）合成cDNA第一链，并以cDNA为模板进行扩增。用Gel Extraction Kit快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（CWBio，北京）对得到的特异性PCR产物进行回收，并连接至T载体（TIANGEN，北京），采用热激法转化大肠杆菌DH5cc感受态细胞。选取PCR验证正确的阳性单克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。在NCBI网站（www.nlm.nih.gov）上对测序结果进行比对。

1.2.4 MdPGLA的生物信息学分析

通过Expasy网站（https：//web．expasy．org/compute_pi）在线分析MDOIG1226300蛋白理化性质。利用NCBI网站分析软件对MDOIG1226300蛋白进行保守结构域分析。采用DNAMAN 8.0（Lynnon Biosoft，USA）、DNA Club数据分析软件对多个物种的同源蛋白进行序列比对分析。利用MEGA 11.0软件，选用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）对多个物种的PGIA同源氨基酸序列构建系统进化树。

1.2.5 农杆菌介导的苹果愈伤组织转化及转基因株系表型观察

将MdPGL4的CDS全长序列连接到超表达载体pBI121上，构建植物基因超表达载体pBI121 -MdPGIA-FLAG，利用LBA4404农杆菌介导的遗传转化法转入苹果‘王林’愈伤组织中，使用50mg/L卡那霉素筛选阳性植株，设计特异性引物并进行qRT-PCR鉴定，获得超表达MdPGIA的苹果愈伤组织。取28℃培养条件下菌丝生长一致的轮纹病菌，用打孔器取大小一致的菌饼接种于生长10 d的愈伤组织中央，黑暗培养4d后取样，样品液氮速冻后-80℃冰箱保存备用，通过qRT-PCR分析不同愈伤组织中抗性相关基因（表1）的表达模式。

2 结果与分析

2.1 ‘鲁丽’对轮纹病的抗性分析及相关基因筛选

2.1.1 苹果果实接种轮纹病菌后的表型分析

对‘鲁丽’及其亲本‘皇家嘎啦’‘藤牧1号’进行轮纹病菌接种，结果（图1A、B）表明，接种6d后，‘鲁丽’的病斑面积显著小于‘皇家嘎啦’‘藤牧1号’，病斑直径较两者分别减小57%和30%。说明‘鲁丽’对轮纹病具有较高的抗性。

2.1.2 MDOIG1226300基因的鉴定及表达模式分析

前期转录组测序分析发现MDOIG1226300基因的表达趋势与苹果对轮纹病的抗性呈显著负相关。本研究利用qRT - PCR技术检测MDOIG1226300在接种及未接种轮纹病菌的‘鲁丽’‘皇家嘎啦’‘藤牧1号’果实中的表达模式，以未接种轮纹病菌的‘藤牧1号’为参比计算相对表达量。结果（图1C）表明，接种轮纹病菌后MDOIG1226300在‘鲁丽’‘皇家嘎啦’‘藤牧1号’中均被强烈诱导表达，品种间差异显著；在‘鲁丽’中的表达水平显著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1号’，表达量仅分别为两者的37%和32%。以上结果进一步验证了MDOIG1226300与苹果对轮纹病的抗性呈负相关。

2.2 MDOIG1226300的克隆与生物信息学分析

以接种轮纹病菌后的苹果果实cDNA为模板，通过PCR扩增得到750 bp左右的条带（图2A）；产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳回收后与pMD19-T Vector连接，转化到DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆后摇菌测序，结果目的基因cD-NA全长762 bp，编码253个氨基酸，与苹果基因组GDDH13数据库中的MDOIG1226300一致，与拟南芥AtPGL3同源性较高。

MDOIG1226300蛋白的相对分子质量为28.04 kDa，理论等电点（pl）为5.85，包含28个Ala（11. 1%）、26个Leu （10.3%）、21个Lys （8.3%） ，21个Val（8.3%）；负电荷残基（Asp+Glu）总数为33个，正电荷残基（Arg+Lys）总数为27个；总平均亲水系数（GRAVY）为-0.159，属于亲水性蛋白；脂肪系数为89.09，不稳定系数为26.56（＜40），为稳定蛋白。

蛋白保守结构域分析发现MDOIG1226300蛋白属于SugarP-isomerase超家族蛋白，E值为2.09e-107。推测存在6个可能的活性位点，分别位于第45 - 50、75 - 80、155 - 160、185 - 190、210 - 215位氨基酸之间，与其在磷酸戊糖途径中发挥的作用有关。通过TMHMM2.0预测MD01G1226300蛋白的跨膜区域，结果（图2B）显示，该蛋白在跨膜区和膜内区的概率极低，在膜外区的概率接近于1，说明其无跨膜结构域且整体位于膜外区。通过SWISS-MODEL对MD01G1226300三级结构进行预测，采用的模板为AOA540M7QI，序列相似度为88.93%，结果（图2C）显示，α螺旋和β折叠结构主要参与了MDOIG1226300蛋白三级结构的形成。

多序列比对结果（图3）显示，MD01G1226300与白梨（Pyrus bretschneideri Rehd）PbPCIA（XP_048427164.1）的同源性最高，为70.13%；与石榴（Punica granatum L.）PgPGIA（XP_031380672.1）、桃（Prunus persica）PpPGIA（XP_007218710.2）、甜橙（Citrus sinesis）CsPGIA（XP_006493166.2）的同源性分别为69.65%、66. 04%、56.35%，表明从苹果中克隆得到的MDOIG1226300基因所编码的蛋白与其他物种的PGIA蛋白具有较高的相似性，因此将该基因命名为MdPGL4。

为了进一步研究MdPGIA与其他物种的亲缘关系，利用MEGA 11.0软件基于氨基酸序列构建系统进化树。结果（图4）显示，MdPGIA和Pb-PGIA聚在1个分支，亲缘关系最近。

2.3 超表达MdPGIA的苹果愈伤组织表型及抗性相关基因表达分析

为深入研究MdPGL4的功能，本研究通过LBA4404农杆菌介导的遗传转化方法进行苹果愈伤组织转化试验，并进行qRT-PCR验证，获得了超表达MdPGL4的苹果愈伤组织株系。随后对超表达MdPGIA的愈伤组织1#和2#株系进行轮纹病菌接种试验。如图5A所示，接种轮纹病菌4d后，超表达MdPCL4的转基因愈伤组织的病斑面积显著大于对照，1#和2#株系病斑的平均直径分别约为对照的2.1倍和1.9倍。表明MdPGIA的过量表达使转基因苹果愈伤组织对轮纹病菌的抗性降低。

对超表达MdPGLA转基因愈伤组织中水杨酸（salicylic acid，SA）和氧化还原相关基因的表达水平进行分析，结果（图5B）显示，接种轮纹病菌4d后，SA相关基因MdNPR1、MdPAL以及氧化还原相关基因MdPOD、MdSOD在1#株系的表达水平均显著低于对照：除MdNPR1外，在2#株系中的表达水平也显著降低。

综合以上研究结果推测，MdPGL4可能通过影响SA及氧化还原反应调控苹果对轮纹病的抗性。

3 讨论与结论

PPP是植物中心代谢途径，与植物的生长发育密切相关。该途径的不可逆氧化部分是NADPH的主要来源，以防止氧化应激：可逆非氧化部分是合成核苷酸、芳香氨基酸、苯基丙烷及其衍生物的碳骨架的来源。PPP包含一系列由7种不同酶催化的反应：G6PD、6PGL、6PGD、5-磷酸核糖异构酶（RPI）、5-磷酸核酮糖异构酶（RPE）、转酮醇酶（TK）和转醛缩酶（TA）。PGL是OPPP的主要酶类，可将6-磷酸葡萄糖-8-内酯加速水解为6-磷酸葡萄糖酸，为生物合成反应提供重要的还原剂等物质，AtPGL3是唯一编码具有N端转运肽和保守PTSI的PGL基因，为拟南芥生长发育所必需。本研究在接种轮纹病菌的苹果果实中克隆得到拟南芥At-PGL3的同源基因MdPGIA，序列比对结果显示MdPGIA与白梨PbPGIA氨基酸序列的同源性达70. 13%，属于SugarP_isomerase超家族蛋白，存在6个可能的活性位点。

前人研究表明PGL在植物生长发育过程中表达量相对较高且稳定，并且在响应生物和非生物胁迫中具有重要作用。植物幼苗受低温驯化时，PPP效率提高，从而增强抗冻性。拟南芥PGL3可提高OPPP效率，防止6-磷酸葡萄糖酸内酯的积累，以保证细胞内源化合物的完整性。AtPGL3通过改变植物叶片组织中的氧化还原状态影响光合细胞的氧化还原平衡，从而激活防御反应。小麦PGL对分蘖节抗寒有着重要作用，-25℃条件下，PGL的表达水平显著提高，导致PPP中Ru5P和NADPH等中间产物的积累，从而为植物的生物合成提供原料和专一性供体。此外，PPP的代谢终产物6-磷酸葡萄糖的累积也能增强细胞渗透压，从而降低寒冷对细胞的伤害，拟南芥pgl3-1突变体表现为植株矮小，G6PD活性增强，细胞氧化还原电位降低，对丁香假单胞菌的抗性显著提高。

目前，对于PGL基因的研究主要集中于模式植物，在苹果中尚未有鉴定其功能的报道。本研究qRT-PCR分析结果表明，接种轮纹病菌后，不同品种的苹果果实中MdPGL4的表达量显著升高。对轮纹病敏感性越高的苹果品种，MdPGIA的表达水平越高，推测MdPGIA与苹果对轮纹病的抗性呈负相关。前期的研究表明，植物激素水杨酸水平和氧化还原反应与苹果对轮纹病的抗性密切相关。与野生型相比，超表达MdPGL4的转基因苹果愈伤组织对轮纹病的抗性以及水杨酸和氧化还原抗性相关基因的表达水平显著降低，表明MdPCLA负调控苹果对轮纹病的抗性。

本研究通过对MdPGIA的克隆及其响应轮纹病的表达分析，丰富了苹果属植物PGL家族基因响应生物胁迫的理论体系，也为苹果抗病分子机制解析和通过遗传性状改良创制抗病苹果新种质提供参考基因。

基金项目：山东省自然科学基金青年项目（ZR2020QC147）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-27）；山东省重点研发计划 （农业良种工程）项目（2023LZGCQY009）；山东省果树研究所科研创新基金青年工程项目（2023GSKY02）；山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目（2022LZGC010）