改良抗酸染色法联合GeneXpert法在提高疑似肺结核患者痰结核分枝杆菌检出中的应用

【摘要】 目的：评估改良抗酸染色法结合GeneXpert法在提高疑似肺结核患者痰中结核分枝杆菌检出率的有效性。方法：选取2022年1月—2023年1月赣州市第五人民医院收治的100例疑似肺结核患者作为研究对象。采用改良抗酸染色法和GeneXpert法检测结核分枝杆菌含量，以病理学联合临床检查诊断结果为金标准，使用受试者操作特征（ROC）曲线分析两种方法单独及联合检测的诊断效能。结果：两种方法对不同浓度结核分枝杆菌的检测结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）。改良抗酸染色法对结核分枝杆菌阳性诊断的一致性中等（Kappa=0.500）；GeneXpert法及联合检测对结核分枝杆菌阳性诊断的一致性较好（Kappa=0.822、0.950）。ROC曲线分析显示，联合检测的曲线下面积（AUC）为0.986，高于改良抗酸染色法、GeneXpert法的0.792、0.933。结论：改良抗酸染色法结合GeneXpert法能显著提高疑似肺结核患者痰中结核分枝杆菌的检出率，减少漏诊，对于提早诊断和切断肺结核的传播链具有重要意义。

【关键词】 肺结核 结核分枝杆菌 抗酸染色

Application of Modified Acid-Fast Staining Combined with GeneXpert Method in Enhancing the Detection of Mycobacterium Tuberculosis in Sputum of Suspected Pulmonary Tuberculosis Patients/YANG Liu， WANG Peixing， LAI Xiang， ZHANG Xin， LAI Xiaoju. //Medical Innovation of China， 2024， 21（24）： -133

[Abstract] Objective： To evaluate the effectiveness of modified acid-fast staining combined with GeneXpert method in enhancing the detection rate of mycobacterium tuberculosis in sputum of patients with suspected pulmonary tuberculosis. Method： A total of 100 suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to the Fifth People's Hospital of Ganzhou from January 2022 to January 2023 were selected as the study objects. Modified acid-fast staining and GeneXpert method were used to detect the content of mycobacterium tuberculosis. The diagnostic results of combined pathological and clinical examination were taken as the gold standard， and the diagnostic efficiency of the two methods was analyzed by receiver operating characteristic （ROC） curve. Result： The results of different concentration of mycobacterium tuberculosis detected by two methods were compared， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive diagnosis of mycobacterium tuberculosis by modified acid-fast staining was moderately consistent （Kappa=0.500）. GeneXpert method and combined detection showed good consistency in positive diagnosis of mycobacterium tuberculosis （Kappa=0.822， 0.950）. ROC curve analysis showed that area under curve （AUC） of combined detection was 0.986， which was higher than 0.792 and 0.933 of modified acid-fast staining and GeneXpert method. Conclusion： Modified acid-fast staining combined with GeneXpert method can significantly improve the detection rate of mycobacterium tuberculosis in sputum of patients with suspected pulmonary tuberculosis， reduce missed diagnosis， and have important significance for early diagnosis and cutting off the transmission chain of tuberculosis.

[Key words] Pulmonary tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Acid-fast staining

First-author's address： Department of Clinical Laboratory， the Fifth People's Hospital of Ganzhou， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.24.029

结核病是一种慢性的呼吸系统传染性疾病，主要由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，不仅影响肺部（肺结核是最常见的形式），还可能侵犯身体的其他多个器官组织[1-2]。早期准确诊断对于有效控制肺结核的传播至关重要，但由于结核分枝杆菌在临床样本中的低浓度及其生长缓慢的特性，使得早期诊断成为一大挑战。改良抗酸染色法简单、快速、易行和较可靠，但欠敏感，通常菌量≥10条/mL方能检测阳性，尤其在病原体含量较低的样本中，传统的检测方法已不能满足临床快速诊断的需求[3-4]。近年来，分子生物学技术的发展为结核病的诊断提供了新的方法。GeneXpert MTB/RIF检测作为一种快速分子诊断技术，能够在短时间内同时检测结核分枝杆菌和对利福平耐药性的存在。鉴于此，本研究评估改良涂片抗酸杆菌镜检法联合GeneXpert法检测在提高疑似肺结核患者痰中结核分枝杆菌检出率中的有效性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年1月—2023年1月赣州市第五人民医院收治的100例疑似肺结核患者作为研究对象。纳入标准：（1）临床症状和体征符合文献[5]《肺结核基层合理用药指南（2020）》中疑似病例诊断标准；（2）胸部X光或CT检查提示肺结核可能；（3）未接受过抗结核治疗或抗结核治疗未超过1周。排除标准：（1）同时患有其他类型的肺部感染，如肺炎、肺癌等；（2）免疫系统功能严重受损，如HIV感染、长期使用免疫抑制剂；（3）过去1个月内接受过其他试验性药物治疗。其中男55例，女45例；年龄33～80岁，平均（47.8±7.5）岁；持续性咳嗽和咳痰80例，发热、盗汗40例；有既往结核病史或接触史20例；婚姻状况：已婚72例，未婚18例，离异或丧偶10例；吸烟史45例，饮酒史30例。本研究经赣州市第五人民医院医学伦理委员会批准，患者或家属知情同意本研究。

1.2 方法

1.2.1 实验仪器 （1）仪器：显微镜（上海无陌光学仪器有限公司，WM710R枝晶显微镜）、离心机[赛默飞世尔科技（中国），Sorvall ST8]、电热板（力辰科技，DB-XGW）、GeneXpert仪器（Cepheid公司，GX-I）、生物安全柜（上海贝茵生物，A2生物安全柜）。（2）试剂：5%次氯酸钠溶液（中鼎生物，ZDSW 250 mL/瓶）、卡尔柏氏红染料（晓柚生物科技，X11155）、甲基蓝（迈瑞尔，M38055）、GeneXpert检测盒（Cepheid公司，MTB/RIF）。

1.2.2 检测方法 （1）样本收集和处理：所有疑似肺结核患者均在早晨空腹时收集痰液样本。确保第一份清晨痰和第二份即时痰或者不同时间的2份即时合格痰，且最好在24 h内收集和数小时内检测，无痰患者可采取诱导痰[6]。（2）改良抗酸染色法：样本离心浓缩，提高结核分枝杆菌在玻片上的浓度，加入5%次氯酸钠溶液处理痰液，取20～50 μL浓缩后的样本涂抹在多个玻片上，确保每个玻片上有足够的细胞和细菌量，将玻片在火焰上加热固定，使用卡尔巴宁染液染色，使用甲醇洗涤剂去除多余染料，涂片封片，并在显微镜下检查染色的玻片，过观察粉红色染色的酸性杆菌确定结核分枝杆菌的存在和数量，从而确立检测结果。（3）GeneXpert法：①样本准备，按照GeneXpert系统的使用说明书，将离心15 min后分离上清液的样本加入沉淀两倍处理液，置于检测盒中。②仪器分析，将检测盒放入GeneXpert仪器中，按照制造商的程序运行。③结果解读，仪器自动分析样本，并输出是否检测到结核分枝杆菌及其耐药性。

1.2.3 判定标准 （1）金标准诊断：所有痰样本的最终诊断结果以病理学检查和临床检查的综合判断为准。包括胸部X光或CT检查、症状评估及必要时的组织病理学检查。（2）改良抗酸染色法判定标准：通过肉眼观察在培养基上没有发现斜面细菌菌落，并且在涂片经过抗酸染色后，在显微镜下观察不到抗酸菌，判定为阴性。相反，如果肉眼能在培养基上观察到细菌菌落生长，并且涂片在经过抗酸染色后，在100个高倍镜视野中发现1根及以上结核分枝杆菌，结果为阳性。（3）GeneXpert法判定标准：GeneXpert的检测结果通过GeneXpert系统测量荧光信号和应用内置算法来确定，结果由系统自动报告并展示在“预览结果”界面上。较低的CT（循环阈值）值表示DNA模板的初始浓度较高，而较高的CT值则意味着DNA模板的初始浓度较低。（4）联合检测判定：如果在两种检测方法中的任何一种呈阳性，那么联合检测的结果将被判定为阳性。

1.3 观察指标及评价标准

（1）结核分枝杆菌含量检测：统计两种方法检测不同浓度级别结核分枝杆菌含量的效能，按照世界卫生组织（WHO）和国际防痨联盟（IUATLD）推荐的标准[7]，将其分为阴性（在至少100个高倍镜视野中未见到结核分枝杆菌）、稀疏（在100个高倍镜视野中发现1～9根结核分枝杆菌）、1+（在100个高倍镜视野中发现10～99根结核分枝杆菌）、2+（在至少一个视野中平均发现1～10根结核分枝杆菌）、3+（在至少一个视野中平均发现超过10根结核分枝杆菌）。（2）效能评估：比较两种方法的敏感度、特异度。（3）受试者操作特征（ROC）曲线分析：使用SPSS软件，对两种方法的ROC曲线进行分析，计算各种方法的曲线下面积（AUC），评估其效能。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 26.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，Kappa值用于评估分诊结果一致性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法对结核分枝杆菌不同浓度含量的检测结果比较

两种方法对不同浓度结核分枝杆菌检测结果比较，差异有统计学意义（Z=1.978，P=0.048），见表1。

2.2 两种方法单独及联合检测结核分枝杆菌的诊断结果比较

以病理学检查和临床检查的综合判断作为金标准，共检测了100例患者，其中检出阴性31例，阳性69例；改良抗酸染色法检出阴性50例，阳性50例，一致性中等（Kappa=0.500）；GeneXpert法检出阴性37例，阳性63例，一致性较好（Kappa=0.822）；联合检出阴性33例，阳性67例，一致性较好（Kappa=0.950）。见表2。

2.3 两种方法单独及联合检测的诊断效能比较

ROC曲线分析显示，联合检测的AUC为0.986，高于改良抗酸染色法、GeneXpert法的0.792、0.933，见表3、图1。

3 讨论

肺结核是指发生在肺组织、气管、支气管和胸膜的结核病变，占各器官结核病总数的80%～90%，肺结核类型包括原发性肺结核、血行播散性肺结核、继发性肺结核、气管支气管结核和结核性胸膜炎[8-9]。由于耐药菌株的产生和社会流动人口的增多等生物学和社会学因素，结核病已经成为严重危害人类健康的公共卫生问题[10]。丁运生等[11]提出，患者的间歇性排放细菌和样本中较低的细菌含量都将导致检测结果不准确，如标本的储存条件和操作人员的技术水平，都可能导致培养结果出现假阴性或假阳性。改良抗酸染色比传统方法具有显著优势，是临床上早期快速诊断首选技术，GeneXpert是WHO推荐的结核病实验室诊断中重要诊断试验[12-13]。本研究通过对100例疑似肺结核患者的痰样本进行分析，本研究旨在验证改良抗酸染色法联合GeneXpert法在提高结核分枝杆菌检出率方面的优势，并与传统的直接涂片染色法进行比较。

本研究结果显示，改良抗酸染色法联合GeneXpert法在敏感度、特异度方面均优于传统的改良抗酸染色法。这说明该联合方法在识别肺结核病原体方面更为有效，特别是在早期低浓度肺结核患者检测中表现出更高的敏感性。这一点对于肺结核的早期发现和及时治疗尤为重要，因为早期诊断和治疗是切断传播链、控制疾病流行的关键。GeneXpert是一种基于半嵌套式实时荧光定量PCR技术的全自动核酸检测方法，采用的是商业化的盒式检测技术通过识别结核分枝杆菌特有的rpoB基因序列，能在2 h内快速检测出结核分枝杆菌的存在[14]。在临床上诊断肺结核或耐药肺结核时，常面临无痰、少痰或痰涂片阴性等挑战，这增加了诊断和治疗的难度，不同级别医疗机构在检测能力上也存在较大差异，GeneXpert技术不仅可以快速检测结核分枝杆菌，还能同时鉴定耐多药结核菌株，能够迅速实时地监控含有不同耐药基因的耐药肠杆菌科细菌（CRE）的分布趋势和流行特征，这意味着使用改良抗酸染色法联合GeneXpert法不仅提高了检测效率，还能为临床医生提供重要信息，帮助他们根据不同的耐药基因表型制定更合理的用药策略[15-16]。肺结核确诊主要依赖于痰涂片的抗酸染色和痰中结核分枝杆菌的培养，但这两种方法都有其明显的限制，传统的抗酸染色技术中使用酒精灯加热，这会带来一些问题，如火焰加热可能导致液体飞溅和快速干涸，染液使用量大，及在加热过程中苯酚不断挥发等，而结核分枝杆菌进行培养的方法，其检测周期过长，操作繁琐且技术复杂，因此在推广上仍存在困难[17-18]。GeneXpert法能够在胸腹水、脑脊液、尿、粪等多种样本中进行，且有效缩短患者的诊断时间，提高诊断效率，优于抗酸杆菌涂片和结核菌培养传统诊断方法，然而也应当注意到改良抗酸染色法联合GeneXpert法的实施成本和技术要求[19-20]。李静等[21]在其研究中认为，由于设备昂贵，针对我国结核病高负担的现状，认为其不利于进行推广应用在资源有限的地区，高成本可能成为限制其广泛应用的一个因素。因此，未来的研究应着重于简化检测流程、降低成本，并探索如何在不同资源环境下有效地应用这一技术。这两种方法的检验标准旨在确保实验操作的标准化和规范化，从而保证实验结果的准确性和重复性。直接涂片抗酸染色法作为传统方法，其操作简便、成本低廉，但敏感度有限；而改良抗酸染色法联合GeneXpert法则结合了传统方法的优点和分子诊断技术的高敏感度，有望提高检出率。通过对比这两种方法，本研究旨在评估改良方法在临床应用中的潜在价值。为进一步提高肺结核的检出率和诊断准确性，未来研究可考虑结合更多的生物标志物检测和分子生物学技术。例如，通过分析患者痰液中的特定蛋白质或RNA分子，可能进一步提高对肺结核的诊断敏感度和特异度。

综上所述，本研究强调了改良抗酸染色法联合GeneXpert法在肺结核早期诊断中的重要性，对于进一步的临床应用和公共卫生策略制定提供了有价值的参考。未来研究应关注该技术在不同环境下的可行性、成本效益比及与其他生物标志物检测方法的结合应用。

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（收稿日期：2024-01-30） （本文编辑：马娇）

*基金项目：赣州市卫生健康委市级科研计划项目（2022-2-131）

①赣州市第五人民医院检验科 江西 赣州 341000

通信作者：杨柳