黑茶渥堆发酵过程中微生物的研究进展

摘要：黑茶属于六大茶类之一，渥堆发酵是其核心工序。黑茶渥堆发酵的关键就在于茶叶在湿热条件下经微生物作用，最终形成其独特风味与品质。为了解黑茶发酵过程中不同种类微生物所起的作用，文章就黑茶渥堆过程中微生物的种类及数量变化、不同黑茶的微生物种类组成差异、黑茶渥堆发酵中微生物种群的分析鉴定技术、重要菌种添加发酵对黑茶品质变化的影响，以及黑茶中有害微生物的产生条件及对安全生产的指导意义等进行了综述。

关键词：黑茶；发酵；微生物

中图分类号：TS272.5；Q936 文献标识码：A 文章编号：1000－3150（2024）09-21-7

Research Progress of Microorganisms during Fermentation of Dark Tea

WANG Guiyou1， WANG Zhaoyue2， LIANG Siwei1， ZHANG Yan1*

1. Angel Yeast Co.， Ltd./The National Key Laboratory of Agricultural Microbial Resources Exploitation and Utilization/The Key

Laboratory of Yeast Function in Hubei， Yichang 443000， China; 2. Xinding Biotechnology Co.， Ltd.， Yichang 443000， China

Abstract： Dark tea is one of the six major tea categories in China. Pile-fermentation is its core process， and the key of fermentation lies in the fusion of tea and microorganisms under hot and humid conditions， which ultimately forms the unique flavor and quality of dark tea. In order to understand the role of different kinds of microorganisms in the fermentation process of dark tea， the paper summarized the changes in the varieties and quantities of microorganisms in the pile-fermentation process of dark tea， the differences in the composition of microbial population of different kinds of dark tea， the analysis and identification techniques of microbial populations in the pile-fermentation of dark tea， the influence of the addition of important strains on the change of tea quality. This paper also introduced the production conditions of harmful microorganisms in dark tea and their guiding significance for safe production.

Keywords： dark tea， fermentation， microorganism

黑茶生产历史悠久，主要包括普洱茶、青砖茶、茯砖茶、康砖茶等，黑茶砖茶以砖体匀整、香气浓郁、滋味醇和、汤色橙红透亮、叶底棕褐等特点著称。黑茶不仅能生津止渴，还具有降血糖、降血脂、抗氧化的保健功效。随着社会的发展以及研究技术的进步，微生物群落结构以及功能研究在黑茶发酵领域逐渐开展，但目前大部分文献报道中多是对普洱茶的研究，而对其他黑茶类的研究甚少，尤其是黑茶菌种添加发酵生产领域还存在一定的技术空白，而菌种添加发酵的前提是对渥堆中已有微生物种群的分析确定及提取、鉴定、大规模培养技术的进步，因此，笔者收集相关黑茶文献，对此领域内的研究进展进行综述。

1 黑茶渥堆过程中微生物的种类及变化

研究表明，黑茶渥堆发酵过程中的微生物群落主要有霉菌、细菌、酵母菌和放线菌（Actinomycetes），随着渥堆程度的加深，不同种类黑茶的微生物种群及数量也发生着变化。

1.1 黑茶渥堆过程中霉菌的种类及变化

青砖茶在渥堆过程中，黑曲霉（Aspergillus niger）数量占绝对优势，且分离频率高，是青砖茶渥堆过程中的优势菌[1-2]。在普洱茶渥堆发酵前期，黑曲霉数量增加迅速，中后期逐渐衰减[3-4]，但在整个发酵过程中，曲霉属（Aspergillus）依旧是优势菌属[5]。同样，黑曲霉也是茯砖茶发酵过程中的优势菌，但发酵后期的数量比前期要多，渥堆完成后进入发花期时，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的数量逐渐超过黑曲霉[6]。

由此可见，黑曲霉是黑茶渥堆发酵的主要优势菌，同时也是普洱茶发酵早期的主要产香微生物[7]。除此之外，如表1所示，不同种类的黑茶在渥堆过程中都有丰富的霉菌，且由于产地及环境的不同，霉菌的种类也有所差别，从而也形成了各自独特的滋味品质。

1.2 黑茶渥堆过程中酵母菌的种类及变化

青砖茶在渥堆过程中酵母菌种类偏少，渥堆前期酵母菌的数量平稳，到第九天时数量开始大幅度下降，第十天进行翻堆，改变了茶堆环境，酵母菌数量呈现出与翻堆之前相似的规律，并在渥堆后期（渥堆第十九天）急剧下降，而此时细菌数量却急速上升。渥堆过程中微生物的生长代谢及不同种群之间的竞争关系会导致种群的此消彼长，数量差异大[8]。在普洱茶渥堆发酵过程中，酵母菌早期数量较少，随着发酵时间的增加，酵母菌的数量缓慢增加，到发酵后期较其他种类真菌数量增多。而茯砖茶渥堆发酵过程中，酵母菌始终处于主要地位，数量较黑曲霉和青霉多，由于酵母菌的活性大，渥堆后期的茶叶呈现出香甜的气味[6，11]。

表2统计了目前研究人员已分离的部分菌落，发现茯砖茶渥堆过程中酵母菌的种类丰富，丰富的酵母菌株可以明显改善茶叶发酵后的口感。

1.3 黑茶渥堆过程中细菌的种类及变化

黑茶渥堆过程中，细菌种类繁多（表3），徐倩等[8]利用高通量测序技术对青砖茶渥堆第九天及第十九天茶样鉴定发现，青砖茶细菌种类繁多，渥堆初期，细菌数量呈上升趋势，当渥堆进行到第九天时，细菌的数量达到一个阈值后又开始下降，并在末期反转爆发至高峰。整个渥堆期间，细菌的数量明显高于其他种类微生物，其中发酵中期以泛菌属（Pantoea gavini）、伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）数量居多，发酵末期以克雷伯氏杆菌属（Klebsiella）居多，并且在渥堆第十九天茶样中检测出了耐热性强的芽孢杆菌属（Bacillus）和脂环酸芽孢杆菌属（Alicyclobacillus），这表明耐热菌可能更适应长期的高温环境而快速繁殖。

在普洱茶发酵微生物研究中发现，普洱茶渥堆过程中细菌种类繁多，且随着渥堆程度的增加，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、赫氏埃希菌（Escherichia hermannii）等开始消失，而芽孢杆菌属在整个发酵过程中自始至终都存在，数量随着渥堆时间的延长而增长，成为后期发酵的优势菌群[4，12]。

不同于普洱茶和青砖茶，茯砖茶渥堆过程中细菌种类稀少，目前已报道的只有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），从原料毛茶一直到渥堆完成，枯草芽孢杆菌的数量处于相对平稳状态，同曲霉属和冠突散囊菌共同作用，成为茯砖茶渥堆过程中的主要微生物[6]。

1.4 黑茶渥堆过程中放线菌的种类及变化

放线菌能产生多种抗生素，特别是链霉菌属（Streptomyces），能够抑制部分有害菌的生长，对于茶叶发酵有良好的促进作用，放线菌在青砖茶渥堆的前期、中期、后期都有被发现，从渥堆的第六天至后期第十六天数量呈直线增长，渥堆结束后数量有所下降[8]。已报道的普洱茶发酵过程中放线菌种类丰富，渥堆二十一天之前出现的放线菌只有微杆菌属（Microbacterium orla-jensen）和红球菌属（Rhodococcus），而在渥堆第二十一天至渥堆结束，出现的放线菌种类偏多，包括短小杆菌属（Curtobacterium yamada）、考克氏菌属（Kocuria）、链霉菌属等（表4），其中未鉴定的表皮菌和考克氏菌属分离次数较多，是普洱茶发酵后期的优势微生物[5]。

目前对于茯砖茶渥堆发酵中放线菌的研究较少，暂未发现鉴定的具体种类。

1.5 黑茶渥堆过程中微生物种类多样性

由于微生物对温度耐受程度不同在不同的环境温度条件下必将产生种类及数量上的差异[9]。同理，不同地区黑茶在加工过程中温度条件和渥堆时间等工艺参数不一样，导致茶坯理化条件不一致，在渥堆过程中，微生物的含量及种类也会有所差别。

在普洱茶的渥堆过程中，酵母菌和霉菌是其中最为突出的优势菌株，曲霉菌和青霉菌在黑茶加工的各个环节均有发现，是黑茶加工过程中不可或缺的微生物，对茶叶中各物质之间的转化起着举足轻重的作用。

2 黑茶渥堆发酵过程中微生物群落研究技术

2.1 传统研究技术

传统的微生物群落研究方法主要是采用平板梯度稀释法对样品中的真菌进行分离纯化，根据纯化菌的形态特征，参照《真菌鉴定手册》观察菌株的生长情况，对菌落大小、形态、颜色等进行比对，并在光学显微镜下观察其菌丝形态，初步确定菌种类型。

发酵微生物种群的组成、功能特性等对黑茶的品质形成具有决定性影响，仅仅依靠传统培养分离鉴定方式具有很大的局限性。很多微生物在人工培养基上无法生长，且采用形态鉴定带有一定的主观性，无法鉴定到种的分类层级，微生物多样性的研究还是需要借助现代分子生物学技术。

2.2 分子生物学研究技术

与传统研究技术相比，分子生物学研究技术可靠性强、准确度高，能够检测群落中90%～99%的微生物。目前利用分子生物学研究微生物群落的技术包括荧光原位杂交技术（FISH）、基于16S/18S rRNA/rDNA的变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性技术、宏基因组技术、宏转录组技术等，经过研究人员不断探索和挖掘，已经能够对特定环境、特定时期微生物群落的功能、结构及代谢的多样性进行分析。

杨晓苹等[4]通过聚合酶链式反应－变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，对普洱茶渥堆过程中的微生物进行研究，分离出茶叶中的细菌和真菌，并进行克隆测序，建立了基因指纹图谱，完整地分析出渥堆发酵过程中微生物的群落结构及动态变化。刘石泉等[10]也采用DGGE技术，对茯砖茶中真菌群落的18S rDNA高变区进行扩增，最终完成了茯砖茶真菌群落的结构及多样性变化。该技术在1993年首次应用于微生物群落结构研究，目前对于PCR-DGGE技术的应用已经趋于成熟。

相比DGGE法，高通量测序操作简便，覆盖范围广。杨吉霞等[13]在茯砖茶微生物的研究中，采用16S rRNA基因和真菌ITS基因对样本进行高通量测序，利用生物信息分析技术，对茯砖茶微生物的群落结构进行了全面分析，高效准确地反映了茯砖茶在发酵过程中微生物多样性的变化。相较而言，DGGE仅能够反映有限的优势微生物类型，在很大程度上极可能低估微生物的物种组成并高估其丰度。

目前，对黑茶发酵过程中微生物群落的研究，大多是基于宏基因组的高通量测序及基于16S/18S rRNA/rDNA的DGGE技术。吕昌勇[14]采用宏基因组学技术，对普洱茶渥堆发酵过程中的某一茶样进行了高通量测序，初步获得了微生物群落及其功能信息，增加了对普洱茶微生物发酵的认识。虽然宏基因组技术能够详细展示黑茶微生物群落中的所有遗传信息，但已经死亡却尚未被分解的微生物遗传信息也会被检测到，这些微生物本身已经不主动参与到黑茶发酵中，从而会对研究结果产生一定影响。因此，结合代谢组学、转录组学的方法研究黑茶发酵过程中的微生物，才能精确地了解黑茶在发酵环境中正在发生的代谢过程，包括微生物群落、代谢产物、酶等[15]，研究其微生物基因转录情况及转录调控规律，从而真正了解黑茶渥堆发酵过程中不同微生物的功能及相互关系。

2.3 微生物的非培养鉴定技术

微生物的非培养鉴定技术迅速发展，通过利用微生物生物化学活性特征，相应衍生出了各种微生物群落多样性的研究方法，包括脂质分析技术、蛋白质体学研究技术及Biolog-Eco技术[16]，其中Biolog-Eco被广泛用于微生物群落代谢活性多样性的研究[17]。但上述技术尚未发现用来分析黑茶渥堆发酵过程中微生物群落的状态，若将这些技术应用在茶叶发酵微生物群落的研究中，可能会有不一样的发现。

3 菌种添加发酵对黑茶品质的影响

研究表明，人工添加菌种发酵黑茶能够大大缩短发酵周期，提高发酵效率。付秀娟等[18]将单一霉菌、酵母菌、细菌分别加入普洱茶发酵工艺中发现，霉菌对黑茶品质影响较大，酵母菌次之，细菌影响不大，且将霉菌和酵母菌混菌发酵黑茶效果更佳。彭翠珍等[19]对云南普洱茶进行人工接种菌种发酵研究表明，将黑曲霉和酵母组合，以及青霉和酵母组合分别发酵5 d后，和未添加菌种以及单一霉菌添加的茶叶相比，组合菌种处理的茶堆内部菌丝生长丰茂，发酵启动快；对不同菌种发酵28 d后感官及理化评估发现，组合菌种发酵的黑茶汤色、叶底较好，茶红素和茶褐素含量较其他处理高，滋味醇和，接近陈化3年的特级普洱茶。

除了霉菌和酵母组合发酵外，霉菌和细菌的组合对发酵也有一定的促进作用，研究表明，烟曲霉和枯草芽孢杆菌是黑茶发酵过程中的核心微生物，烟曲霉能够转化多酚类化合物，而枯草芽孢杆菌能增强烟曲霉的生物转化能力。Xu等[20]在青砖茶发酵工艺中同时添加烟曲霉和枯草芽孢杆菌发现，渥堆6 d的茶叶品质与传统发酵35 d的品质一致，说明同时添加这两种真菌能够缩短发酵周期，提高生产效率；另外，研究人员在普洱茶中分离出产黄青霉，将其添加到普洱茶原料中发酵，发现其能改变发酵过程中的真菌群落，使得成茶口感更醇厚，陈化程度更深[21]。

研究人员还发现，在黑茶发酵过程中添加功能性菌株能够开发功能性黑茶。Wang等[22]利用塔宾曲霉进行液态发酵，可生产出高茶褐素速溶普洱茶，该茶中的活菌及微生物毒素相对来说偏少，各种元素低于权威机构推荐的安全限量，茶味温和顺滑、醇厚饱满，用此菌液态发酵黑茶安全、快速。茶叶不同香气特征形成在于关键香气化合物和核心功能微生物的作用，针对茯砖茶独特的“真菌花”香气，Zheng等[23]采用GC-MS和GC-O分析方法从茯砖茶中共鉴定出43种挥发物和38种气味活性化合物，进一步验证了这些气味活性化合物可以成功地模拟茯砖茶的整体香气特征；Li等[24]采用HS-SPME/GC-MS和Illumina MiSeq对六堡茶3种香气类型的香气谱和真菌群落进行了分析，基于O2PLS分析，真菌属被确定为影响挥发性特征变化的核心功能微生物。Ling等[25]从茶叶中分离GFs（Golden flowers），GFs的游离氨基酸和多糖含量较高，微生物作用改变了GF中的黄酮类化合物的结构，降低了茯砖茶的苦味，产生了特有的果香和花香。此外，研究还表明，简青霉（Penicillium simplicissimum）和聚多曲霉（Polyporus versicolor）都具有降解黑茶中咖啡碱的能力。Zhou等[26]将聚多曲霉添加至普洱茶干毛茶中发酵发现，咖啡碱的降解效果显著，去甲基化是聚多曲霉次生代谢中咖啡碱降解的主要途径。另外，Yu等[27]将简青霉添加至青砖茶晒青毛茶中渥堆发酵，结果表明除咖啡碱下降了近50%外，毛茶经菌种发酵后其大部分品质成分与传统发酵相似，部分内含物质含量高于传统发酵。目前，利用菌株发酵茶叶开发新品还需深入研究，以期能够探索出更多复合口味及功能的茶产品。

4 黑茶有害微生物的产生

黑茶的工厂化生产在各个环节已基本实现标准化，农药残留和重金属超标的问题也已引起了高度关注，但对于有害微生物问题还没有引起足够重视。微生物既有有益菌也有有害菌，有益菌对改善茶叶质量和促进人体健康都有积极的作用，而有害菌不仅影响茶叶品质，还会有损人体健康。

黑茶属后发酵茶，黑茶的加工需要大量微生物的参与，黑茶生产中不可避免地会在特定阶段产生一些有害微生物[28]，如在茶园种植过程中，未经处理的有机粪肥、菌肥中可能有致病菌、产毒真菌等；鲜叶人工采摘过程中可能存在接触污染，运输工具和盛装器具污染等；初制过程中，加工机械存在未清理干净的残存物污染，手工揉捻存在操作人员和器具污染，渥堆时长时间高水分和湿热条件，有利于霉菌和细菌大量繁殖；精制过程中，风选时从环境中抽取的风中可夹带真菌和细菌等；另外，茶叶包装、仓储、运输过程中都有可能因为人员、器具、环境管理疏忽，导致霉菌、大肠菌群等污染。

黑茶消费方式主要是冲泡和煮沸饮用，也有在茶叶中添加其他食品成分进行混合使用，消费者在这些消费过程中也可能造成有害微生物的污染。

黑茶加工和饮用过程中，由细菌产生毒素的污染是重大危害，如渥堆发酵或半成品没有及时加工干燥而产生霉菌，以及一些耐受高温的嗜热性芽胞杆菌都会带来危害风险。

5 结语

黑茶渥堆发酵时微生物的变化直接影响着产品品质的好坏，目前有关普洱茶、青砖茶和茯砖茶渥堆微生物种类及变化的研究数据文献虽然颇多，但由于茶原料、生产地域、发酵环境及发酵工艺方面的差异，对各种茶的优势菌、微生物种群差异和有害微生物的区别等还不足以形成一致的结论。此外，对于渥堆过程中未培养菌的开发，以及菌株的代谢及功能研究亦存在一定的空白。利用宏基因组学、转录组学及代谢组学技术将能很好地弥补这些空缺，可为黑茶的高品质稳定生产提供帮助，并为黑茶风味发酵、功能菌株发酵等多元化产品提供菌种筛选依据。

参考文献

[1] 郑鹏程， 谭荣荣， 刘盼盼， 等. 青砖茶渥堆过程中真菌种类及品质变化研究[J]. 食品科技， 2017， 42（11）： 22-26.

[2] 王波. 青砖茶中的真菌及其散囊菌黄色素的研究[D]. 南京： 南京农业大学， 2009.

[3] 王桥美， 彭文书， 杨瑞娟， 等. 普洱茶发酵过程中可培养微生物的群落结构分析[J]. 食品与发酵工业， 2020， 46（20）： 88-93.

[4] 杨晓苹， 罗剑飞， 刘昕， 等. 普洱茶固态发酵过程中微生物群落结构及变化[J]. 食品科学， 2013， 34（19）： 142-147.

[5] 赵明， 张冬莲， 袁文侠， 等. 普洱茶发酵过程微生物多样性的454 pyrosequencing研究[C/OL]// 中国科学技术协会， 云南省人民政府. 第十六届中国科协年会——分12茶学青年科学家论坛论文集， 2014： 61-68[2024-6-22]. https：//kns.cnki.net/knavi/conferences/proceedings/DIDD201405011/detail？uniplatform=NZKP.

[6] 胡治远， 刘素纯， 赵运林， 等. 茯砖茶生产过程中微生物动态变化及优势菌鉴定[J]. 食品科学， 2012， 33（19）： 244-248.

[7] LI Z Y， FENG C X， LUO X Q， et al. Revealing the influence of microbiota on the quality of Pu-erh tea during fermentation process by shotgun metagenomic and metabolomic analysis[J]. Food Microbiology. 2018， 76： 405-415.

[8] 徐倩. 青砖茶渥堆过程中优势耐热菌对茶叶品质的影响[D]. 合肥： 安徽农业大学， 2018.

[9] 徐正刚， 吴良， 刘石泉， 等. 黑茶发酵过程中微生物多样性研究进展[J]. 生物学杂志， 2019， 36（3）： 92-95.

[10] 刘石泉， 胡治远， 赵运林. 用DGGE法初步解析茯砖茶渥堆发酵过程中真菌群落的结构[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）， 2014， 40（5）： 494-500， 505.

[11] 李雪玲， 陈华红， 段海秀， 等. 普洱茶渥堆及发酵罐发酵过程中优势微生物的研究[J]. 食品科技， 2017， 42（6）： 35-40.

[12] ZHAO M， XIAO W， MA Y， et al. Structure and dynamics of the bacterial communities in fermentation of the traditional Chinese post-fermented pu-erh tea revealed by 16S rRNA gene clone library[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology， 2013， 29（10）： 1877-1884.

[13] 杨吉霞， 曾祥平， 蒲慧敏， 等. 陕西茯砖茶的微生物多样性和群落结构[J]. 食品与发酵工业， 2020， 46（3）： 50-57.

[14] 吕昌勇. 普洱茶渥堆发酵过程中微生物宏基因组学的测定与分析[D]. 昆明： 昆明理工大学， 2013.

[15] ZHAO M， SU X Q， NIAN B， et al. Integrated meta-omics approaches to understand the microbiome of spontaneous fermentation of traditional Chinese Pu-erh tea[J/OL]. mSystems， 2019， 4（6）： e00680-19. https：//doi.org/10.1128/msystems.00680-19.

[16] 雒国兴. 现代生物化学与分子生物学在植物微生物生态学中的应用[J]. 热带农业工程， 2019， 43（5）： 211-213.

[17] 吴兰， 程家劲， 贺勇， 等. 基于Biolog-Eco法对鄱阳湖不同湿地类型下土壤微生物功能多样性[J]. 南昌大学学报（理科版）， 2020， 44（6）： 585-592.

[18] 付秀娟， 宋文军， 徐咏全， 等. 不同种类微生物对普洱茶发酵过程的影响[J]. 茶叶科学， 2012， 32（4）： 325-330.

[19] 彭翠珍， 刘川， 李晚谊. 云南普洱茶人工接种发酵研究[J]. 云南大学学报（自然科学版）， 2008（S1）： 351-355.

[20] XU Q， SUN M， NING J M， et al. The core role of bacillus subtilis and aspergillus fumigatus in pile-fermentation processing of Qingzhuan brick tea[J]. Indian Journal of Microbiology， 2019， 59（3）： 288-294.

[21] LIU K Y， WANG L Y， JIANG B， et al. Effect of inoculation with Penicillium chrysogenum on chemical components and fungal communities in fermentation of Pu-erh tea[J/OL]. Food Research International， 2021， 150： 110748. https：//doi.org/10.1016/j.foodres. 2021.110748.

[22] WANG Q P， BOJAN Š， JASNA J， et al. Evaluation of microbial toxins， trace elements and sensory properties of a high‐theabrownins instant Pu‐erh tea produced using Aspergillus tubingensis via submerged fermentation[J]. International Journal of Food Science & Technology， 2019， 54（5）： 1541-1549.

[23] ZHENG X X， HU T F， XIE H， et al. Characterization of the key odor-active compounds in different aroma types of Fu brick tea using HS-SPME/GC-MSO combined with sensory-directed flavor analysis[J/OL]. Food Chemistry， 2023， 426： 136527. https：//doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.136527.

[24] LI Q， HONG X， ZHENG X X， et al. Characterization of key aroma compounds and core functional microorganisms in different aroma types of Liupao tea[J/OL]. Food Research International， 2022， 152： 110925. https：//doi.org/10.1016/j.foodres.2021.110925.

[25] LING Z H， XIAO W J， WU Y L， et al. Quality composition， content change， and distribution characteristics of Fu brick tea before and after fungal fermentation[J/OL]. SSRN Electronic Journal， 2023， 10： 4353464. https：//doi.org/10.2139/ssrn.4353464.

[26] ZHOU B X， MA C Q， REN X Y， et al. LC-MS/MS-based metabolomic analysis of caffeine-degrading fungus Aspergillus sydowii during tea fermentation[J]. Journal of Food Science， 2020， 85（2）： 477-485.

[27] YU Z L， DENG H H， QU H， et al. Penicillium simplicissimum possessing high potential to develop decaffeinated Qingzhuan tea[J/OL]. LWT， 2022， 165： 113606. https：//doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113606.

[28] 彭争光， 何文斌， 朱金国， 等. 湖南出口黑茶生产加工中有害微生物危害分析及控制措施研究[J]. 中外食品工业（下）， 2014（5）： 13-14， 16.