天水大樱桃白纹羽病病原菌分离鉴定

摘" "要" "在天水大樱桃主要产区，通过组织分离法对疑似白纹羽病样进行分离培养，选取优势病原菌种类，采用离体枝条接种法进行致病性测定，观察分离物形态特征并结合16SrDNA序列分析进行菌种鉴定。通过组织分离和纯化，获得3株分离物，经形态学观察和分子生物学鉴定，均为褐座坚壳菌[ Rosellinianecatrix（Hart.）Berl ]。对3株分离物进行致病性测定，均能侵染大樱桃枝条，并且在枝条表面形成白色网状菌索。试验证明，大樱桃白纹羽病在天水地区存在，且致病菌为褐座坚壳菌。

关键词" "天水;大樱桃;白纹羽病;褐座坚壳菌;鉴定

大樱桃喜光、喜温、喜湿、喜肥，适合在沙壤土或砾质壤土上生长。天水地处甘肃东南部，属北暖温带大陆性气候，海拔1 085～3 120 m，年均温9.6 ℃，平均日照时数2 114.3 h，无霜期140～186 d，年降水量480～610 mm，非常适合大樱桃生长。据2022年天水市果业办统计，天水大樱桃种植面积8.51万亩，产量3.2万t，产值6.68亿元，其中秦州区6.05万亩，产量2.29万t，产值4.74亿元。

大樱桃白纹羽病主要危害果树的根部，引起根腐，在我国主要分布于东北、华北、华南等地。其致病菌为褐座坚壳菌，自然条件下主要通过病健部接触或带菌苗木传播，病菌可形成白色菌丝体和菌索，也可形成子囊壳，严重时导致全根腐烂，树体逐渐枯死。目前对于白纹羽病的研究主要集中在笔柏、苹果、梨等树种上，在大樱桃上未见报道。

近年来，天水大樱桃种植面积急剧扩增，导致病害多发，尤其是土传病害愈发严重，其中有些病症高度疑似白纹羽病。针对此，我们采用组织分离法对大樱桃疑似病样进行分离培养，采用离体枝条接种法进行病原菌致病性测定，旨在确定天水大樱桃产区是否存在白纹羽病致病菌，为该病的诊断与防控提供理论依据。

1" "材料与方法

1.1" "布点调查" "2023年3—5月，在天水市甘谷县新兴镇颉家村满意樱桃园、天水市秦州区果树研究所樱桃种质资源圃、天水市秦州区秀金山欣晟果业合作社樱桃园、天水市秦州区玉泉镇烟铺村大樱桃种植基地、天水市麦积区甘泉镇白石村甘肃华实高效农业开发有限公司基地、天水市麦积区南山万亩樱桃种植基地、天水市张家川龙山镇马河村樱桃标准化示范基地、天水市武山县咀头乡咀头村润博种植专业合作社8处调查大樱桃树体萎蔫至枯死的植株，并查看地下根系坏死情况，观察根系是否出现白色菌丝（疑似病株判别标准）。

1.2" "试验材料

1）病株样本。在不同果园采集大樱桃病根，装入自封袋，记录采集时间、采集地点等信息，做好标签带回实验室，置于4 ℃冰箱中恒温保存。

2）供试培养基。选用PDA培养基，主要配方：削过皮的土豆200 g，琼脂15～20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3" "试验方法

1）病原菌分离。采用组织分离法，以发病特征明显的大樱桃根部组织为材料，用无菌刀在病健交界处切取3 mm×3 mm的病变组织，用75%酒精、2.5%次氯酸钠杀菌3次，置于PDA培养基上，28 ℃恒温培养，直到出现菌落。将单个菌落纯化培养，置于PDA倾斜培养基中，4 ℃冷藏，待用。

2）菌种保存。将纯化后的菌株接种于PDA培养基上，28 ℃恒温培养，大约14 d后在无菌操作台上收集菌丝于冻存管中，-20 ℃下保存。

3）致病性测定。采用离体枝条接种法测定致病性。选用健康的大樱桃枝条，依次用75%酒精和2.5%次氯酸钠消毒处理，然后用蒸馏水冲洗3次，每个枝条接种1块直径5 mm的病原菌菌饼，设3次重复。接种PDA培养基菌饼作为对照。培养皿中铺4层湿润的滤纸，置于25 ℃恒温培养箱中培养，分别于接种后5、7、10 d观察离体枝条发病情况。

4）病原菌再次分离。病原菌再次分离的目的是完成赫氏法则验证，主要步骤：从已接种的发病枝条的病健交界处取5 mm×5 mm组织块，按照组织分离法对病原菌进行再次分离。

5）病原菌形态学鉴定。将病原菌用PDA培养基扩增培养后，于25 ℃下培养7 d，对菌体、菌落色、形状等进行观察，用参考文献14所述方法进行形态学鉴定。

6）病原菌分子生物学鉴定。 根据真菌DNA提取试剂盒的说明，采用超痕量分光光度计测定DNA的纯度及浓度，将样本稀释为50 ng/μL标准溶液， 待用。94 ℃预变性5 min， 94 ℃变性30 s，62 ℃预变性50 s，72 ℃延伸l min，循环" 30次。在72 ℃下进行5 min的保存。扩增完成后，将扩增产物送入生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。利用 NCBI的 BLAST序列对测序数据进行同源性比对，并利用 MAGE6.0软件，通过相邻连接法建立系统发育树，并进行" " 1 000次反复验证。

2" "结果与分析

经调查，大樱桃白纹羽病典型症状在天水市甘谷县、秦州区、麦积区、张家川、武山县大樱桃园均有出现。

2.1" "症状特征" "主要发生在大樱桃的根部， 在根部组织形成白色网状菌索（图1），" 菌丝深入木质部导致根部腐烂， 严重时树体叶片枯黄最终坏死。

2.2" "菌株的分离纯化" "从天水市甘谷县、秦州区、麦积区、张家川、武山县采集到的病株上共分离出3个分离物，挑取单孢进行纯化培养，得到3株纯化菌株（图2），分别命名为GF-1、GF-2、GF-3。

2.3" "病原菌的致病性测定" "病原菌的致病性测定采用离体大樱桃枝条接种法，在接种的4～14 d内均可看见白色菌索覆盖在离体枝条上（图3A），这与在田间大樱桃根部发现的症状一致，而空白对照在大樱桃离体枝条上未出现白色菌索（图3B）。通过再分离实验完成科赫氏法则验证，得到的分离物与初次得到的分离物形态一致，说明分离物对大樱桃枝条具有致病性，初步可以认定本研究分离的菌株为大樱桃白纹羽病病原菌。

2.4" "病菌的形态特征" "将该病菌在PDA培养基上培养3 d后，其白色菌团的大小可以达到2.5±0.5 cm（图4A）。继续培养7 d后，菌团可以完全遮盖整个培养皿（图4B）。菌团圆形，边沿羽状，中部较稠密，没有着色;菌丝具有隔膜和分枝，分枝较细（图4C）。其形态特征与褐座坚壳菌[ Rosellinianecatrix（Hart.）Berl ]的特点相吻合。

2.5" "菌株16SrDNA序列分析" "从3种病原菌中提取DNA，采用16SrDNA普通引物，每个引物可得到500 bP左右的目标带，分离纯化后测序。通过BLAST比对，利用 MAGE6.0软件构建系统发育树（图5），结果显示它们都是褐座坚壳菌的16 SrDNA序列。菌株GF-2与西班牙鳄梨上分离的MK430555.1组成一组，相似率为100%，菌株GF-1和菌株GF-3与来自印度喜马偕尔邦的苹果树上分离的褐座坚壳菌株HG964402.1组成一组，相似率为100%。这表明，引起天水大樱桃白纹羽病的病原菌至少存在2个种。

3" "小结与讨论

大樱桃白纹羽病在天水市甘谷县、秦州区、麦积区、武山县、张家川均有分布。通过致病性测定，分离出的菌株GF-1、GF-2、GF-3在离体条件下能够侵染大樱桃枝条。分析来自不同地区白纹羽病病菌的16SrDNA序列，发现菌株GF-1、GF-3与HG964402.1组成一组，分离菌株GF-2与MK430555.1组成一组，表明引起天水地区大樱桃白纹羽病的褐座坚壳菌至少存在2个种。

白纹羽病是果树根腐病的一种，由于发生较少，目前在大樱桃上尚未见相关报道，在甘肃天水地区是否有该病发生尚不明确。对白纹羽病的研究目前主要集中于苹果、梨等树种，Hossein Golafrouz等人对引起梨根腐的褐座坚壳菌做了深入研究，结果表明：分离来自伊朗的芽孢杆菌和木霉可对褐座坚壳菌有明显的拮抗作用，为该病的生物防治提供了新的思路。Sawant Shailesh S等人从梨园土壤中分离出32株致病菌，鉴定发现其菌株都是引起梨树根腐的褐座坚壳菌。在苹果树种上，Pasini Luca等人研究表明，褐座坚壳菌是导致苹果发生根腐的主要原因，并且这种病原菌难以控制，通过温室盆栽试验表明木霉对该病菌有一定的生防效果。Nazeer等人对引起苹果树根腐的病原菌做了系统研究，认为引起苹果树根腐病的病原菌主要是褐座坚壳菌，并且筛选出抑制褐座坚壳菌的生防菌株。

国内外有关大樱桃树种由于褐座坚壳菌引起根腐的研究尚无。本研究利用常规组织分离法、病原菌致病性测定、病原菌形态学鉴定及分子生物学鉴定等方法，确定了天水地区大樱桃发生白纹羽病的病原种类为褐座坚壳菌，这一结论与前人研究一致，也是有关天水地区大樱桃白纹羽病的首次报道，希望对该病在大樱桃上的防控技术研究提供一定的理论基础。

参考文献

[1] 王晓梅. 大樱桃树一种新型病毒病病原的形态学与分子生物学鉴定[D].长春：吉林农业大学， 2003.

[2] 刘俏. 青海省樱桃叶斑病病原种类鉴定及防治药剂室内筛选研究[D].西宁：青海大学， 2021.

[3] 杨瑞斌，张庆和，黄亚萍.天水甜樱桃产业发展中的问题及优化升级建议[J].北方果树， 2019（06）：38-40.

[4] 杨焕昱，杨映红.天水市大樱桃产业现状及发展对策[J].甘肃农业科技，2022，53（01）：17-22.

[5] 潘新龙，周聪，寸海春，等.云南苹果白纹羽病原菌的分离与鉴定[J].中国南方果树，2022，51（03）：166-170.

[6] 何子顺，张虎平.果树白纹羽病的发生与防控[J].北方果树，2018（06）：28-29.

[7] 田保强.甘肃天水苹果白纹羽病的发生规律与综合防控[J].果树实用技术与信息，2019（10）：31-32.

[8] 吴大椿，刘宝花.笔柏根腐病病原及病原菌的寄生木霉研究[J].长江大学学报（自科版）农学卷，2005（04）：5-7+18+1.

[9] 潘新龙，周聪，寸海春，等.云南苹果白纹羽病原菌的分离与鉴定[J].中国南方果树，2022，51（03）：166-170.

[10] 方中达. 植病研究方法[M].北京：高等教育出版社，1957.

[11] 许姗姗，朱丽萍，孔宝华，等.云南苹果园根际真菌的分离与鉴定[J].中国南方果树，2019，48（06）：149-154.

[12] 周玉霞，张美鑫，翟立峰，等.梨和苹果腐烂病菌不同培养表型菌株的致病性分析[J].植物病理学报，2014，44（02）：217-220.

[13] 董金皋. 农业植物病理学（3版）[M].北京：中国农业出版社，2015.

[14] 姚凡. 宁夏马铃薯疮痂病病原菌分离鉴定及生物防治药剂研究[D].银川：宁夏大学，2023.

[15] Effect of host genotype on biocontrol of white root rot in Pyrus communis L. rootstocks by Trichoderma harzianum and Bacillus spp.[J].Journal of Phytopathology，" 2023， 171（11-12）： 723-" 730.

[16] Sawant S S， Song J， Seo H J.Characterization of Bacillus velezensis RDA1 as a Biological Control Agent against White Root Rot Disease Caused by Rosellinia necatrix[J].Plants， 2022， 11.

[17] Pasini L， Prodorutti D， Pastorelli S，et al.Genetic Diversity and Biocontrol of Rosellinia necatrix Infecting Apple in Northern Italy[J].Plant Disease， 2016， 100（2）：150818093929006.

[18] Nazeer，Ahmed，S.K，et al.Antagonistic activity of Pseudomonas isolate" against" st em" bark" canker" and" white" root rot of Apple[J].Annals" of Plant Protection Sciences， 2014.

（文中部分图片彩版见封二）