月季炭疽病内生拮抗细菌的筛选鉴定及抑菌作用

摘要：【目的】发掘月季内生拮抗细菌资源，为月季炭疽病生物防治提供高效而稳定的拮抗菌株资源。【方法】 以20个健康无病害蔷薇属植物的叶片为试验材料，采用组织匀浆法分离叶片内生细菌，采用平板对峙法筛选对月季 炭疽病病原菌（Colletotrichum fructicola）YJY-20具有拮抗作用的内生细菌菌株，结合菌落形态、生理生化和16S rRNA序列分析对拮抗菌进行种类鉴定。利用平板对扣法测定拮抗菌挥发性有机化合物的拮抗效果；利用牛津杯扩 散法测定拮抗菌无菌发酵液对炭疽病病原菌及菌丝的影响；通过PCR扩增脂肽类抑菌物质合成基因；采用琼脂孔扩 散法测定拮抗菌粗蛋白和脂肽类抑菌物质的抑菌活性；利用平板检测法测定拮抗菌产胞外酶活性；通过平板对峙法 测定拮抗菌对12种植物病原真菌的抑制效果；采用离体叶片试验测定拮抗菌发酵液对月季炭疽病的防治效果。【结 果】从蔷薇属植物叶片中分离筛选出2株对菌株YJY-20具有较强拮抗效果的内生细菌DMGSMG4和QZM1，经鉴定分 别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）。菌株DMGSMG4和QZM1的挥 发性有机化合物对菌株YJY-20的抑制率分别为11.72%和30.71%，同时能减少病原菌黑色素生成；其无菌发酵液对菌株YJY-20的抑制率分别为60.25%和61.24%，并能造成病原菌菌丝断裂扭曲。菌株DMGSMG4和QZM1粗蛋白对菌株YJY-20的抑制率分别为59.76%和50.63%，且热稳定性较好；其脂肽类抑菌物质对菌株YJY-20的抑制率分别为50.07% 和45.03%。2株拮抗菌均能扩增出bmyB、fenD、srfAA和srfAB脂肽类抑菌物质合成相关基因。2株拮抗菌可产纤维素 酶和蛋白酶，其中菌株DMSGMG4还可产有机酸。菌株DMGSMG4和QZM1对12种植物病原真菌的抑制率均大于50.00%，其对月季炭疽病离体叶片防治率分别为59.35%和20.58%。【结论】筛选获得的菌株DMGSMG4和QZM1对炭 疽病病原菌具有较强的拮抗效果，具有作为月季炭疽病生防菌株的潜力。

关键词：月季；炭疽病；内生细菌；拮抗菌；生物防治

中图分类号：S436.81

文章编号：2095-1191（2024）04-1046-14

文献标志码：A

Screening， identification and bacteriostasic activity of antagonistic endophytic bacteria against Rosa chinensis Jacp.anthracnose

WU Rui1，2， YUAN Mei-jing1，2， KANG Xiao-ling1.2， DU Chong-yang1，2， SUN Rui-rui1，DING Chuan-yu1，2， DU Li1，2，3*

（1College of Life Science and Agricultural Engineering， Nanyang Normal University， Nanyang， Henan 473061， China; 2Henan Province Engineering Research Center of Rose Germplasm Innovation and Cultivation Technique， NanyangNormal University， Nanyang， Henan 473061， China; 3Analysis and Test Center，Nanyang NormalUniversity，Nanyang，Henan 473061， China）

Abstract：【Objective】To explore the resources of endophytic antagonistic bacteria of Rosa chinensis Jacp.， and pro- vide efficient and stable antagonistic strain resources for biocontrol of R. chinensis anthracnose. 【Method】The leaves of 20 healthy and disease-free Rosa species were used as test materials， the endophytic bacteria were isolated from the leavesby tissue homogenization method， the endophytic bacteria strains with antagonistic effect against Colletotrichum fructicola YJY-20 were screened by plate confrontation method. The antagonistic bacteria were identified according to colony morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. The antagonistic effect againstC. fructicola YJY-20 of volatile organic compounds from antagonistic bacteria were determined by plate interlocking method. The inhibitory activity of sterile fermentation broth of the antagonistic bacteria on C. fructicola YJY-20 and its hyphae were determined by the Oxford cup diffusion method. The PCR was used to amplify lipopeptide biocontrol functional genes. The inhibitory activity of the crude protein and lipopeptide antibacterial substance from antagonistic bacteria against C. fructicola YJY-20 were determined by agar well diffusion method. The extracellular enzyme activity of the antagonistic bacteria were detected by plate assay method. The inhibitory activity of antagonistic bacteria against 12 different plant pathogenic fungi were determined by plate confrontation method. The control effects of fermentation broth of antagonistic bacteria against R. chinensis anthracnose caused by C. fructicola were detected by in vitro leaves experiment. 【Re- sult】Two endophytic bacteria strains DMGSMG4 and QZM1 with strong activity against C. fructicola YJY-20 were iso- lated and screened from the leaves of Rosa species， and they were identified as Bacillus amyloliquefaciens and B. velezen- sis respectively. The inhibition rates against C. fructicola YJY-20 of strains DMGSMG4 and QZM1 volatile organic com- pounds were 11.72% and 30.71% respectively， and they both could reduce melanin production of C. fructicola YJY-20.The inhibition rates against C. fructicola YJY-20 of strains DMGSMG4 and QZM1 sterile fermentation broth were 60.25% and 61.24% respectively， and they could cause hyphae of C. fructicola YJY-20 breakage and distortion. The inhibition rates against C. fructicola YJY-20 of strains DMGSMG4 and QZM1 crude protein were 59.76% and 50.63% respectively， and their thermal stability was good. The inhibition rates of the strains DMGSMG4 and QZM1 lipopeptide antibacterial compounds on C. fructicola YJY-20 were 50.07% and 45.03% respectively. The two strains both could amplify lipopeptide antibacterial substance synthetic related genes such as srfAA， srfAB， fenD and bmyB. The two strains both could produce cellulase and protease， and strain DMSGMG4 could produce organic acids. The inhibition rates of two strains DMGSMG4 and QZM1 were more than 50.00% against 12 different plant pathogenic fungi， and control rates on the in vitro leaves with anthracnose were 59.35% and 20.58% respectively. 【Conclusion】The screened strains DMGSMG4 and QZM1 have strong antagonistic effect against C. fructicola， and they show potential to be biocontrol strains for R. chinen- sis anthracnose.

Key words： Rosa chinensis Jacp.; anthracnose; antagonistic strain; biological control

Foundation items： Henan Youth Science Foundation Project （232300420450） ; Henan Postgraduate Education Reform and Quality Improvement Project （YJS2021JD17）; Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students of Henan （202210481043） ;Nanyang Soft Science Research Project （RKX011）

0 引言

【研究意义]月季（Rosa chinensis Jacq.）为蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）植物，是我国十大传统名花之一，被广泛应用于园林造景、切花和盆栽等，其花、根和叶均可入药，且含有多种营养物质，具有较高的观赏价值、食用价值和药用价值（贺蕤等，2017；李思思等，2022；刘天天等，2023）。近年来，随着市场需求量增多，月季种植面积迅速扩大。然而，月季在种植过程中常发生一些病害导致其观赏价值和药用价值受到影响（程茂高和乔卿梅，2011），其中炭疽病的危害极大。月季炭疽病致病菌主要为炭疽菌属（Colletotrichum），该属真菌的寄主范围广，属于一类全球分布的植物病原真菌（刘丽萍等，2020）。月季感染炭疽菌后，叶片会出现不规则的棕色斑点，随着病害加重，斑点逐渐扩大并变为深棕色（Duetal.，2023），最终出现叶片脱落和植株死亡等现象。目前，炭疽病防治以化学农药为主，但长期使用会造成土壤酸化和水源污染等问题，还易使病原菌产生耐药性。生物防治因具有安全、环保和高效的优点，被认为是化学农药的替代品。因此，发掘月季丰富的内生拮抗菌资源，对月季产业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，国内外针对月季炭疽病的研究主要集中在病原菌的分离鉴定及其致病基因调控方面，并已分离出胶孢炭疽菌（C.gloespo-rioides）（Rivera et al.，2000）、暹罗炭疽菌（C.sia-mense）（Feng et al.，2019）、博宁炭疽菌（C.boni-nense）（Ding et al.，2021）和果生炭疽菌（C.fructi-cola）（Du et al.，2023）等，病原菌的分离为月季炭疽病防治提供了参考依据。此外，Liu和Li（2019）对月季炭疽菌（C.siamense）侵染机制进行了研究，发现转录因子CsBzip10在炭疽菌的表达和致病性中发挥着重要作用，该基因敲除后能显著抑制炭疽菌分生孢子和附着孢形成。炭疽病已成为月季高发病害，但化学农药防治效果并不理想，因而研究者逐渐将目光转向生物防治。研究表明，内生菌对不同植物炭疽病具有较好的防治效果（欧婷等，2022）。蒋晶晶等（2020）从健康葡萄叶片中分离获得1株贝莱斯芽孢杆菌X1-6-1，该菌株对葡萄炭疽病菌具有显著的拮抗作用。石杨等（2022）从牡丹中分离获得的枯草芽孢杆菌FJ1.3对牡丹炭疽病具有较好的拮抗作用，其离体叶片防治率为47.06%，且可产生蛋白酶和纤维素酶。Feng等（2022）从核桃根部分离筛选出的暹罗芽孢杆菌WB1对核桃炭疽病病原菌（C.acutatum）具有较好的拮抗效果，其温室盆栽防治率为51.32%，且能增强植株相关防御酶活和促进植株生长。Wei等（2023）从辣椒叶中分离获得的解淀粉芽孢杆菌L1-7和贝莱斯芽孢杆菌L3-5对辣椒炭疽菌（C.scovillei）有较强的抑制作用，其室内盆栽防治率分别为80.64%和73.39%，且2株菌株均可产生IAA和溶解磷，具有一定的促生功能。内生菌在月季炭疽病防治上也有一定成效。宋光桃等（2021）从月季、银杏、钩藤、黑老虎和山苍子植物叶片中分离筛选拮抗内生菌，结果发现5种植物叶片中均存在对月季炭疽菌具有抑菌作用的菌株，其中从月季叶片中分离获得的细菌菌株YJX2的拮抗效果较好，拮抗圈大小为8.6mm。莫维弟等（2022）从健康月季叶片中分离出137株芽孢杆菌，通过平板对峙法筛选出5株对炭疽病菌（C.boninense）抑菌效果较好的菌株，其中解淀粉芽孢杆菌GUHS97的抑菌效果最好，抑菌率为77.85%，且田间防治试验效果优于化学药剂。【本研究切入点】内生菌在植物炭疽病防治中已展现出良好的生防作用，但由于拮抗菌自身特性和自然环境的影响，在实际生产中能稳定有效防治植物炭疽病的拮抗菌株较少。目前，国内关于月季炭疽病拮抗菌的研究报道较少，缺乏高效稳定的生防菌株，且对拮抗菌的抑菌物质及拮抗机理缺乏深入研究。【拟解决的关键问题】以20个蔷薇属植物种类为研究对象，采用组织匀浆法分离月季叶片内生细菌，采用平板对峙法和混合平板法筛选对炭疽菌具有拮抗效果的内生细菌菌株，对拮抗菌株进行分类鉴定，并初步探究其抑菌物质和拮抗机理，以期为月季炭疽病生物防治提供高效而稳定的拮抗菌株资源，实现月季炭疽病生物防控。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试材料

供试植物叶片材料采集于南阳师范学院月季种质资源苗圃中心（32°58'45.66\"N，112°28'31.76\"E）5年生健康无病害的20个蔷薇属植物，包括大马革士蔷薇、野蔷薇、黄木香、瑞典女王、七姊妹蔷薇、夏令营、朝圣者、紫色天际线、藤冰山、藤本樱霞、粉团蔷薇、艾拉绒球、安吉拉、哈德福俊、红色沙龙宝石、嫦娥奔月、蜂蜜焦糖、欢笑格鲁吉亚、雀之舞和薰衣草花环。

1.1.2 供试病原真菌

月季炭疽病病原菌（C.fruc-ticola）YJY-20、YJY-22、YJY-23和花生白绢病病原菌（Sclerotium rolfsii Sacc）H2-1，由河南省月季种质创 新与栽培技术工程研究中心实验室分离保存；大叶黄杨稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）HY12、石榴白二轮 篮状病病原菌（Talaromyces albobiverticillius）Tp-2、 大叶黄杨拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis disseminata）HY98、白玉兰叶斑病病原菌（Diaporthe pesciola）BYL-9、石榴叶斑病病原菌（Dwiroopa punicae）SL1-2、石榴叶斑病病原菌（Pilidiella granati）SL1-1、 石榴叶斑病病原菌（Alternaria alternata）SL1-3、艾草 叶斑病病原菌（A.alternata）ACO5和欧石竹镰刀菌 （Fusarium fujikuroi）OSZ-P1，均由南阳师范学院生 命科学与农业工程学院分离保存。

1.1.3供试培养基

PDA培养基：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂18g、蒸馏水1000mL；NA培养基： 蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏 水1000mL，pH7.0～7.2；NB培养基：NA培养基不加 琼脂。

1.2内生细菌分离与纯化

称取0.5g叶片，先用无菌水冲洗，75%乙醇浸 泡30s后无菌水冲洗1～2次，再在5%次氯酸钠溶液 中浸泡3min后无菌水冲洗5～6次。叶片置于无菌 滤纸上晾干，并作印迹对照处理；消毒后的叶片放入 研钵中，加入9.5mL的0.9%生理盐水充分研磨，匀浆吸入试管中静置6～10min，吸取200μL上清液涂布于NA培养基上，30℃暗培养。待培养基上长出菌落后，挑取形态、大小和颜色不同的单菌落到NA培养基上划线培养，经纯化3～4次后转入NA斜面试 管4℃保存备用。

1.3拮抗菌筛选

1.3.1拮抗菌初筛

以月季炭疽病病原菌菌株 YJY-20为靶标菌，采用平板对峙法进行拮抗菌筛选。将直径为6mm的菌株YJY-20菌饼接种至PDA 培养基中央，并在距离菌饼25mm处以十字对称接 种内生细菌，每个平板接种1株内生细菌，以中心只 接种病原菌菌饼的PDA培养基为对照（CK），每株 内生细菌设3次重复。28℃暗培养，7d后测量病 原菌菌落直径并计算抑制率。抑制率（%）=（对照菌 落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.3.2 拮抗菌复筛

将初筛得到的拮抗菌在NA培养基上划线培养24 h，用无菌牙签挑取单菌落接种至NB培养基中，28 C下 180 r/min振荡培养48 h，制备成拮抗菌发酵液备用（以下发酵液制备方法同）。PDA培养基冷却至50 C后，以10%的比例将拮抗菌发酵液添加到 PDA培养基中混合倒板。待平板凝固后在其中心位置接种直径6mm的菌株 YJY-20菌饼，以中心只接种病原菌菌饼的PDA培养基为对照（CK），每株内生细菌设3次重复。28℃暗 培养，7d后测量病原菌菌落直径并计算抑制率。

1.4拮抗菌形态特征及生理生化鉴定

将筛选得到的拮抗菌在NA培养基上划线培养 24h，观察菌落形态、大小、边缘、表面、隆起形状、透 明度和颜色，生理生化测定方法参照《常见细菌系统 鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）和《微生物学实 验》（沈萍等，2001）。

1.5拮抗菌分子生物学鉴定

使用细菌基因组DNA提取试剂盒[生工生物工 程（上海）股份有限公司]提取拮抗菌株的基因组 DNA，利用细菌通用引物27-F（5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'）和 1492-R（5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'）PCR扩增拮抗菌的16S rRNA序列 （Wei et al.，2023）。PCR反应体系25.0 uL：2×Accu- rate Tag Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，上、 下游引物（10umol/L）各1.0uL，ddH2O9.5μL。PCR扩增程序：94°℃预变性5min；94°℃30s，58℃30s，72℃1.5min，进行34个循环；72℃延伸10min。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对，使用MEGA11.0构建系统发育进化树。

1.6拮抗菌抑菌物质分泌方式初探

1.6.1拮抗菌挥发性有机化合物对菌株YJY-20的抑菌活性

制备拮抗菌的发酵液备用。取200uL 拮抗菌发酵液至NA培养基中涂抹均匀；取直径 6mm的菌株YJY-20菌饼接种至PDA培养基中心。 将涂抹有拮抗菌发酵液的NA培养基与接种有病原 菌菌饼的PDA培养基相扣，并用封口膜密封；以涂抹NB培养基为对照（CK），每处理3次重复。28℃ 暗培养，7d后测量病原菌菌落直径并计算抑制率。

1.6.2拮抗菌无菌发酵液对菌株YJY-20及其菌丝的影响

离心收集拮抗菌发酵上清液，经0.22um微 孔滤膜过滤后获得无菌发酵液。在PDA培养基中心接种直径为6mm的菌株YJY-20菌饼，距菌饼25mm处十字对称放置牛津杯，并加入100μL无菌发酵液；以添加同体积的无菌水为对照（CK），每 处理3次重复。28°℃暗培养，7d后测量病原菌菌落 直径并计算抑制率。按照上述方法制备平板，在菌 饼与牛津杯中间45°插入盖玻片，以加无菌水为对照 （CK）。28°C暗培养，待病原菌菌丝生长至盖玻片 后，观察菌丝形态及结构。

1.7拮抗菌抑菌物质分离及拮抗效果测定

1.7.1拮抗菌粗蛋白的拮抗效果及热稳定性测定

4℃离心收集拮抗菌发酵上清液，分别向拮抗 菌上清液中加入硫酸铵直至饱和度达25%和35%； 0℃充分搅拌4h，12000r/min离心25min，4°℃收集 沉淀。用上清液原体积1/50的0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）重悬沉淀使其完全溶解，沉淀溶液加入到透析袋（分子截留量8000D）中4℃透析24h； 每8h更换1次透析缓冲液，共3次，透析液经0.22um 微孔滤膜过滤备用。将拮抗菌的粗蛋白分别在50、 60、70、80、90和100℃下处理30min，采用琼脂孔扩 散法测定粗蛋白对菌株YJY-20的拮抗效果，以未处理过的拮抗菌粗蛋白为对照（CK）。28℃暗培 养，7d后测量病原菌菌落直径并计算抑制率。

1.7.2拮抗菌脂肽类粗提物的拮抗效果

用1mol/L的HC1溶液将拮抗菌发酵上清液调至pH2.0，4°C静 置24h，离心收集沉淀。用甲醇重悬沉淀使其完全 溶解，萃取8h，共3次；萃取液合并经0.22um微孔 滤膜过滤备用。采用琼脂孔扩散法测定拮抗菌脂肽 类粗提物对菌株YJY-20的拮抗效果，以甲醇为对照（CK）。28C暗培养，7d后测量病原菌菌落直径并 计算抑制率。

1.8拮抗菌脂肽类抑菌物质功能基因PCR检测

以拮抗菌总DNA为模板，采用5个脂肽类化合 物合成相关基因（bmyB、fenD、ituC、srfAA和srfAB） 的特异性引物进行PCR扩增，引物设计和反应条件

参照文献（Joshi and McSpadden Gardener，2006）， PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至生 工生物工程（上海）股份有限公司测序并比对。

1.9拮抗菌产胞外酶活性测定

参照仇艳肖（2012）、王彪等（2019）的方法制备 果胶酶培养基、蛋白酶培养基、纤维素酶培养基、有 机酸培养基和茯苓粉培养基，分别用于检测拮抗菌 产果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、有机酸和β-1，3葡聚糖 酶的活性。将拮抗菌在NA培养基上划线培养24h， 挑取单菌落接种在各检测培养基上，28℃暗培养 48h，观察拮抗菌周围是否有透明圈产生，判断拮抗 菌是否具备产上述5种胞外酶的能力。

1.10拮抗菌抑菌谱测定

采用平板对峙法测定拮抗菌对12种供试植物 病原真菌的拮抗效果，每种病原真菌处理设3次重 复，28℃暗培养，待对照长满平板后测量各病原真 菌菌落直径并计算抑制率。

1.11拮抗菌对月季炭疽病的离体叶片防治效果 测定

采集健康的安吉拉月季叶片，无菌水清洗，75% 乙醇消毒30s后用无菌水冲洗2～3次，置于无菌滤 纸上晾干备用。叶片放入垫有无菌滤纸的培养皿 中，用一次性注射器在叶片表面刺破创伤，每片叶片 创伤1处，并向创伤处均匀喷洒1mL拮抗菌发酵液（1×108CFU/mL）；待叶片表面晾干后在创伤处接种直径6mm的菌株YJY-20菌饼，培养皿中加入5mL无菌水后用封口膜密封。以只喷洒NB培养基为对照（CK），每处理3次重复，每重复处理10张叶片。 将叶片置于湿度55%、28℃、光暗交替12h/12h的 光照培养箱中培养，7d后测量各处理叶片病斑直 径，计算病情指数和防治率。病情指数（%）=[Σ（病 级斑点数×该病级值）]/（接种点数×最高级值）×100； 防治率（%）=（对照病情指数一处理病情指数）/对照 病情指数×100。

病斑分级标准参照Subramani和Aalbersberg （2012）并作适当调整：0级，刺伤点感病；1级，病斑直 径lt;5mm；2级，5mm≤病斑直径lt;7mm；3级，7mm≤ 病斑直径lt;9mm；4级，9mm≤病斑直径lt;14mm； 5级，病斑直径≥14mm。

1.12统计分析

使用Excel 2021对试验数据进行整理，使用SPSS26.0对试验数据进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1内生细菌分离与拮抗菌初筛结果

从20个蔷薇属植物的叶片中共分离获得77株 内生细菌（表1）。通过平板对峙法发现有26株内生 细菌对菌株YJY-20有不同程度的拮抗效果（表2）。 对照长满平板后第1d，有10株菌株的抑制率为 20.00%～40.00%，5株菌株的抑制率为40.00%～60.00%，7株菌株的抑制率为60.00%～70.00%；其中，菌 株QZM1和DMGSMG4对菌株YJY-20的拮抗效果 最好，抑制率分别为67.64%和66.55%。满板后第 5d，有3株菌株抑制率为20.00%～40.00%，2株菌株抑制率为40.00%～60.00%，6株菌株抑制率为60.00%～70.00%；其中，菌株QZM1和DMGSMG4对菌株YJY-20的拮抗效果最好，抑制率分别为66.40% 和65.55%。将满板后第1d抑制率gt;40.00%的12株 内生细菌作为后续复筛试验菌株。

2.2拮抗菌复筛结果

利用混合平板法对初筛得到的12株抑菌活性 较强的内生细菌进行拮抗能力复筛。结果（表3）显 示，对照满板后第1d，有11株菌株的抑制率gt;80.00%； 对照满板后第5d，12株内生细菌的拮抗效果与满板 第1d的效果基本一致；对照满板后第8d，菌株 QZM1、DMGSMG4和YQW1的拮抗效果最好，抑制 率分别为88.93%、89.98%和89.77%。结合初筛结 果，由于菌株YQW1初筛试验中满板后第5d的抑 制率为29.28%，拮抗效果相比其他2株内生细菌弱，因此将菌株DMGSMG4和QZM1作为后续试验的 目标菌株。

2.3拮抗菌DMGSMG4和QZM1鉴定结果

2.3.1拮抗菌DMGSMG4和QZM1菌落形态特征 及生理生化鉴定2株拮抗菌在NA培养基划线培 养24h后，菌株DMGSMG4菌落颜色为白色，中间脐突状，边缘不规则，表面干燥不黏稠、无光泽（图1-A）。菌株QZM1菌落颜色为乳白色，形态呈圆形，中间突起，边缘规则，表面湿润黏稠、有光泽（图1-B）。革兰氏染色均为阳性，菌体呈杆状。对菌株DMGSMG4和QZM1的生理生化测定结果（表4）显示，2株拮抗菌的生理生化结果一致，淀粉水解、V-P试验为阳 性；甲基红、酪蛋白水解试验、柠檬酸盐利用、接触酶 反应、葡萄糖发酵、固氮试验、溶磷试验和解钾试验 均呈阴性。

2.3.2拮抗菌DMGSMG4和QZM1分子生物学鉴定结果

测序结果显示，菌株DMGSMG4和QZM1的 16S rRNA序列长度分别为 1443 和1423 bp，序列登录号分别为OR260987和 OR260999。经BLAST比对分析，菌株 DMGSMG4与解淀粉芽孢杆菌 B9（KY685066）的同源性最高，达100%;菌株QZM1与贝莱斯芽孢杆菌WGB6（KY962344）的同源性最高，达99.93%。

通过系统发育进化树可见，菌株DMGSMG4与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ht1-1（JF899275）和TL4（KY129662）位于同一个分支，亲缘关系最近（图 2-A）;菌株QZM1与贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）CS1.11（MN865798）位于同一个分支，亲缘关系最近（图 2-B）。结合菌落形态和生理生化特征分析，将菌株DMGSMG4鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens），将菌株QZM1 鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）。

2.4拮抗菌DMGSMG4和 QZM1的抑菌物质分泌方式初探

2.4.1拮抗菌DMGSMG4和QZM1挥发性有机化合物对菌株YJY-20的抑菌活性

如表5所示，菌株DMGSMG4和 QZM1 的挥发性有机化合物对菌株YJY-20的抑制率分别为 11.72%和30.71%;经2 株拮抗菌处理后，菌株YJY-20呈淡黄色，与对照相比所生成的黑色素较少，表明2 株拮抗菌挥发性有机化合物能有效降低菌株YJY-20 黑色素生成（图 3）。

2.4.2拮抗菌DMGSMG4和QZM1无菌发酵液对菌株YJY-20及菌丝的影响

如表6所示，菌株DMGSMG4 和 QZM1 无菌发酵液对菌株YJY-20 均具有较强的抑制效果，抑制率分别为 60.25%和61.24%。通过显微观察菌丝形态特征，经2 株拮抗菌无菌发酵液处理后，菌株YJY-20 生长受到抑制，其菌丝出现扭曲和畸形，部分末端出现断裂现象；对照的菌丝生长正常，长短均匀，无断裂和畸形现象，且表面光滑（图4）。

2.5拮抗菌DMGSMG4和QZM1抑菌物质分离及拮抗效果测定结果

2.5.1拮抗菌DMGSMG4和QZM1粗蛋白拮抗效果及热稳定性测定

如表7所示，菌株DMGSMG4和QZM1的粗蛋白对菌株YJY-20具有较强的拮抗效果，抑制率分别为59.76%和50.63%。2株拮抗菌的粗蛋白经50～100°℃不同温度处理后，对菌株YJY-20仍具有拮抗效果，但与对照未处理过的粗蛋白相比拮抗能力有所减弱。

2.5.2拮抗菌DMGSMG4和QZM1脂肽类粗提物的拮抗效果

如表8所示，菌株DMGSMG4和QZM1的脂肽类粗提物对菌株YJY-20具有明显的抑制效果，抑制率分别为50.07%和45.03%。由此推断2株拮抗菌可通过产生某些脂肽类抑菌物质以抑制菌株YJY-20正常生长，从而实现防治效果。

2.6拮抗菌DMGSMG4和QZM1脂肽类抑菌物质功能基因PCR检测结果

PCR检测结果（图5）显示，参与脂肽类物质合成的4个相关基因srfAA、srfAB、fenD和bmyB均能在2株拮抗菌的基因组中扩增到，但均未扩增到基因ituC。经BLAST比对分析，2株菌株利用特异性引物SrfAF-SrfAR（srfAA）、110F-110R（srfAB）和FenDF-FenDR（fenD）所扩增的序列分别与淀粉芽孢杆菌SYBC H47（KY051727）中srfAA基因序列、芽孢杆菌属FX74（OQ983492）中srfAB基因序列和解淀粉芽孢杆菌PR2（MT125616）中fenD基因序列同源性在98%以上；特异性引物BMBF2-BMBR2（bmyB）所扩增的序列分别与枯草芽孢杆菌ATCC55079（KU170613）、枯草芽孢杆菌IBFCBF-4（MG800640）和贝莱斯芽孢杆菌UTB96（OK274217）中脂肽类物质合成相关基因同源性在97%以上。表明2株拮抗菌具有合成细菌素、丰原素和表面活性素等脂肽类抑菌物质的潜力。

2.7拮抗菌DMGSMG4和QZM1产胞外酶活性测定结果

5种胞外酶活性检测结果显示，菌株DMGSMG4和QZM1在纤维素酶（图6-A-1和图6-B-1）及蛋白酶（图6-A-4和图6-B-4）检测培养基上均形成了透明的水解圈，表明2株拮抗菌均具有产纤维素酶和蛋白酶的能力。此外，菌株DMGSMG4在有机酸检测培养基上也形成了透明圈（图6-A-2），表明菌株DMGSMG4还具产有机酸的能力。

2.8拮抗菌DMGSMG4和QZM1的抑菌谱测定结果

由表9和图7可知，拮抗菌DMGSMG4和QZM1对12种植物病原真菌均具有较强的拮抗作用，抑制率均大于50.00%；其中对菌株YJY-22的抑制率分别为72.62%和77.00%，对菌株YJY-23的抑制率分别为66.39%和66.34%。拮抗菌DMGSMG4和QZM1的抑菌谱较广，应用潜力较大，可用于多种植物病害的防治研究。

2.9拮抗菌DMGSMG4和QZM1对月季炭疽病的离体叶片防治效果

离体叶片防治结果（图8）显示，处理后第7d对照叶片创伤处周围出现明显的褐化病斑，且病斑直径较大（图8-A），而经拮抗菌DMGSMG4和QZM1发酵液处理后的叶片病斑直径明显小于对照（图8-B和图8-C）。如表10所示，对照的离体叶片病情指数为70.00，而经拮抗菌DMGSMG4和QZM1处理过的离体叶片病情指数均低于对照，防治率分别为59.35%和20.58%。由此可知，拮抗菌DMGSMG4和QZM1对月季炭疽病具有较好的防治效果，能有效抑制炭疽病病原菌对月季叶片的侵染，保证月季植株的正常生长。

3讨论

目前，以生物防治为主的植物病害防控措施逐渐成为了研究热点，并受到许多学者关注。芽孢杆菌具有较强的抗真菌能力，对人体及动植物无毒无害，因而广泛应用于植物病害生物防治闫杨等，2019；宇书田，2022）。本研究从20个蔷薇属植物的健康叶片中分离筛选出2株对月季炭疽病病原菌YJY-20具有较强抑制作用的内生细菌DMGSMG4和QZM1，抑菌率分别为67.64%和66.55%。通过生理生化和16SrRNA序列比对分析，拮抗菌DMGSMG4和QZM1分别鉴定为解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。张晓勇等（2021）从红花龙胆茎秆中分离出贝莱斯芽孢杆菌SB023能有效抑制杧果炭疽病病原菌生长，抑菌率为71%；本研究2株拮抗菌的抑菌效果与之相似。表明芽孢杆菌在防治植物炭疽病方面具有可行性。此外，通过试验发现2株拮抗菌DMGSMG4和QZM1对其他12种植物病原真菌也具有拮抗作用，抑制率均大于50.00%，表明2株菌株的抑菌谱较广。本研究还利用2株拮抗菌发酵液对月季炭疽病离体叶片进行防治试验，发现2株拮抗菌发酵液均具有较好的防治效果，防治率分别为59.35%和20.58%，与张宁等（2022）报道的利用拮抗菌YJ3-7发酵液防治人参黑斑病的结果相似。研究拮抗菌DMGSMG4和QZM1对月季炭疽病的防治效果，有利于丰富月季炭疽病拮抗菌株资源。

水解酶作为芽孢杆菌重要的抑菌物质之一，能降解真菌的细胞壁和细胞膜，从而抑制病原真菌生长，如葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶（Xuet al.，2016;Subbanna et al.，2018;宋利沙等，2020）。本研究对2株拮抗菌进行胞外酶定性分析，结果显示，2株菌株均具有产纤维素酶和蛋白酶的能力，其中拮抗菌DMGSMG4还具产有机酸的能力。进一步观察发现，炭疽病病原菌YJY-20经2株拮抗菌无菌发酵液处理后菌丝表面粗糙，且出现扭曲断裂现象，与张荷花（2020）报道的短小芽孢杆菌W-7抑制致病疫霉生长和章乐乐等（2023）报道的芒果炭疽菌经贝莱斯芽孢杆菌RL-LL04处理后菌丝出现断裂扭曲现象的结果相似，且以上所报道的拮抗菌株均可产蛋白酶或纤维素酶等胞外水解酶。由此推断胞外水解酶可能是2株拮抗菌对月季炭疽菌及多种植物病原菌产生拮抗作用的重要物质之一。

抑菌物质常见提取和分离方法有结晶、溶剂萃取、酸沉淀法、大孔树脂抽提法、硫酸铵沉淀法和色谱法等（桑建伟等，2018；贺旭等，2023）。一般认为，脂肽类物质可通过酸沉淀法提取，大分子抑菌蛋白类物质可通过硫酸铵饱和沉淀法提取（兰宝锋等，2022）。前期试验发现2株拮抗菌的抑菌物质主要存在于发酵上清液中，因此本研究通过硫酸铵沉淀法和酸沉淀法分离2株拮抗菌的抑菌物质，并分别测定抑菌物质对菌株YJY-20的抑菌效果。结果显示，2株拮抗菌DMGSMG4和QZM1的粗蛋白对菌株YJY-20具有较强的拮抗效果，抑制率分别为59.76%和50.63%；且经50～100°℃处理后仍具有拮抗能力，与Ran等（2020）报道的多粘类芽孢杆菌7F1的抗菌蛋白在60～90°℃下对小麦赤霉病菌仍具有拮抗作用的结果相似。此外，2株拮抗菌DMGSMG4和QZM1的脂肽类物质粗提物对菌株YJY-20也具有较强的拮抗效果，抑制率分别为50.07%和45.03%，与杨瑞先等（2015）报道解淀粉芽孢杆菌Md31和Md33的脂肽类物质粗提物能抑制牡丹炭疽病菌、牡丹灰霉病菌和牡丹黑斑病菌等病原真菌生长的结果相似。基于以上研究，推断2株拮抗菌的抑菌物质可能是某些脂肽类物质或耐高温抗菌蛋白。

常见脂肽类抑菌物质包括枯草菌素（Subtilin）、伊枯草菌素（Iturins）、杆菌肽（Bacitracin）、丰原素（Fengycin）和表面活性素（surfactin）等（Cameotra andMakkar，2004;Wang et al.，2007;彭启超等，2022）。本研究利用5对特异性引物对拮抗菌DMGSMG4和QZM1脂肽类抑菌物质合成关键基因进行PCR扩增，发现2株拮抗菌的基因组中均能扩增出丰原素、细菌素和表面活性素等脂肽抑菌物质合成的关键基因；与杨瑞先等（2015）报道的拮抗菌Md31和Md33中扩增到5个脂肽类物质基因簇片段、贺旭等（2023）报道的从拮抗菌FX1的基因组中扩增出8个参与脂肽类物质合成相关基因的结果相似。这些关键基因常被用于检测以上脂肽类抑菌物质，由此表明2株拮抗菌具有合成抗菌脂肽类物质的潜能。但本研究仅对2株拮抗菌的抑菌物质进行初步探究，具体是哪种抑菌物质后续还需进一步纯化鉴定；此外，针对2株拮抗菌的抑菌机理及其在植株上定殖能力有待深入研究。掌握2株拮抗菌的抑菌机理，有利于充分发挥其生防作用和应用价值。

4结论

从蔷薇属植物叶片中分离筛选出2株对炭疽病病原菌YJY-20具有较强拮抗效果的内生细菌DMGSMG4和QZM1，经鉴定分别为解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，且2株菌株对供试12种植物病原真菌也具有较强的抑制效果，抑菌谱较广。菌株DMGSMG4和QZM1具有作为月季炭疽病生防菌株的潜力。

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