光叶苕子内生真菌分离鉴定及其对香蕉枯萎病的生防和促生潜力

摘要：【目的】筛选对香蕉枯萎病具有生防和促生潜力的内生真菌，为香蕉枯萎病的生物防治提供参考依据和潜 力菌株。【方法】以香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌4号生理小种热带型（F. oxysporum f. sp.cubense tropical race 4，Foc TR4） 为靶标菌，以光叶苕子（Vicia villosa var.）根内分离纯化的内生真菌为试验菌株，采用平板对峙法评价内生真菌对Foc TR4的平板抑制效果；结合形态学与分子生物学方法确定拮抗真菌的分类地位，通过扫描电镜观察拮抗真菌对Foc TR4菌丝形态的影响；并通过平板溶磷圈法、平板固氮圈法和CAS平板法检测拮抗真菌解无机磷、固氮和产铁载 体能力；通过盆栽试验验证拮抗真菌对香蕉枯萎病的防治效果及对香蕉的促生效果。【结果】从光叶苕子根部分离纯 化得到8株拮抗真菌，其中201、204和401号菌株的抑菌效果最好，经形态学与分子生物学方法分别鉴定为螺卷毛壳菌（Chaetomiuum cochliodes）、简青霉菌（Penicillium simplicissimum）和蓝状菌（Talaromyces oumae-annae）。平板对峙显示201号菌株对Foc TR4的体外抑制率最高，达74.39%，其次是401号菌株，为71.00%，204号菌株的抑制率为69.83%。扫描电镜观察结果表明3株拮抗真菌均能抑制FocTR4菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多，菌 丝明显肿胀，节间缩短，分枝增多，菌丝粗糙，尖端扩张，呈泡状并断裂。204和401号菌株在功能平板上还具有一定的促生 潜力，具有解无机磷、固氮和产铁载体能力。盆栽试验结果表明，3株拮抗真菌201、204和401号菌株均对FocTR4具有较 强的抑制活性，并对香蕉枯萎病表现出较好的防治效果，对球茎的防治效果分别为90.625%、65.623%和96.876%，对 叶片的防治效果分别为90.745%、90.743%和90.750%，同时，3株拮抗真菌都能在一定范围内减少FocTR4对香蕉生长 的抑制作用，从而促进香蕉植株生长。【结论】从光叶苕子根部分离获得的3株拮抗真菌201、204和401号菌株对香蕉枯 萎病菌均有较好的拮抗效果，能抑制香蕉枯萎病菌的毒害，促进香蕉植株生长，具有良好的生防和促生潜力。

关键词：光叶苕子；香蕉枯萎病；拮抗真菌；促生效果

中图分类号：S436.421.1

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2024）04-0996-14

Isolation and identification of endophytic fungi of Vicia villosa var. and their biocontrol against banana wilt and growthpromotion potentials

RUAN Yan-nan12， FAN Hua-cai2， WANG Yu-tong3， FU Li-bo2， ZHENG Si-jun2，MAO Jun12， LI Shu2*， WANG Zhi-yuan2*

（1Kunming College， Kunming， Yunnan 650214， China; 2Institute of Agricultural Environment and Resources， Yunnan

Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan 650205， China; 3Sugarcane Research Institution， Yunnan

Academy of Agricultural Science， Honghe， Yunnan 661699， China）

Abstract：【Objective]The purpose of the study was to screen endophytic fungi with biocontrol and growth promotion potentials against banana wilt， and to provide reference basis and potential strains for the biological control of bananawilt. 【Method】Using Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4（Foc TR4） as the target fungus and endophytic fungi isolated and purified from the roots of Vicia villosa var. as the test strains， the plate standoff method was used to evaluate the plate inhibitory effect of the endophytic fungi on Foc TR4. Combining morphology and molecular biology to determine the taxonomic status of the antagonist fungi， the effects of the antagonist fungi on the morphology of Foc TR4 mycelium were observed by scanning electron microscopy. The ability of the antagonist fungi to detoxify inorganic phos- phorus， fix nitrogen and produce iron carriers was detected by plate phosphorus solubilizing circle method， plate nitrogen fixing circle method and CAS plate method. The biocontrol effect on banana wilt and growth promotion effects of the an- tagonist fungi on banana were verified by poted test. 【Result ]Eight strains of antagonistic fungi were isolated and purified from the roots of V. villosa var. ， among which strains 201， 204 and 401 had the best inhibitory effect， and were identified by morphology and molecular biology as Chaetomium cochliodes， Penicillium simplicissimum， and Talaromyces oumaea- nnae. Plate confrontation showed that strain 201 showed the highest in vitro inhibition on Foc TR4 at 74.39%， followed by strain 401 at 71.00% and strain 204 at 69.83%. Scanning electron microscopy results showed that all three strains of an- tagonistic fungi were able to inhibit mycelial growth of Foc TR4 and lead to mycelial deformity， cross-linking and defor- mation， as well as increase in spore number aggregation， obvious swelling of mycelium， shortening of internodes， in- crease in branching， roughness of mycelium， expansion of tips， vesicularity and breakage. Strains 204 and 401 also pos- sessed a certain potential to promote the growth of mycelium on the functional plate， with the capacity of solubilizing in- organic phosphorus， nitrogen fixation and iron carrier production. The potted results showed that all the three antagonistic fungal strains 201， 204 and 401 had strong inhibitory activity against Foc TR4 and showed good control effects against ba- nana wilt with 90.625%， 65.623% and 96.876% on bulbs and 90.745%， 90.743% and 90.750% on leaves， respectively.Meanwhile， all the three strains of the antagonistic fungi were able to reduce the inhibitory effect of Foc TR4 on the growth of banana within a certain range， thus promoting the growth of banana plants. 【Conclusion 】The three strains of an- tagonistic fungi 201， 204 and 401 isolated from the roots of V. villosa var. have good antagonistic effects on banana wilt， can inhibit the virulence of banana wilt and promote the growth of banana plants， and have good potentials of biocontrol and growth promotion.Key words： Vicia villosa var.; banana wilt; antagonistic fungus; growth promotionFoundation items： National Natural Science Foundation of China （32160760）; Project of Kunming Comprehensive Experimental Station for National Green Manure Industrial Technology System （CARS-22-Z-14）

0 引言

【研究意义】香蕉是世界第四大粮食作物，我国是香蕉第二大生产国（Fan et al.，2021），同时是香蕉消费大国，然而由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense，Foc）引起的香蕉枯萎病正严重影响我国香蕉的产量和质量（Ploetz，2006，2015）。香蕉枯萎病是一种土传维管束病害，带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤均可作为病原菌的传染源，其中尖孢镰刀菌4号生理小种热带型（F.oxysporum f.sp.cubensetropical race 4，Foc TR4）的寄主广、危害大，是香蕉枯萎病强致病菌，对香蕉生产造成的危险性和毁灭性最大（Li et al.，2013）。目前对香蕉枯萎病防治措施主要有化学药剂防治、使用无病组培苗及抗病品种、农业改良防治、生物防治等。FocTR4具有强宿主专一性，因此可通过轮作和改善田园卫生来降低其发病风险（Kanini et al.，2013）。使用杀菌剂和土壤熏蒸剂也可达到抑制香蕉枯萎病的效果，但反复大量使用易导致环境污染等问题（张涵等，2022）。此外，选育抗性品种也是有效措施之一，但香蕉是三倍体，难以选育抗病品种，至今仍未选育出抗FocTR4的品种（Arinaitwe et al.，2019）。在众多限制因素影响下，生物防控成为香蕉枯萎病防治的一条绿色出路。因此，探索拮抗和促生的生防菌，不仅能减少化学药剂的使用，还能提供一种可持续、环保的解决方案，提高香蕉的产量和质量，对保障我国香蕉产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，内生真菌对不同作物土传病害的生物防治作用已得到证明，在防治植物病害和促生方面应用广泛。Li等（2019）发现3株木霉菌能显著抑制黄瓜枯萎病病原菌侵染，促进黄瓜植株新陈代谢，提高抗逆酶活性，从而促进黄瓜植株生长，防治黄瓜枯萎病，提高黄瓜的产量和品质。Damodaran等（2020）发现里氏木霉CSR-T-3能产生次生代谢物抑制香蕉枯萎病菌，对香蕉枯萎病防效高达85.19%。Duan等（2020）从香蕉根际土壤中分离到1株拮抗链霉菌FS-4能明显降低香蕉枯萎病的发病率，而且能促进香蕉幼苗生长。Motlagh和Jafari（2020）发现1株绿木霉能显著抑制玫瑰灰霉病病原菌的生长，并增加玫瑰的高度、鲜重和干重。Wei等（2020）从原始山地植物根际土壤中分离到1株对FocTR4具有较强抗性的链霉菌YYS-7，该菌可导致FocTR4细胞畸形，超微结构消失，显著提高了香蕉对FocTR4的抗性。邱美莎等（2022）研究发现，深色有隔内生真菌X22既能促生，又能显著抑制香蕉枯萎病菌。植物内生菌可通过拮抗、竞争生态位和诱导植物抗性等方式来抑制病原菌对植物的侵染（杨海莲等，2001），部分拮抗菌可在根际和根内定植，不仅可以抑制病原体，还可诱导寄主植物产生抗病性。Yu 等（2017）发现1 株尖孢镰刀菌的拮抗细菌假单胞菌BAF.1，其通过产生的铁载体抑制尖孢镰刀菌，最大抑制率为 95.24%;卯婷婷等（2019）从猕猴桃根际土壤中分离出1 株高效解磷真菌 MHT0308 菌株，该菌对猕猴桃软腐病菌的抑菌率达87.71%;陈阳（2019）从水稻中分离出1 株内生革兰氏阴性菌BV6，该菌具有溶磷、产铁载体和拮抗灰霉、稻瘟病菌、指状青霉及尖孢镰刀菌等植物病原真菌的能力。[本研究切入点]光叶苕子（Vicia villosa var.）是我国南方果园和农田常见的绿肥作物，具有良好的保持水土和培肥地力作用（曹卫东等，2017）。有研究证明豆科作物套种香蕉可改善土壤微生物群落结构，达到降低香蕉枯萎病发病率的目的。在云南多年的光叶苕子种植历史中发现，光叶苕子套种香蕉可明显降低香蕉枯萎病的发病率，且能促进香蕉生长（Yang et al.，2022），但关于光叶苕子内生真菌对香蕉抗枯萎病诱导作用的研究未见报道，其诱导促生抗病机制尚不清楚。[拟解决的关键问题]利用平板对峙法从光叶苕子根内筛选拮抗真菌，结合形态学和分子生物学方法对拮抗真菌进行鉴定，通过盆栽试验评价拮抗真菌对香蕉苗的促生 效果及对香蕉抗枯萎病的诱导作用，初步探讨拮抗 真菌诱导香蕉抗病的作用机制，为香蕉枯萎病的生 物防治提供参考依据和潜力菌株。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试植物与菌株

供试光叶苕子根部样品于2021年11月从云南省昆明市嵩明县绿肥长期定 位试验基地（25°28'N、102°41'E）采集，采用五点取 样法从不同地块共采集9份样品。采样地区的年平 均气温11～22℃，年均降水量899.8mm，未种植香 蕉。采集光叶苕子根样品连同根际土装入密封袋中 4°℃保存备用。供试香蕉枯萎病菌为FocTR4，由云 南省农业科学院农业环境与资源研究所香蕉研究团 队从西双版纳种植田中的巴西香蕉品种中分离、鉴 定和保存。

1.1.2供试仪器与培养基

扫描电子显微镜（蔡司 Sigma 300，德国）。供试培养基：马铃薯琼脂培养基（PDA，马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g；不加琼脂为PDB培养基）、孟加拉红培养基（蔗糖3.0g， 硝酸钠3.0g，磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钾0.7g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，氯化钠10.0g，琼脂粉20.0g，氯霉素50.0mg）、Pikovskava无机磷固体培养基（卯婷婷等，2019）、Ashby无氮培养基和CAS 检测培养基（陈阳，2019）。 1.2试验方法

1.2.1拮抗内生真菌菌株的分离纯化

采集光叶 苕子非菌根亚根（直径7～8mm），将其表面用无菌水 清洗干净。无菌条件下称取10g洗净的植物根系， 使用75%乙醇进行表面消毒，用无菌刀片将根系切 成2～3cm的小段，用75%乙醇浸泡30s～1min后用 无菌水冲洗2次。再用0.1%升汞浸泡30s～1min， 无菌水冲洗3次，放入装有9mL无菌水的灭菌研钵 中，加入少许灭菌石英砂研磨均匀，静置15min后取 1mL稀释成103、104、105和106浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1mL用无菌涂布棒涂于PDA和 孟加拉红培养基上，于28°℃倒置培养，以最后1次 洗过样品的无菌水为对照。连续观察1～3d，待固体 培养基表面长出菌落时，对单个菌落计数，并继续观 察。挑取形态、颜色、大小各异的菌落接种到新的固 体培养基上进行培养，分离出单一形态的菌种，待新 的固体培养基上长出菌落时再纯化2次，即分离到 多个单菌株。纯化后的单菌株用接种针挑取菌落接 种至PDA固体斜面培养基上，4°℃冰箱临时保存。

1.2.2拮抗真菌菌株初筛

采用平板对峙法对拮 抗菌进行初步筛选（苏卓文等，2022）。用无菌打孔 器打取直径为2mm的供试Foc TR4菌饼接种在新 制备的PDA培养基中央并轻轻按压，防止掉落。在 距离菌饼2.5cm处接种筛选得到的真菌菌株，用密 封条封口，以未接种拮抗真菌菌株的PDA培养基为 对照，3次重复，28℃下培养72h，观察统计具有抑 菌效果的真菌菌株。

1.2.3拮抗真菌菌株复筛为筛

选对FocTR4具有拮抗活性的真菌菌株，参考Li等（2021）的平板对峙法并略作改动。将FocTR4菌饼接种在新制备的PDA培养基十字线中央，用接种针挑取具有抑菌效果的真菌菌丝接种在距FocTR4菌饼2.5cm处， 以不接种拮抗真菌菌株为对照，28°℃下培养7d， 3次重复。测量病原菌生长直径，计算平均抑菌效果。

抑制率（%）=（对照病原菌生长直径-处理病原菌生长直径）/（对照病原菌生长直径-接种菌饼直径）x100

1.2.4 拮抗真菌解磷能力测定

通过平板溶磷圈法测定。配制无机磷固体培养基，用无菌打孔器打取直径2 mm的拮抗真菌菌饼接种在无机磷固体培养基中央，28 °℃下培养7 d。若真菌菌落周围出现圆形透明圈则表明具有解无机磷能力（卯婷婷等，2019）。

1.2.5拮抗真菌固氮能力测定通过平板固氮圈法测定。将分离到的拮抗真菌接种于固体Ashby无 氮培养基上，用无菌打孔器打取直径2mm的拮抗真 菌菌饼接种在Ashby无氮培养基中央，28°℃下培养 7d。若真菌菌落周围出现圆形透明圈则表明具有 固氮能力（陈阳，2019）。

1.2.6拮抗真菌铁载体分泌能力检测

通过CAS平板法测定。当拮抗真菌菌株向CAS检测培养基中释放Fe3+时，可在培养基上形成橙黄色晕圈。记 录培养基上橙黄色晕圈的有无。测量单菌落与橙黄 色晕圈直径的比值可表征真菌产铁载体能力的强弱（陈阳，2019）。

1.2.7拮抗真菌菌株形态学鉴定

采用扫描电子 显微镜观察拮抗真菌的超微结构。取拮抗真菌菌株 在PDA养基上28℃下培养7d，以便观察菌落形态 特征。培养好的拮抗真菌菌株样品经固定、脱水、干 燥和镀金等步骤处理后放置在SEM样品台上。通 过扫描电子显微镜观察菌丝、孢子及其他相关结构 的表面形态特征，记录并拍摄高分辨率图像。

1.2.8拮抗真菌菌株分子生物学鉴定

使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）（擎科生物科技有限公司）提取拮抗真菌的DNA。使用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）/ITS4 （5'-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3'）扩增拮抗真菌的ITS 序列，引物序列委托北京擎科生物科技有限公司合 成。PCR反应体系50μL：1×TSE101金牌Mix45μL，上、下游引物各2uL，DNA模板1uL。扩增程序： 98℃预变性2min；98℃10s，56℃10s，72℃10s， 进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存备用。

PCR反应结束后取样进行琼脂糖凝胶电泳检测。将 电泳检测合格的扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司测序，所得序列在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库与其他真菌序列进行BLAST序列同源性比较，获得同源性序列，采用MEGA7.0邻接法构 建系统发育进化树。

1.3拮抗真菌对盆栽香蕉枯萎病防效及对香蕉 植株的促生作用测定

1.3.1盆栽前处理温室盆栽试验于2022年8— 11月进行。将巴西蕉组培苗转入砂基质中驯化30d。 选择5～6片叶片的香蕉植株进行盆栽试验，评价拮 抗真菌的生物防治和促生长效果。

1.3.2拮抗真菌菌株发酵原液制备

使用无菌接种 针分别挑取拮抗菌株菌落接种到PDB液体培养基 中，于28℃下180r/min振荡培养72h后得到发酵液， 使用血球计数板调节孢子浓度为1×108CFU/mL。

1.3.3FocTR4孢子发酵液制备

将活化的Foc TR4菌丝接种于PDB液体培养基中，于28°℃下 180r/min振荡培养72h后，用4层无菌纱布过滤菌 丝，得到FocTR4孢子发酵液悬液，用无菌水稀释至

1×10°CFU/mL，4℃下储存待用。

1.3.4盆栽试验设计

选择5～6片叶片的香蕉植 株进行盆栽试验，每盆香蕉苗灌根前进行伤根处理， 每盆接种50mL处理液。试验设4个处理，分别为阳性对照组（Foc TR4）：用浓度为1×106CFU/mL的 FocTR4孢子发酵液悬液进行灌根处理；阴性对照组（CK）：用PDB液体培养基进行灌根处理；处理组1（Foc TR4+拮抗真菌）：用浓度为1×106CFU/mL的 Foc TR4孢子发酵液悬液+拮抗菌株发酵液进行灌 根处理；处理组2（拮抗真菌）：用拮抗菌株发酵液进 行灌根处理。7d后再次向处理组1和处理组2灌根 等量的拮抗菌株发酵液。每处理3株香蕉苗，3次 重复。

1.3.5拮抗真菌菌株对盆载香蕉枯萎病防治效果 及对香蕉促生效果评价

接种45d后，参考Fan等（2021）的方法调查香蕉植株叶片和球茎的发病程 度。叶片病害分级：0级，无症状；1级，真叶和子叶 黄萎面积不超过总面积的50%；2级，真叶和子叶黄 萎面积超过总面积的50%；3级，叶片枯萎或死亡，只 有生长点存活；4级，整株植物严重枯萎或死亡。球

茎病害分级：0级，球茎无病变；1级，球茎病变面积 为1%～10%；2级，球茎病变面积为11%～30%；3级， 球茎病变面积为31%～50%；4级，球茎病变面积分别 大于50%。测量并记录处理后各香蕉植株的株高、茎 粗、叶片数、叶长、叶宽、地上部鲜重和地下部鲜重。

病情指数（%）=Σ（各级病株数×相对级数值）/

（调查总株数×最高病级数值）×100

防治效果（%）=（对照组病情指数一处理组病情指数）/对照组病情指数×100

1.4统计分析

采用Origin 2021和SPSS 22.0对试验数据进行 处理与分析。

2结果与分析

2.1拮抗真菌菌株筛选结果

利用PDA和孟加拉红培养基从采集的9份光叶 苕子根部样品中分离到20株内生真菌。分离的内 生真菌气生和匍匐菌丝均生长良好，大多数气生菌 丝体呈多毛状、颗粒状或粉状，有些菌株在基质中产 生色素。经双重培养初筛，从20株内生真菌中获得 8株拮抗效果较明显的菌株，分别为201、204、205、206、302、401、403号和406号菌株。由图1可知，不同拮抗真菌菌株对香蕉枯萎病菌的抑菌效果存在明显差异，其中201、204和401号真菌菌株的抑菌作用最高，抑菌率分别达74.39%、69.83%和71.00%，拮抗效果显著优于其他5株菌株（Plt;0.05，下同），因此，选取201、204和401号真菌菌株进行后续研究。

利用扫描电镜观察FocTR4菌丝及分生孢子。扫描电镜下观察发现，CK的Foc TR4菌丝生长正常，气生菌丝明显呈白色絮丝状，菌丝为乳白色，光滑、均匀，孢子形态完整，数目正常（图2-G和图2-H）。3株拮抗菌株与Foc TR4经平板对峙7d后，拮抗菌株抑制Foc TR4菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多，与单培养Foc TR4菌丝形态相比，201号菌株诱导FocTR4菌丝明显肿胀，节间缩短，分枝增多，菌丝粗糙（图2-A和图2-B，箭头1）；菌丝尖端扩张，呈泡状（图2-A，箭头2），菌丝在中间扩张（图2-A和图2-B，箭头3）；衣原体孢子形成，数目增多，孢子表面粗糙（图2-B，箭头4）。204号菌株导致Foc TR4菌丝明显肿胀，分枝增多，菌丝粗细不均（图2-C和图2-D，箭头1）；菌丝在中间扩张（图2-C和图2-D，箭头3）；孢子数目增多，聚集（图2-C和图2-D，箭头4）；菌丝断裂（图2-C，箭头5）。401号菌株诱导Foc TR4菌丝明显肿胀，分枝增多，菌丝粗糙，畸形，交联变形（图2-E和图2-F，箭头1）；菌丝尖端扩张，呈泡状（图2-E和图2-F，箭头2），菌丝在中间扩张（图2-E和图2-F，箭头3）；孢子数目增多，孢子表面粗糙，变形，凹陷（图2-E和图2-F，箭头4）；菌丝断裂（图2-E，箭头5）。

2.2拮抗真菌解磷、固氮和产铁载体能力测定结果

利用无机磷固体培养基测定发现401号菌株的解磷能力最强，溶磷圈直径为5.23cm，其次是204号菌株，溶磷圈直径为4.73cm；201号菌株不具有解无机磷能力（图3）。利用Ashby无氮固体培养基测定发现401号菌株的固氮能力最强，固氮圈直径为4.03cm，其次是204号菌株，固氮圈直径为2.13cm；201号菌株不具有固氮能力（图3）。利用CAS检测培养基测定发现401号菌株的产铁载体能力最强，黄色晕圈直径为6.13cm，其次是204号菌株，黄色晕圈直径为5.27cm；201号菌株不具有产铁载体能力（图3）。综合分析发现，401和204号菌株同时具备固氮、解有机磷和产铁载体能力，201号菌株不具有固氮、解有机磷和产铁载体能力，因此，401和204号菌株除拮抗香蕉枯萎病病原菌效果较好外，还具有较大的促生潜力。

2.3拮抗真菌鉴定结果

2.3.1 形态学鉴定

将分离获得的201、204和401号菌株接种到 PDA培养基上，28 C下培养7 d，观察菌株菌落形态（图 4-A），并利用扫描电镜对201、204和401号菌株进行显微形态观察（图4-B、图4-C和图4-D）。201、204和401号菌株培养14 d后菌落直径为42～76 mm，肉眼观察菌落形态，其中201号菌株菌落呈绒毛状或棉絮状，表面有一些呈黑绿色颗粒状物质;菌丝体呈淡黄色和白色，反面有少数可溶性色素，呈淡褐色，菌落生长较快;显微结构观察发现该菌菌丝少数分枝、细长，长21.0～35.0 μm，基部宽1.6～3.0 μum，端部变窄，菌丝呈团状发散生长，宽 1.0～2.5 μm;菌丝生长到一定程度时，会从菌丝分离出一些类似螺壳的物质，密集附着在部分菌丝表面，大小为0.1～2.0 μm。204号菌株菌落呈微绒毛状，表面疏松有干粉且伴有少量的凸起菌丝体，有同心环纹或存在少量放射状皱纹，边缘呈环纹状白色晕圈，菌落呈淡黑绿色，背面带呈奶白色；显微结构发现该菌菌丝部分分枝、细长，端部变窄，长35.0～40.0μm，基部宽2.1～3.0um，粗细均匀，菌丝表面光滑，未见孢子结构。401号菌株菌丝呈颗粒状或絮状，表面平坦；菌丝体呈黄色，背面带深红色或白色，菌落边缘颜色白色；显微结构发现该菌菌丝部分分枝、弯折、细长，长31.0～45.0um，基部宽1.2～2.0μm，菌丝均匀，菌丝生长到一定程度时表面会形成一些圆形凸起，大小为0.5～1.5um。

2.3.2分子生物学鉴定

提取3株拮抗真菌菌株的基因组DNA，使用通用引物ITS1 和ITS4进行PCR扩增，获得3株拮抗菌株的ITS片段大小为500～750bp（图5）。

在 NCBI 的 BLAST 结果显示，201号菌株与Chaetomium cochliodes 的同源性最高， 达 100%;204 号菌株与 Penicillium ochrochloron 的同源性最高，达 99.82%;401号菌株与 Talaromyces coprophilus的同源性最高，为 99.62%。基于3 株拮抗真菌菌株的ITS序列使用MEGA 7.0 对 GenBank 中下载的同源性较高序列利用最大似然法构建系统发育进化树，结果（图6）显示，201号菌株与螺卷毛壳菌（C.cochliodes）聚为一支，相似性为96%，结合菌落形态及显微特征观察，将201号菌株鉴定为螺卷毛壳菌；204号菌株与简青霉菌（P.simplicissimum）聚为一支，相似性为99%，结合菌落形态及显微特征观察，将204号菌株鉴定为简青霉菌；401号菌株与蓝状菌（T.oumae-annae）聚为一支，相似性为96%，综合菌落的形态及显微特征，将401号菌株鉴定为蓝状菌。

2.4拮抗真菌对盆栽香蕉枯萎病防效

接种45d后，只接种Foc TR4发酵液的香蕉叶片变黄，植株发育不良，下部叶枯死脱落，发病程度较高（图7-A）；而处理组1（Foc TR4+201、Foc TR4+204和Foc TR4+401）中的大部分叶片保持健康，植株生长良好，无明显的感病症状（图7-C、图7-E和图7-G），植株生长状态与CK（图7-B）的香蕉幼苗无明显差异，说明3株拮抗真菌对FocTR4的侵染起到一定的抑制作用。而处理组2（201、204和401号菌株发酵液）的香蕉幼苗无发病情况（图7-D、图7-F和图7-H），说明3株拮抗真菌未对香蕉叶片产生致病作用，不是香蕉的潜在致病菌。

对香蕉球茎进一步观察发现，与CK香蕉球茎相比（图8-B），只接种FocTR4发酵液的香蕉球茎出现明显症状，球茎颜色呈棕黑色感染区，球茎纵剖面褐变明显，基部腐烂（图8-A）；处理组1的香蕉球茎表现不同的发病情况，其中Foc TR4+204处理香蕉球茎纵剖面存在部分发病区，球茎病变面积约为1%～10%（图8-C），Foc TR4+201处理香蕉球茎纵剖面也存在部分发病区，球茎病变面积为1%～5%（图8-E），对TR4侵染抑制效果最好的是Foc TR4+401处理，香蕉球茎纵剖面无发病区（图8-G）；处理组2香蕉球茎无发病情况（图8-D、图8-F和图8-H），与CK球茎纵剖面相似。

综上所述，3株拮抗真菌均可在一定程度抑制Foc TR4对香蕉的侵染，降低香蕉枯萎病的发病程 度，其中以401号菌株蓝状菌的效果最好，且3株拮 抗真菌单独处理未对香蕉产生致病作用，对香蕉无 致病性。

盆栽试验结果（表1）显示，3株拮抗真菌对FocTR4具有显著的抑制作用，其中401号菌株的效果 最好，对香蕉球茎的防治效果达96.876%，且病情指 数显著低于其他处理，为2.777%；其次是201号菌 株，对香蕉球茎的防治效果为90.625%，但与401号菌 株无显著差异（Pgt;0.05，下同）；204号菌株对香蕉球 茎的防治效果最低，仅为65.623%，显著低于401和 201号菌株处理，且病情指数显著高于401和201号 菌株处理，为30.557%。3株拮抗真菌对香蕉叶片的 防治效果和病情指数差异均不显著，但病情指数均 显著低于只施用Foc TR4处理。

2.5拮抗真菌对香蕉植株的促生作用

对3株拮抗菌株进行香蕉幼苗促生长试验，结 果（表2）显示，与CK相比，只接种201、204和401号 菌株发酵液对香蕉植株的株高和茎围生长无显著影 响，但201号菌株处理增加了植株叶长，而401号菌 株处理减少了植株叶片数；与只接种FocTR4发酵 液处理相比，接种FocTR4+201、Foc TR4+204和FocTR4+401发酵液处理可显著促进香蕉幼苗的生长， 分别提高香蕉株高（54.1%、41.6%、44.2%）、茎围 （19.3%、16.7%、22.7%）、叶片数（49.0%、52.2%、67.6%）、叶长（28.5%、24.7%、33.3%）以及增加地上部（95.2%、82.7%、84.5%）和地下部（168.5%、217.1%、317.3%） 鲜重，表明3株拮抗菌株均能在一定范围内减少FocTR4对香蕉植株生长的抑制作用，可作为高效的抗 病促生菌株资源。

3讨论

香蕉枯萎病作为一种严重危害香蕉产业的真菌 性土传病害，迄今尚无有效的控制措施，带菌的吸 芽、病株残体及带菌土壤均可作为病原菌的传染源 （Fan et al.，2021），目前主流方法是利用化学药剂来 防治香蕉枯萎病，但化学药剂防治常会对土壤和水 体环境造成破坏，且过度使用化学药剂易诱导病原 菌产生抗药性（Izquierdo-Garcia et al.，2021）。以可 持续发展的农业生产目标来看，绿色环保无污染的 生物制剂成为当前研究的热点。植物内生拮抗菌作 为一种潜在的生物防治资源，不仅可以分泌多种抗 菌物质和代谢产物抑制植物病原菌，还可在植物中 定殖（Tontou et al.，2016;吕娇娇等，2022）。Mwangi等（2018）发现淡紫拟青霉（PL）和哈茨木霉（TH）能 减少番茄枯萎病菌和爪哇根结线虫，提高番茄抗性； Damodaran等（2020）研究发现，里氏木霉菌株CSR-T-3对FocTR4具有很强的拮抗作用，体外和体内试 验均表现出很好的抑制效果，且在大田中可降低香 蕉的病情指数，促进植株生长和提高产量。本研究 从光叶苕子根部筛选得到3株对Foc TR4拮抗效果较好的真菌菌株201、204和401，经形态学和分子生物学鉴定分别为螺卷毛壳菌、简青霉菌和蓝状菌，其中201号菌株对FocTR4的抑制效果最好，其次是401和204号菌株；盆栽试验结果显示，401号菌株对香蕉球茎的生防效果最好，其次是201号菌株，与平板对峙的201号菌株抑菌率最高的结果存在差异，原因可能是螺卷毛壳菌在培养基上的生长速度比蓝状菌快，同一生长时间占据Foc TR4的生态位不同所致，此外有研究表明蓝状菌能产生相对丰富的代谢物质，其中不乏具有抗菌活性的代谢物，造成盆栽效果较好（侯旭等，2018；王瑶等，2021），而204号菌株对香蕉球茎的防治效果最低，与平板对峙试验的效果一致，推测可能是简青霉菌在温室盆栽土壤和植物中的定殖效果低于蓝状菌和螺卷毛壳菌所致，但3株内生真菌均能显著抑制Foc TR4的侵染，对香蕉枯萎病均具有一定的防效，均可作为香蕉枯萎病生防菌株。在后续研究中，需进一步探明3株内生真菌抑菌物质主要成分和利用分子荧光标记技术进一步验证其定殖效果，为拮抗菌株的合理利用提供依据。

目前，利用青霉菌防治植物枯萎病已有较多研究报道。汪军等（2013）研究发现，施用E7结合套作可促进香蕉生长，提高香蕉根际微生物数量，提高对香蕉枯萎病的防治效果;王子俊（2021）分离获得的拮抗菌草酸青霉和变红青霉可通过降低阿魏酸来抑制黄瓜枯萎病的高发病率。目前有关简青霉菌应用于植物病害防治的研究报道较少。本研究利用简青霉菌204号菌株防治香蕉枯萎病，其效果明显，通过双培养试验对Foc TR4菌丝显微观察发现，204号菌株处理后的Foc TR4 菌丝结构被破坏，菌丝明显肿胀，分枝增多，菌丝粗细不均;菌丝在中间扩张;孢子数目增多，聚集;菌丝断裂。在国内外的一些研究中，Elsharkawy和 Mousa（2015）发现简青霉GP17-2通过PAL、PR-I 和 POX相关基因的激活表达，增强黄瓜对番木瓜环斑病毒（PRSV）侵染的防御机制;蒲丹丹等（2022）分离出1株内生简青霉菌CEF-818，该菌能分泌代谢产物抑制大丽轮枝菌的生长和诱导寄主抗性;Esmail等（2022）发现简青霉能诱导PR蛋白基因高表达而激活小麦对条锈菌的防御机制，提高病株籽粒产量，扫描电镜观察发现，简青霉对小麦条锈菌夏孢子有重寄生作用，可抑制孢子萌发。因此，推测本研究中的204号菌株的抑菌机制是通过分泌代谢产物和激活植物抗病基因表达来实现抗病。毛壳菌作为一种植物最常见的内生真菌之一，在防治植物病原真菌和根结线虫病方面有良好的生物防治潜力，能产生具有抗真菌和杀线虫的次级代谢产物，常作为杀菌剂和杀线虫剂等（廖宏娟等，2022）。肖春萍（2015）从人参根际分离获得1株球毛壳菌FSR74，该菌能有效防治人参锈腐病和黑斑病及疫病，且能占领病原菌生态位，并通过重寄生和抗生作用使病原菌菌丝细胞壁溶解破裂，顶端膨大，分枝增多，分生孢子畸形抑制其生长;张芸（2020）分离出1株球毛壳菌CEF-082，该菌能产生一种活性代谢物破坏大丽轮枝菌细胞壁结构，使病原菌菌丝细胞坏死，并能诱导棉花产生防御反应，减轻黄萎病发病率。本研究分离得到1 株螺卷毛壳菌（201号菌株）也表现出与上述研究相似的效果。近年来螺卷毛壳菌应用于防治植物病害的研究报道仍然较少。杨恩超等（2008）提取1株螺卷毛壳霉得到的含硫次生代谢产物（1～5）对革兰氏阳性细菌具有较强的抑制活性;周秀华和崔磊（2009）分离获得1株对樟子松枯梢病病原菌有较好抑制效果的螺卷毛壳。推测螺卷毛壳菌拮抗机制是产生具有抗真菌活性的次级代谢产物、产生细胞壁降解酶、诱导植物自身产生系统抗性、促进植物生长发育、重寄生、竞争和协同拮抗。本研究还发现1 株蓝状菌（401号菌株），其抑菌率为71.00%，且对Foc4 TR4菌丝生长也有很强的抑制作用，推测其抑菌机制是分泌代谢物破坏病原物，干扰病原物生长（陈仲巍等，2022）。本研究分离到的蓝状菌（401号菌株）在香蕉枯萎病的生物防治上报道较少，但蓝状菌在其他植物病害防治有部分应用，侯旭等（2018）从桃树根部分离出拮抗篮状菌ZJ-4，其通过破坏菌丝及孢子表面抑制桃褐腐病病原菌生长;王瑶等（2021）从土壤中分离纯化出1 株对黄瓜枯萎病病原菌抑菌率高达 70.83% 的绳状篮状菌。综合以上研究结果表明，201、204和 401号菌株对Foc TR4引起的香蕉枯萎病具有显著的生防效果，这是首次利用螺卷毛壳菌、简青霉菌和蓝状菌防治香蕉枯萎病的研究报道。

植物获取土壤养分一般直接从根系吸收或通过根系周围菌根吸收，惹生态系统中可供植物吸收的有效氮、磷和铁等元素缺乏，就会限制植物和微生物的生长，此时存在于植物根系周围的菌根发挥了重要作用，一些根际微生物利用来自宿主植物的光合产物生存，同时参与氮、磷和铁等元素的形态转化过程，并通过菌丝将矿质养分元素运输至植物体内供给植物吸收利用（Zhang et al.，2014）。因此，具有活化营养元素进行固氮、解磷和供铁等多元功能的微生物在促进植物生长方面具有很大的开发潜力，对植物通过菌根途径获取营养元素具有重要意义。谢佳伟等（2021）从烟株组织中分离出1株朱黄篮状菌，该菌可提高云烟87和K326烟苗的株高；而青霉在植物促生领域的研究应用广泛（谌昕伟等，2022）。本研究从光叶苕子根部筛选得到的2株具有解无机磷、固氮和产铁载体的内生真菌，经分子鉴定为简青霉菌和蓝状菌，其中401号菌株蓝状菌解无机磷、固氮和产铁载体能力最强，其次是简青霉菌204号菌株，而螺卷毛壳菌201号菌株未发现具有解无机磷、固氮和产铁载体能力；盆栽验证发现，与CK相比，单独接种3株拮抗菌201、204和401发酵液对香蕉植株的株高和茎围生长无显著影响，可能原因是3株拮抗菌在温室盆栽中的定殖效果均不理想，受外界环境因子的影响，从而无法发挥其最佳的促生功能，这也是目前限制微生物菌剂推广应用的一个难点，因此，后续需利用分子荧光标记技术和高通量测序技术检测生防菌的定殖能力，或优化培养条件，使菌株获得最佳的生长条件，从而发挥其功能。虽然201、204和401号菌株发酵液对香蕉植株的生长无显著影响，但与单独接种Foc4 TR4发酵液处理相比，接种Foc TR4+201、Foc TR4+204和Foc TR4+401发酵液处理可显著促进香蕉幼苗生长，分别提高香蕉株高、茎围、叶片数、叶长及增加地上部和地下部鲜重，表明3株拮抗真菌均能在一定范围内减少Foc4 TR4对香蕉生长的抑制作用，从而促进香蕉植株生长。有研究发现，植物内生真菌可产生寡聚糖、多糖和蛋白等诱导子物质，在调节植物生长发育及诱导植物抗病方面发挥重要作用（邱美莎等，2022），因此，在后续研究中需进一步探明3株内生真菌发酵液的主要成分。

4结论

从光叶苕子根内筛选得到3株拮抗真菌，经鉴定为螺卷毛壳菌（C.cochliodes）、简青霉菌（P.sim-plicissimum）和蓝状菌（T.oumae-annae）。3株拮抗真菌均对香蕉枯萎病菌具有较强的抑制活性，并对香蕉枯萎病菌表现出较好的防治效果，是潜在的香蕉枯萎病菌生防菌资源；同时，3株拮抗真菌均能在一定范围内减少Foc4 TR4对香蕉生长的抑制作用，从而促进香蕉植株生长。

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