藏药塞北紫堇对小鼠急性肝损伤的保护作用及机制研究

【摘 要】 目的：研究塞北紫堇的抗肝损伤作用。方法：采用CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型，通过观察肝组织病理切片，测定小鼠肝脏指数，血清中AST、ALT、AKP、LDH、TNF-α、IL-1β指标，以及肝组织中MDA、SOD、GSH指标，考察塞北紫堇提取物、生物碱和非生物碱部位的抗肝损伤活性。结果：除非生物碱部位外的各组均可降低模型小鼠血清中的AST、ALT、AKP、LDH、TNF-α、IL-1β水平和肝组织中MDA含量（P<0.05，P<0.01），升高GSH和SOD水平（P<0.01）；肝指数和HE染色结果显示，各组均对肝组织损伤具有保护作用，且效果依次是提取物>生物碱>非生物碱部位。结论：塞北紫堇通过降低脂质过氧化，缓解氧化应激，并抑制炎症因子释放来减少模型小鼠肝损伤，总生物碱为其主要活性部位。

【关键词】 塞北紫堇；生物碱；肝损伤

【中图分类号】R285.6

【文献标志码】A 【文章编号】1007-8517（2024）12-0029-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.12.zgmzmjyyzz202412007

Study on the Protective Effect and Mechanism of Corydalis impatiens

on Carbon Tetrachloride Induced Anti-liver Injury in Mice

MIN Tongtong ZHONG Guoyue ZHANG Yamei*

Research Center for Traditional Chinese Medicine Resource and Ethnic Minority Medicine，

Jiangxi University of Chinese Medicine， Nanchang 330004， China

Abstract：Objective To study the protective effect of Corydalis impatiens on liver injury and its mechanism of action. Methods Carbon tetrachloride was used to induce acute liver injury in mice model. Serum liver function indexes of mice aspertate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， alkaline phosphatase （AKP）， lactate dehydrogenase （LDH）， inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （ IL-1β） and liver antioxidant stress factors malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH） in each group were detected. The pathological changes of liver were detected by HE staining.Results Compared with model group， SOD and GSH enzyme activities were significantly increased in total extract group and alkaloids group（P<0.01）， and the contents of AST， ALT， AKP， LDH， TNF-α， IL-1β and MDA were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）.The pathological sections showed that Corydalis impatiens could significantly reduced liver damage．Conclusion Corydalis impatiens has a protective effect on CCl4 induced liver injury， and total alkaloid is the main active part. Its mechanism of action is related to inhibiting inflammatory reation and improving oxidative stress injury of mice liver.

Key words：Corydalis impatiens; Alkaloids; Liver Injury

藏药“/巴夏嘎”是藏医治疗肝胆系统疾病的常用药［1］。由于“巴夏嘎”正品基原药材——爵床科植物鸭嘴花 Adhatoda vasica Nees.在西藏仅有东南部川区的亚热带森林有分布，且资源蕴藏量少，目前西藏大部分地区主要用玄参科植物长果婆婆纳 Veronica ciliata Fisch.以及罂粟科植物塞北紫堇Corydalis impatiens （Pall.） Fisch.做其替代品使用［2］。基于藏药“巴夏嘎”保肝利胆传统功效开展的活性研究主要涉及鸭嘴花中生物碱类成分和长果婆婆纳中酚类成分［3-4］；另一基原植物塞北紫堇及其活性部位的相关研究则未见报道。文献研究［5-6］表明，塞北紫堇具有抗炎、镇痛、抗心肌缺血、抗肿瘤、抗缺氧等多种药理活性，化学成分以生物碱为主，其次包括黄酮、酚类、萜类、醌类等。基于此，本研究采用CCl4致小鼠急性肝损伤模型探究塞北紫堇提取物、总生物碱部位、非生物碱部位的抗肝损伤活性及作用机制，为其临床用于肝病治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 塞北紫堇采自四川省甘孜州甘孜县，由江西中医药大学中药资源与民族药研究中心主任钟国跃研究员鉴定为罂粟科紫堇属植物Corydalis塞北紫堇Corydalis impatiens （Pall.） Fisch.的干燥地上部分。

1.1.2 试剂与药品 多烯磷酯酰胆碱胶囊（批号：H20059010），购自赛诺菲（北京）制药有限公司；谷丙氨酸转移酶（ALT，批号：20210402）、谷草转氨酶（AST，批号：20210401）、碱性磷酸酶（AKP，批号：20210405）、乳酸脱氢酶（LDH，批号：20210405）、肿瘤坏死因子（TNF-α，批号：20210528）、白介素1β（IL-1β，批号：20210528）、丙二醛（MDA，批号：20210406）、超氧化物歧化酶（SOD， 批号：20210407）、谷胱甘肽酶（GSH，批号：20210407）、BCA（批号：20210312），以上均购自南京建成生物工程研究所；水为超纯水（Milli-Q型超纯水系统，法国Milli-Q公司）；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 动物 SPF级健康KM小鼠90只，体重18～22 g，雄性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（湘）2019-0004。饲养于江西中医药大学动物房，提供标准的灭菌饮用水，动物房相对湿度为30%～60%，光/暗循环为12 h，温度为22～24 ℃。

1.1.4 仪器 DY89-II电动匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman-Coulter公司）；Multiskan GO全波长酶标仪（美国Thermo公司）；紫外分光光度计UV-1800（日本岛津有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 塞北紫堇提取物及阳性药溶液制备 称取105 g塞北紫堇药材，粉碎、过2号筛，20倍量85%乙醇加热回流3次，合并滤液浓缩至500 mL。取145 mL提取液，浓缩至干，临用前加 CMC-Na水溶液配成每10 mL含生药2.34 g的提取物溶液作为高剂量组，低剂量组稀释1倍。多烯磷脂酰胆碱胶囊依据预实验加CMC-Na水溶液配成每10 mL含0.18 g药物的阳性药溶液。

1.2.2 生物碱和非生物碱部位制备 取上述塞北紫堇粗提液300 mL浓缩至无醇味，用5%盐酸溶液调节pH至3，石油醚萃取除掉叶绿素，酸水层加10%氨水调节pH至10，用体积比为1∶1的二氯甲烷萃取3次，碱水层复加10%氨水调pH至12，继续用体积比为1∶1二氯甲烷萃取2次。合并5次的二氯甲烷萃取液得生物碱部位，蒸干，同1.2.1方法配成生物碱部位高、低剂量溶液。于碱水层中加5%盐酸调节pH至7，过滤，得到非生物碱部位，蒸干，同上配置非生物碱部位高、低剂量溶液。

1.2.3 动物分组、给药及CCl4模型建立 小鼠适应喂养3 d后，按重量随机分为9组，即空白组，模型组，阳性药组，塞北紫堇提取物高、低剂量组（EH组、EL组），生物碱部位高、低剂量组（AH组、AL组），非生物碱部位高、低剂量组（NH组、NL组），每组各10只。除空白组和模型组灌胃0.5%的CMC-Na溶液（10 mL/kg）外，各给药组分别按高剂量2.34 g/kg（生药）、低剂量1.17 g/kg（生药）灌胃对应药物溶液，每日1次，连续7 d。末次给药2 h后，称重。各给药组和模型组均腹腔注射0.2% CCl4（10 mL/kg）橄榄油溶液建立急性肝损伤模型，空白组腹腔注射等体积橄榄油，造模16 h，期间禁食不禁水。

1.2.4 肝指数计算及血清、肝组织中生化指标检测 造模16h后进行眼球取血，静置2 h，全血于3500 r·min-1，4 ℃离心10 min。即得血清。严格按照试剂盒说明书检测血清中的ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α、IL-1β的水平。将小鼠断颈脱臼处死，于冰台上采集肝脏组织，生理盐水洗净，滤纸吸干水分，称取肝脏湿重，按文献计算肝脏指数（肝脏指数=肝湿重/体质量×1009b7973789f0cc800cb51b643d9087624edbee8093642615e5938bbb134acc871%）［7］。在冰台上快速分离相同部位的肝组织2份，将肝大叶置于10%中性甲醛溶液里进行固定，肝小叶取出后置于-80 ℃冷冻保存。取部分肝小叶组织，解冻后按重量：体积=1（g）∶9（mL）的比例加冷生理盐水制备成10%肝组织匀浆，置于4 ℃ 3500 r/min 离心10 min，取上清液用于检测MDA含量、SOD和GSH的活性。

1.2.5 肝组织病理学变化观察 取肝组织置于10%福尔马林溶液中固定24 h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行HE 染色。光镜下观察肝组织病理学变化。

1.2.6 统计学分析 借助SPASS 21.0软件进行统计学分析，结果以均数加减标准差（x±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析。

2 实验结果

2.1 塞北紫堇对小鼠肝指数及肝组织病理学的影响 当肝细胞处于正常状态时，肝指数较为稳定，进行造模染毒后，肝脏出现充血、水肿或增生肥大等现象，肝指数明显增加。见表1，如图1所示。由表1可知，模型组较空白组小鼠的肝湿重增加，体质量下降，肝指数显著升高（P<0.001），显示造模成功。与模型组相比，阳性药组、EH、EL组、AH、AL组以及NH组均具有显著降低（P<0.01或P<0.001），但NL组降低效果不具有统计学意义（P>0.05）。结合图1各给药组对小鼠肝组织影响的病理图片分析，空白组小鼠肝组织及小叶结构清晰完整，肝细胞排列整齐，呈放射状且核圆而清晰；模型组小鼠肝组织损伤严重，结构模糊，有大量的炎性细胞浸润（以表示），肝细胞排列紊乱，正常结构出现坏死（以表示），表明CCl4造膜成功；与模型组相比，阳性药组小鼠肝小叶结构尚清晰，肝细胞排列明显规则，炎性细胞浸润及肝细胞坏死数量减少，胞质中可见微小空泡（以表示）；EH、EL组肝细胞排列整齐，炎性细胞浸润较少，但损伤程度高于阳性药组；AH、AL组肝组织结构较为清晰，炎性细胞浸润减少，无非常明显的肝细胞坏死现象；NH、NL组胞体略微肿胀，结构略清晰。肝指数和HE染色结果显示，各给药组均对肝组织损伤具有保护作用，且效果依次是提取物>生物碱>非生物碱部位，但次于阳性药。

2.2 对小鼠血清ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α和IL-1β活性的影响 塞北紫堇总提物组、生物碱组、非生物碱组对小鼠血清ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α和IL-1β活性的影响见表2和如图2所示。与空白组相比，模型组小鼠血清中的ALT、AST、AKP、LDH水平急剧升高（P<0.05或P<0.001），提示小鼠出现急性肝损伤，与文献［7］报道一致，表明造模成功。与模型组相比，阳性药组、EH、EL组、AH组对小鼠血清中ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α和IL-1β活性均有显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。AL组对除LDH外的其他指标均有显著降低，但NH组对除AST、AKP外的指标均无显著影响，NL组所有指标均无统计学差异（P>0.05）。

2.3 对小鼠肝组织中的GSH、MDA含量和SOD活性的影响 塞北紫堇总提物组、生物碱组、非生物碱组对小鼠肝组织中的GSH、MDA含量和SOD活性的影响见表3、如图3所示。与空白组相比，模型组小鼠肝匀浆中的MDA含量显著升高，GSH和SOD活性显著降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。与模型组相比，阳性药组、EH、EL组、AH、AL组小鼠肝匀浆中的GSH和SOD活性显著升高，MDA含量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01或P<0.001），且AH、AL组对指标的影响效果优于EH、EL组。NH、NL组对小鼠肝匀浆中的SOD活性无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

CCl4是典型的致肝毒性物质，用其复制的肝损伤动物伤模型也与人类肝脏受损特征类似［9］，因此本实验采用CCl4建立肝损伤模型。ALT、AST、LDH表达于肝细胞内部，AKP则主要分布于人体肝脏、骨骼等组织的细胞膜上，均是肝组织不可或缺的酶，其在血清中的浓度与肝损伤程度呈正相关［9-10］。本实验结果显示，与模型组相比，塞北紫堇提取物和总生物碱组小鼠血清中ALT、AST、AKP、LDH水平显著降低，肝指数显著下降，病理学检查结果亦有较大改善，提示塞北紫堇提取物和总生物碱部位均可缓解模型小鼠的肝损伤程度，且提取物效果优于生物碱，说明除生物碱之外的其他类成分亦具有抗肝损伤作用，而非生物碱部位各项指标亦有所证实，如和模型组相比，非生物碱部位高剂量组小鼠的肝损伤病理学检查结果有所改善，肝指数和AST、AKP水平显著下降。

此外，当肝组织受到损伤时，肝细胞活动减弱，抗氧化酶SOD、GSH等水平降低，氧化应激标志物MDA以及ROS水平增加，显示肝组织氧化平衡被破坏，氧自由基代谢受阻［11］。本研究中，塞北紫堇提取物和总生物碱组小鼠肝组织内的GSH和SOD水平均较模型组显著上升，MDA水平显著下降，说明其可通过改善氧化应激减轻肝损伤。

TNF-α是由Kupffer细胞产生并由T细胞激活的炎症细胞调节因子，可通过诱导双链DNA断裂增加肝细胞凋亡；IL-1β则是由活化的巨噬细胞产生的炎症因子，可进一步刺激淋巴细胞活化，从而加重肝脏的损伤程度，二者的表达均与肝组织炎症反应呈正相关，并进一步加深肝组织的损伤［11-12］。本实验结果显示，塞北紫堇提取物组、总生物碱组血清中TNF-α和IL-1β含量均较模型组显著下降，提示其抗肝损伤作用与抑制炎症因子释放有关。

上述结果表明，塞北紫堇提取物及其总生物碱可通过缓解氧化应激，并抑制炎症因子释放来缓解模型小鼠肝损伤。

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（收稿日期：2023-09-07 编辑：刘 斌）