调节性T细胞在缺血性脑卒中的作用机制及治疗策略

【摘要】缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，其致死、致残率较高但治疗方法十分有限。近年来研究提示，免疫反应可能在缺血性脑卒中发生后的病理生理过程中发挥着关键作用。缺血性脑卒中的免疫反应涉及中枢免疫细胞、外周免疫细胞、血脑屏障及各种炎症分子。其中调节性T淋巴细胞（Tregs）作为T淋巴细胞的重要亚群，通过多种机制在卒中后发挥免疫抑制和神经修复作用。本文主要从缺血性大脑中Tregs的募集、增殖分化、作用机制以及靶向Tregs的治疗策略等方面进行综述。

【关键词】缺血性脑卒中 ; 调节性T细胞 ; 神经炎症

【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】2096-3718.2024.13.0127.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.13.041

缺血性脑卒中（ischemic stroke， IS）是一种由于脑供血动脉狭窄或闭塞、脑血栓形成等局部血液循环中断导致的神经功能缺损综合征，患者多伴有局部脑组织不可逆的损伤，导致脑组织缺氧、缺血性坏死，是最常见的卒中类型。全球疾病负担（GBD）研究报告显示，2019年中国卒中患者达到2 876万例，其中缺血性卒中患者2 418万，约占总患病人数的84%，其中2019年新增的394万例卒中病例中，约70%为IS [1]。目前IS的临床治疗主要集中在血管再通治疗9c1dfaa4cac7727c14f2a6437c01bffff9a0c01a3db6be7be95ea52ed2185c61上，即恢复血液流向梗死区域，挽救缺血脑组织，从而促进神经功能的恢复[2]。组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）再灌注和血管内血栓切3883f7a13384cc385dfe21c8749d987a38a5926c6aeebd2e176e1ee10a2149ac除术是治疗急性期脑卒中的有效方法，但受限于治疗窗口狭窄、并发症风险及治疗效率等诸多因素，只能在缺血后的（超）急性期应用[3]，新的有效疗法亟待开发。

IS后产生一系列复杂的病理学变化，例如脑组织能量代谢异常、氧自由基损伤、细胞酸中毒、细胞内钙离子超载、炎症等，这些过程交叠发生并相互促进，最终导致神经元凋亡和坏死。在此过程中，神经炎症贯穿始终，过度的神经炎症是卒中早期继发性脑损伤的主要原因。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，IS发生后，小胶质细胞被迅速激活，释放活性氧（ROS）、白细胞介素-1β

（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等多种促炎细胞因子，破坏血脑屏障的完整性。随后中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等外周免疫细胞浸润受损大脑，引发炎症级联反应，释放多种损伤相关模式分子，激活了免疫细胞表面模式识别受体并产生了促炎因子，导致脑缺血早期炎症环境形成，加重神经元死亡或损伤[4]。作为免疫反应的主体，淋巴细胞被认为是影响IS后神经炎症后果的关键白细胞亚群。在浸润受损大脑的外周白细胞中，调节性T淋巴细胞（Tregs）是一类重要的CD4+ T淋巴细胞亚群。与其他促炎性淋巴细胞亚群相比，Tregs有免疫抑制功能，参与维持免疫稳态并抑制IS后过度的炎症反应[5]。有基于此，报道表示，Tregs对缺血性脑损伤后的组织恢复也有显著作用[6]。本文对Tregs在IS的作用机制及靶向Tregs的治疗策略研究进展进行综述。

1 Tregs概述

Tregs自发现以来，因独特的免疫抑制功能而备受关注，其主要特征是表达转录因子叉头盒蛋白3（Foxp3）和白细胞介素-2（IL-2）受体α链（CD25）。其中Foxp3是CD4+ CD25+ Tregs分化发育和功能稳定的关键转录因子，与其免疫抑制功能直接相关；CD25在绝大多数Tregs表面都有表达，是维持Tregs生存和稳态所必须的分子标志物[7]。正常生理状态下，Tregs存在于淋巴组织及皮肤、肌肉组织、肺、结肠、内脏脂肪组织、大脑等非淋巴组织中。位于非淋巴组织的Tregs（即组织Tregs）具有与淋巴Tregs不同的表型和功能。除免疫抑制功能外，组织Tregs还具有促进组织修复、调节组织代谢、促进组织再生等功能[8]。不同组织中的Tregs的表征既有共同的特性，也有组织特异性，例如，大脑中的Tregs与其他组织的Tregs相似，通常高表达白细胞介素-10（IL-10）、致瘤性抑制因子-2（ST2）、双调蛋白（AREG）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗

原4（CTLA-4）等基因，但同时也特异性表达中枢神经系统特有的基因，包括神经肽Y（Npy）、前脑啡肽原（Penk）、7型血清素受体（Htr7）及精氨酸加压素受体（Avpr1a）。大脑Tregs在中枢神经系统（CNS）中浸润和积聚，在多发性硬化症、缺血性脑损伤等多种神经炎症性疾病中发挥有益作用[9]。

2 缺血性卒中后Tregs动力学变化

2.1 Tregs募集机制 脑缺血性损伤后，与其他T淋巴细胞相比，Tregs以相对延迟的方式浸润缺血性大脑。Tregs在脑缺血早期即可趋化至脑血管，随着病程的进展浸润至缺血半暗带。Tregs聚集与多种趋化因子在IS不同阶段的动态变化有关。在小鼠模型中，大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）后24 h，CD4+ CD25+ Tregs中趋化因子受体-5（CCR5）表达上调，同时损伤部位血管内皮细胞中CCR5的配体（CCL5）表达上调，CCL5/CCR5相互作用介导Tregs与受损内皮细胞对接，延长Tregs与内皮细胞之间的接触时间，从而维持病变部位Tregs水平[10]。在IS后慢性期（7～14 d），趋化因子受体CCR8和CCR6在脑浸润的Tregs上高度表达，伴随着缺血脑中星形胶质细胞上CCR8的配体CCL1和少突胶质细胞上CCR6的配体CCL20表达的增加，驱动Tregs向脑部病变部位积聚[11]。

2.2 Tregs增殖与分化 IS后慢性期，脑内Tregs的积累主要是其本身增殖，而不是外周T细胞浸润驱动的。Tregs数量的维持和扩增受大脑微环境中多种细胞因子和免疫介质共同作用。IL-2是维持Tregs增殖和发育的关键因子，其与Tregs表面的CD25高度亲和，可促进Tregs增殖和分化；但IL-2对Tregs的扩增不具有细胞特异性，也会导致常规T淋巴细胞扩增并增强其促炎性作用[12-13]。白细胞介素-33（IL-33）是一种多功能免疫调节细胞因子，主要表达于少突胶质细胞和星形胶质细胞。缺血性脑损伤后，IL-33表达增加，通过作用于Treg细胞上的IL-33受体亚基ST2，激活Foxp3，引起Tregs增殖[14]。IL-33还通过上调Foxp3基因的表达，增加CD4+T淋巴细胞向Tregs的分化，同时抑制辅助型T淋巴细胞Th1和Th17的分化[15]。此外，脑Tregs特异性表达的Htr7可以提高环磷酸腺苷（cAMP）水平，从而促进Tregs增殖并增强其功能，而Htr7缺陷的Tregs则在大脑中增殖受到抑制[16]。T淋巴细胞受体（TCR）识别对Tregs在大脑中的增殖也非常重要。脑驻留Treg具有独特的TCR库，在炎症条件下，炎症因子随着TCR刺激的增强而增加，Tregs通过识别自身抗原而被激活[17]。

3 Tregs在缺血性脑卒中的作用及相关机制

3.1 神经保护作用 Tregs在IS中的神经保护作用最早报道于2009年，LIESZ等[18]用CD25特异性抗体消除Tregs，会导致缺血7 d后脑组织损伤加重，神经功能恶化。Tregs的缺失会诱导包括中性粒细胞和效应T淋巴细胞在内的免疫细胞显着增加，从而导致缺血大脑中过度炎症反应。而过继性Tregs移植可显著减轻缺血发生后1～7 d的脑组织损伤，表明Tregs具有神经保护作用[19]。也有一些实验结果并非如此。KLEINSCHNITZ等[20]发现，循环血液中过量的Tregs使野生型小鼠的脑梗死体积增大，而选择性耗尽Tregs可显著减少短暂性大脑中动脉阻塞（transient middle cerebral artery occlusion， tMCAO）后24 h的脑梗死体积。SCHUHMANN等[21]将CD28超激动单克隆抗体（CD28SA）注射到tMCAO模型动物中，发现IS后24 h Tregs扩增与梗死体积大小增加呈正相关。这些差异性结果可能与实验动物模型、Tregs耗竭方法、脑损伤程度等因素有关。

Tregs主要通过接触依赖和非依赖机制发挥脑保护作用。接触依赖抑制主要通过Tregs表面的信号如CTLA-4、

程序性死亡配体1（PD-L1）、半乳糖凝集素-1等与其他免疫细胞相互作用产生免疫抑制作用。例如Tregs上的PD-L1与中性粒细胞上的程序性死亡受体1（PD-1）相互作用，抑制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和ROS的产生，减少血脑屏障的破坏。非接触依赖抑制则主要是通过Tregs释放的转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-4

（IL-4）、IL-10、白细胞介素-35（IL-35）等抗炎细胞因子，抑制效应T淋巴细胞、小胶质细胞、单核细胞等免疫细胞的活化，抑制血液中炎症因子（如IL-6和TNF-α）的含量增加，减弱免疫反应。其中IL-10是Tregs分泌的主要免疫调节分子之一，具有很强的抗炎和免疫抑制活性。IL-10是一种主要由Th2细胞和单核细胞分泌的免疫调节细胞因子，通过激活磷酸肌醇3激酶（PI3K）和信号传导转录激活蛋白3（STAT3），下调促炎细胞因子干扰素γ（IFN-γ）、IL-1β、TNF-α等的表达水平和活性，并抑制Th1淋巴细胞的分化。而补充IL-10可有效阻碍卒中后急性缺血性病变中上调的促炎信号传导，为缺血性脑卒中提供神经保护[22]。此外，有报道称卒中后，肠系膜淋巴结中Tregs通过IL-10抑制IL-17+γδT细胞增殖并阻止其从肠道向软脑膜迁移，减少趋化因子表达和白细胞浸润，改善卒中预后[23]。

3.2 神经修复作用 Tregs通过以下几种不同的机制支持组织修复和再生。卒中后释放的炎症细胞因子（如IL-6）会影响大脑中的星形胶质细胞，导致神经胶质疤痕的形成，对神经修复产生不利影响。大脑Tregs高表达AREG，通过下调小胶质细胞和星形胶质细胞中IL-6和STAT3通路，来抑制与神经元活力受损相关的神经毒性星形胶质细胞基因的表达，从而保护神经元细胞[24]。Tregs衍生的骨桥蛋白（OPN）通过整合素受体作用于小胶质细胞，增强小胶质细胞修复活性，从而促进少突胶质细胞发生和白质修复；并且Tregs产生OPN，进而会刺激小胶质细胞自身产生OPN，进一步放大Tregs的作用[25]。此外，Tregs释放的抗炎细胞因子如TGF-β、IL-10和IL-35，直接促进神经干细胞的增殖[26]。其中IL-10通过与增殖神经干细胞（NSC）上表达的IL-10受体相互作用，调节大脑室下区的细胞外信号调节激酶（ERK）和STAT3活性，来激活神经发生，促进脑功能恢复。而IL-10刺激不足则会导致全身脂多糖注射后的小鼠表现出神经元损伤[27]。

4 靶向Tregs的治疗策略

4.1 Tregs过继治疗 Tregs过继输注是临床前动物模型研究中常用的方法。通过外周血分离提纯Tregs并在体外进行扩增，形成多克隆Treg群，达到治疗目标数量后输注到受体动物体内。在IL-2控制Tregs的功能表型和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂雷帕霉素存在的情况下，用抗CD3/CD28磁珠刺激，可提高治疗性Tregs亚群的稳定性，并且使Tregs扩增优先于其他细胞，但Tregs的非特异性免疫抑制可能会导致潜在的不良反应，例如影响患者自身免疫能力，发生卒中后感染[28]。体外利用供体的抗原呈递细胞特异性刺激可产生抗原特异性Tregs，这些Tregs具有减少免疫抑制活性脱靶的优点，但扩增后产量相对较低。目前，研究的主要方向已转向通过基因工程改造开发抗原特异性Tregs，使Tregs表达嵌合抗原受体（CAR）或人工TCR，实现抗原特异性。其中CAR是工程化受体，可为T淋巴细胞提供靶向特定蛋白质同时激活细胞的能力。相对于TCR，CAR的优势在于能够识别靶组织中的异常蛋白，并且不受主要组织相容性复合体（MHC）限制，从而适用于更多的受试者。CAR-Tregs细胞疗法在移植物抗宿主病（graft versus-host disease， GVHD）、肝移植、Ⅰ型糖尿病（diabetes mellitus type 1， T1D）等多种疾病中均显示出临床潜力[29]。到目前为止，还没有研究测试特异性靶向的CAR-Tregs在脑卒中模型中的治疗效果。

4.2 靶向Tregs的药物治疗 与体外扩增Treg相对应的另一种策略是体内诱导Tregs的增殖。多种药物已被证明可以在卒中模型中促进Tregs增殖。CD28SA是通过内源机制扩增Tregs 并增强其抑制炎症功能的最广泛使用的方法之一。实验动物模型中使用CD28SA 扩增和浸润Tregs有助于减轻炎症并改善缺血后的损伤，这种脑保护作用可持续到卒中晚期[30]。IL-33可促进卒中小鼠脑Tregs的增殖和分化，调节神经炎症并减轻缺血性脑损伤。小鼠MCAO模型中，给予IL-33可以显著增加Tregs的数量并增强IL-4、IL-10和TGF-β等细胞因子的分泌，促进小胶质细胞/巨噬细胞向M2表型的极化，促进组织修复[31]。IL-2对Tregs的发育、增殖和维持至关重要。IL-2治疗窗口窄、半衰期短，且高剂量的IL-2也会导致常规T淋巴细胞增殖。为避免这些问题，将IL-2与抗IL-2抗体联合施用，可延长IL-2的半衰期并选择性扩增卒中后血液和淋巴组织中的Tregs，增强Tregs功能，减小梗死体积，减轻脑组织炎症反应，并改善感觉运动功能[32]。IL-2突变蛋白是人工合成的IL-2突变体，其对Tregs的特异性比常规T淋巴细胞更高，可特异性促进Tregs扩增[33]。YSHII等[34]开发了一种基因传递系统，使星型胶质细胞能够在大脑中分泌IL-2特异性增加大脑驻留Tregs数量，并预防MCAO和血栓性卒中后的病理性神经炎症，而不影响外周免疫系统，具有很高的临床应用潜力。

此外，其他药物或免疫调剂物如多聚ADP核糖聚合

酶1、金丝桃素、血清素等都被证明可通过增强Tregs数量或功能，减轻IS后的神经炎症反应和缺血性脑损伤[35]。这些体内Tregs扩增方法都处于临床前探索的初始阶段。尽管在卒中动物模型中的效果令人鼓舞，但仍存在Treg疗法临床转化的潜在风险。

5 小结与展望

Tregs作为IS后参与免疫应答的免疫细胞之一，以相对延迟的方式浸润缺血性大脑。脑Tregs在多种细胞因子和免疫介质共同作用下增殖、分化，并通过细胞接触依赖和非依赖等多种机制发挥抗炎的神经保护和促进神经修复的作用。尽管对Tregs在脑缺血中的功能仍存在一些争议，但Tregs可能是治疗IS的创新治疗策略。在过去的几年中，Tregs疗法取得了一些进展，但推向临床应用仍然面临很多问题，例如治疗的时间窗口、药物及剂量的选择、给药方法等。需要进一步研究诸多因素对Tregs功能的影响，为临床治疗提供参考。

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作者简介：张怡，硕士研究生，助教，研究方向：缺血性卒中。

通信作者：秦源，硕士研究生，助理研究员，研究方向：局灶性和全脑缺血损伤，围术期脑保护。E-mail：252258115@qq.com