外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能预测人工周期-冻融胚胎移植结局的价值

【摘要】 目的：探讨外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能预测人工周期-冻融胚胎移植结局的价值。方法：选取2021年1月—2023年12月于赣州市人民医院行人工周期-冻融胚胎移植的患者108例，其中妊娠成功48例，妊娠失败60例。观察比较妊娠成功和失败患者外周血miR-21-5p、Foxp3、D-二聚体（D-D）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）的差异，并分析外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能指标预测人工周期-冻融胚胎移植结局的价值。结果：妊娠成功患者外周血miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失败患者，APTT和PT均明显长于妊娠失败患者（P<0.05）。miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT是妊娠失败的影响因素（P<0.05）。miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT预测妊娠失败的受试者操作特征（ROC）曲线下面积分别为0.857、0.790、0.922和0.861。结论：人工周期-冻融胚胎移植成功和失败患者外周血miR-21-5p、Foxp3及D-D和PT有所差异，且在预测妊娠结局方面有一定应用价值。

【关键词】 miR-21-5p Foxp3 凝血功能 人工周期-冻融胚胎移植 预测价值

Value of Peripheral Blood miR-21-5p， Foxp3 and Coagulation Function in Predicting the Outcome of Artificial Cycle - Frozen Embryo Transfer/LEI Chengyong， LI Li， LUO Zhaoxia， HUANG Ying. //Medical Innovation of China， 2024， 21（18）： -143

[Abstract] Objective： To explore the value of peripheral blood miR-21-5p， Foxp3 and coagulation function in predicting the outcome of artificial cycle - frozen embryo transfer. Method： A total of 108 patients who underwent artificial cycle - frozen embryo transfer in Ganzhou People's Hospital from January 2021 to December 2023 were selected， of which 48 had successful pregnancy and 60 had failed pregnancy. The differences of miR-21-5p，

Foxp3， D-dimer （D-D）， activated partial thromboplastin time （APTT） and prothrombin time （PT） in peripheral blood of patients with successful and failed pregnancy were observed and compared. The value of miR-21-5p， Foxp3 and coagulation function indexes in peripheral blood in predicting the outcome of artificial cycle - frozen embryo transfer was analyzed. Result： The peripheral blood miR-21-5p， Foxp3 mRNA and D-D of the patients with successful pregnancy were higher than those of the patients with failed pregnancy， and APTT and PT were significantly longer than those of the patients with failed pregnancy （P<0.05）. miR-21-5p， Foxp3 mRNA， D-D and PT were the influential factors of pregnancy failure （P<0.05）. The receiver operator characteristic （ROC） area under the curve of miR-21-5p， Foxp3 mRNA， D-D and PT for predicting pregnancy failure were 0.857， 0.790， 0.922 and 0.861， respectively. Conclusion： miR-21-5p， Foxp3， D-D and PT in peripheral blood of patients with successful and failed artificial cycle - frozen embryo transfer are different， and they have certain application value in predicting pregnancy outcome.

[Key words] miR-21-5p Foxp3 Coagulation function Artificial cycle - frozen embryo transfer Predictive value

First-author's address： Department of Reproductive Medicine， Ganzhou People's Hospital， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.18.032

冻融胚胎移植（frozen embryo transfer， FET）作为辅助生殖技术的一部分，已逐渐成为提高不孕不育夫妇妊娠率的重要策略。据统计，我国的不孕症患病率为7%～10%，这不仅对育龄夫妇的身心健康构成了严重影响，也对家庭和社会和谐造成了负面影响[1]。虽然FET具有周期短、胚胎利用率高和并发症发生率低等优点，但其成功率仍不够高，据报道，我国FET的成功率为38.60%～68.42%，这一数据显然还有提升的空间[2]。近年来，微小RNA（microRNA，miRNA）这一类非编码小分子RNA在生殖医学领域引起了广泛关注。miRNA通过在转录后水平调节基因的表达，影响卵巢功能和子宫内膜的容受性，从而可能影响到FET的成功率[3]。有研究证实，miR-21-5p在多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）大鼠中的表达降低，其高表达能促进卵巢颗粒细胞的增殖并抑制细胞凋亡，这可能对FET的成功率有着潜在的影响[4]。此外，免疫系统在妊娠中也发挥着关键作用。Foxp3作为调节性T细胞的重要亚型，通过分泌的细胞因子如白介素-10，能显著地调节免疫应答，降低免疫系统的过度活跃，从而维护正常妊娠[5]。有研究表明，Foxp3信使核糖核酸（Foxp3 messenger RNA，Foxp3 mRNA）在黄体期的低表达与反复植入失败之间存在关联[6]。凝血功能的平衡对胚胎着床至关重要，凝血功能障碍可能通过干扰胚胎着床进而影响妊娠结果[7]。尽管凝血指标在预测妊娠结局方面的作用受到认可，但具体应用哪些指标来预测妊娠结局在学术界尚未形成共识。基于此，本研究旨在综合探讨miRNA、免疫应答及凝血功能对FET患者妊娠率的影响，以期为提高FET的成功率提供更为深入和全面的科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年1月—2023年12月于赣州市人民医院行人工周期-FET的患者108例。纳入标准：（1）年龄20～40岁；（2）内分泌激素水平正常；（3）月经周期规律，有优势卵泡；（4）近3个月未使用激素类药物。排除标准：（1）有子宫内膜异位症、子宫肌瘤等子宫疾病；（2）有吸毒等不良嗜好；（3）有精神疾病；（4）有腹部手术史。本次研究获得本院医学伦理委员会批准。患者及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 人工周期-FET 在进行子宫内膜的准备时，本研究采取激素替代疗法。胚胎通过玻璃化冷冻法（Vitrolife公司，冷冻解冻试剂盒）进行冷冻保存，并在移植当日通过玻璃化解冻法（Vitrolife公司，冷冻解冻试剂盒）进行解冻。通过B超技术，监测子宫内膜的厚度和形态，并根据需要调整雌激素的剂量，直至增殖期子宫内膜厚度达到或超过8 mm。在子宫内膜达到适宜厚度后的第4天，进行胚胎移植。移植前，评估胚胎卵裂球的完整性，并将存活率达ymrrqBiUajywxRX5pbelmOFLBzdNr3RNtH4DJE1kttk=到或超过50%的卵裂球定义为健康的胚胎，以便进行移植。妊娠成功标准：胚胎移植35 d后行阴道B超检查，显示子宫腔内有妊娠囊及胎心搏动。

1.2.2 指标检测 （1）miR-21-5p。患者空腹状态下采集3 mL外周静脉血样，用北京天根公司提供的试剂盒进行实验。首先，使用miRNA提取试剂盒从血液样本中分离出总miRNA；接下来，应用miRNA cDNA第一链合成试剂盒将提取的miRNA逆转录成cDNA；随后，进行miRNA荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析，使用针对miR-21-5p和内参基因U6的专一性引物进行。PCR反应遵循的程序包括：先在95 ℃下预变性3 min，然后95 ℃下15 s、60 ℃下34 s，循环40轮。通过PCR获得的循环曲线和循环阈值（Ct）来分析数据，以U6作为内参基因，采用2-ΔΔCt的方法来计算miR-21-5p的相对表达量。（2）Foxp3。采集患者4 mL的静脉血样本并使用乙二胺四乙酸作为抗凝剂，随后以1︰1的比例使用PBS溶液进行稀释。接着，利用淋巴细胞分离介质进行单核细胞的分离，并调整细胞浓度至1×106/L。取100 μL的细胞悬液，分别添加20 μL的CD4-PE和CD25-FITC标记抗体，于室温下暗处孵育20 min。之后，加入冷PBS进行洗涤并进行离心，去除上清并添加2 mL的细胞破膜液，在4 ℃暗处孵育1 h。经过两次洗涤后，加入2 μL的小鼠血清进行封闭，孵育20 min。随后加入20 μL的Foxp3抗体，在4 ℃暗处孵育30 min，再次洗涤两次后，使用Beckman Coulter生产的CytoFLEX流式细胞仪进行分析检测。（3）凝血功能指标。利用Sysmex CA-6000 Series全自动血液分析仪检测D-二聚体（D-dimer，D-D）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin，APTT）和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）。

1.3 统计学处理

数据分析采用SPSS 22.0软件。计量资料包括年龄、miR-21-5p等，用（x±s）表示，用独立样本t检验分析组间差异；计数资料包括不孕类型等，用率（%）表示，用字2检验分析组间差异；预测妊娠失败的价值采用受试者操作特征（ROC）曲线分析；妊娠失败的影响因素采用logistic回归分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 妊娠成功和失败患者的临床资料比较

本次研究妊娠成功48例，纳为妊娠成功组，妊娠失败60例，纳为妊娠失败组。两组年龄、体重指数、不孕类型和病因比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 妊娠成功和失败患者外周血miR-21-5p、Foxp3及凝血功能指标比较

妊娠成功组miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失败组，APTT和PT均明显长于妊娠失败组（P<0.05）；两组TT比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 多因素分析

将miR-21-5p（实测值）、Foxp3 mRNA（实测值）、D-D（实测值）、APTT（实测值）和PT（实测值）作为自变量，妊娠结局（成功=0，失败=1）作为应变量进行logistic回归分析，结果显示：miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT是妊娠失败的影响因素（P<0.05），见表3。

2.4 miR-21-5p、Foxp3及凝血功能预测妊娠结局的价值

miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT预测妊娠失败的ROC曲线下面积分别为0.857、0.790、0.922和0.861，见表4和图1。

3 讨论

在辅助生殖技术领域，FET是一种常见的临床实践，旨在提高妊娠成功率并改善生殖结局[8]。然而，FET的成功率受多种生物学和临床因素的影响，这些因素包括但不限于内分泌状态、胚胎质量、免疫和凝血功能的变化。因此，寻找能够预测FET成功率的生物标志物是当前研究的热点之一。

在本研究结果中，妊娠成功组和妊娠失败组年龄、体重指数、不孕类型和病因的比较，差异均无统计学意义，这表明这些因素不会对患者的妊娠结局产生显著影响。另外，妊娠成功患者外周血

miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D均高于妊娠失败患者，APTT和PT均明显长于妊娠失败患者（P<0.05），提示这些指标可能与妊娠结局具有密切相关性。进一步将miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D、APTT和PT作为自变量进行logistic回归分析，结果显示这些变量（除APTT外）是妊娠失败的独立影响因素，这强化了单变量分析的发现，即这些变量可能直接或间接影响妊娠结局。由此，本研究通过ROC曲线分析发生，miR-21-5p、Foxp3 mRNA、D-D和PT在预测妊娠失败方面显示出较好的价值，这为临床实践中改进妊娠结果提供了潜在的生物标志物。

分析原因为，miR-21已被发现在PCOS患者的卵巢颗粒细胞和卵泡液内表达异常，这种表达与颗粒细胞内的游离睾酮和游离雄激素水平紧密相关[9-10]。李红娟等[11]的研究表明，在PCOS大鼠模型中，miR-21-5p的表达水平显著降低，而高表达miR-21-5p能够有效抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，这一发现表明miR-21-5p在保护卵巢颗粒细胞、维持其正常功能方面具有重要作用。张丽等[12]的研究进一步支持了这一观点，他们发现miR-21-5p表达水平的降低与PCOS患者不孕发显著相关。具体机制可能涉及以下几个方面：首先，miR-21-5p表达降低会促进卵巢颗粒细胞的凋亡，而颗粒细胞在卵泡发育和成熟过程中起着关键作用，其过度凋亡会影响卵泡的正常发育；其次，颗粒细胞是卵泡的重要组成部分，miR-21-5p的低表达可能通过促进颗粒细胞凋亡，进而影响卵泡的发育过程，导致排卵异常和不孕；最后，miR-21-5p的低表达可能导致卵泡发育不良和卵泡数量减少，从而降低卵巢储备功能，影响生育能力[13]。

Foxp3是一种关键的转录因子，主要在调节性T细胞中表达，对于T细胞的功能分化具有决定性的作用[14]。具体来说，Foxp3通过促进T细胞向调节性T细胞的分化并抑制Th1细胞的活性，建立一种抗炎和免疫耐受的环境，这对于胚胎免受母体免疫系统攻击至关重要。调节性T细胞释放的抑制性细胞因子，如TGF-β和IL-10进一步促进了这种耐受环境，帮助维持妊娠的稳定。因此，Foxp3不仅是细胞分化的调节器，也是维持妊娠所需免疫平衡的关键因素，对于确保母体对胚胎的免疫耐受、促进妊娠的顺利进行具有重要意义。在文献[15]的研究中指出，在体外受精及胚胎移植过程中不成功的患者，其外周血中的Foxp3的表达呈现下降趋势，本研究结果与之一致。

D-D是纤维蛋白降解的产物，反映了体内纤维蛋白的生成和降解情况。较高的D-D水平表明体内有更活跃的纤维蛋白代谢，这在一定程度上反映了胚胎植入成功后对局部微血管的修复和重塑需求增加[16]。其次，成功妊娠需要一个良好的子宫内膜环境，较高的D-D水平可能与更好的子宫内膜血供和适应性变化相关，可帮助支持胚胎植入和早期发育[17]。此外，D-D水平升高还与免疫系统的调节有关，成功妊娠过程中，免疫系统需要在保护胚胎免受母体免疫攻击和防止感染之间保持平衡，适度的凝血活动和纤溶系统的参与有助于这一过程[18]。最后，妊娠成功不仅依赖于局部子宫内环境的变化，还涉及母体系统性适应，包括血液凝固机制的调整，较高的D-D水平反映了母体对妊娠的适应性反应，如血液流变性的改变，以支持胎盘和胚胎的发育。PT是评价外源性凝血途径和共同凝血途径的一个指标。妊娠移植失败患者中，D-D水平较低，PT缩短主要反映凝血系统功能紊乱，这可能导致子宫内膜对胚胎的支持不足，影响胚胎的正常植入和发育[19-20]。

综上所述，人工周期-FET妊娠成功和失败患者外周血miR-21-5p、Foxp3及D-D和PT指标有所差异，且在预测妊娠结局方面有一定应用价值。

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（收稿日期：2024-04-24） （本文编辑：陈韵）