GHS-R1a敲除对小鼠下丘脑小胶质细胞表达的影响

邓明铷 钟萍 许靖 刘俊汝 熊星星 袁海成

［摘要］ 目的

探讨生长激素促分泌受体1a（GHS-R1a）敲除对小鼠下丘脑小胶质细胞表达的影响。

方法

选取12只6月龄GHS-R1a-/-雄性小鼠设为GHS-R1a-/-组，12只同月龄野生型（WT）雄性小鼠设为WT组。采用高架十字迷宫（EPM）实验测试两组小鼠的焦虑水平，采用组织免疫荧光技术检测两组小鼠下丘脑小胶质细胞数量，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测两组小鼠下丘脑离子钙结合接头分子1（Iba1）、小胶质细胞活化蛋白CD68和髓系细胞触发受体2（Trem2）基因的表达水平。

结果 两组小鼠EPM实验结果无显著差异（P>0.05）；组织免疫荧光技术检测结果显示，GHS-R1a-/-组小鼠下丘脑中小胶质细胞数量显著多于WT组小鼠（t=4.61，P<0.05）；qRT-PCR检测结果显示，GHS-R1a-/-组小鼠下丘脑Iba1和Trem2 mRNA表达水平显著高于WT组小鼠（t=3.63、3.01，P<0.05），CD68 mRNA水平表达显著低于WT组小鼠（t=3.79，P<0.05）。

结论

GHS-R1a基因敲除不影响小鼠的焦虑水平，但会导致小鼠下丘脑中小胶质细胞数量增加；GHS-R1a可能在抑制小胶质细胞增殖及吞噬功能、促进小胶质细胞活化的过程中发挥调节作用。

［关键词］ 受体，胃促生长素；小神经胶质细胞；钙结合蛋白质类；基因表达调控；下丘脑

［中图分类号］ R392.11；R338.27；R394    ［文献标志码］ A

小胶质细胞作为大脑抵御病原体入侵的重要防线，在中枢神经系统（CNS）免疫中发挥着重要作用，其分布于整个大脑和脊髓中，约占大脑细胞总数的5%～20%[1]。生理情况下，小胶质细胞通常呈现小胞体、高度分支的状态，发挥监测大脑内环境稳态作用[2]。除监视功能之外，小胶质细胞还能吞噬有害物质以维持CNS正常功能及调节大脑内环境稳态平衡[3]。生长激素促分泌受体1a（GHS-R1a）是一种由366个氨基酸残基及7次跨膜结构域组成的G蛋白偶联受体，广泛分布于外周及中枢神经系统[4]，尤其在下丘脑和垂体广泛表达[5]。GHS-R1a受体通常定位于神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞膜上[6]，发挥相应的生物活性作用。GHS-R1a受体除了影响机体生长发育、能量代谢，还参与调节人体学习记忆、食欲、氧化应激反应等生理过程，对多种疾病也具有重要影响[7]。研究显示，下丘脑腹内侧核不仅参与外周代谢调控，其自身还能作为杏仁核的下游“效应器”调控焦虑相关行为[8]，但目前有关GHS-R1a是否参与调节下丘脑小胶质细胞增殖过程未见报道，同时GHS-R1a参与调节焦虑发生的具体机制亦尚不明确。本研究利用GHS-R1a敲除（GHS-R1a-/-）小鼠检测GHS-R1a对于小鼠焦虑水平和下丘脑小胶质细胞及其相关因子表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 材料来源

GHS-R1a+/-小鼠购买于上海南方模式生物科技发展有限公司，下丘脑离子钙结合接头分子1（Iba1）一抗购自日本和光纯药工业株式会社，兔AF488二抗购买于美国Cell Signaling Technology公司，山羊血清、无酶水、RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒购买于美国英杰生命技术有限公司，去RNA酶试剂购自美国赛默飞世尔科技公司，SYBR Green荧光定量试剂盒购自日本宝生物工程有限公司，氯化钠、氨基甲酸乙酯、蔗糖购自美国西格玛奥德里奇公司，包埋剂购自北京普利莱公司，多聚甲醛购自天津瑞金公司。

1.2 小鼠的来源及分组

GHS-R1a+/-小鼠遗传背景为C57BL6J，非同窝GHS-R1a+/-雌雄小鼠间交配繁殖，待小鼠出生1个月以后基因鉴定，保留GHS-R1a-/-小鼠及野生型（WT）小鼠，分别设为GHS-R1a-/-组和WT组，每组各12只。两组小鼠在温度（21±2）℃、湿度（50±10）%、12/12 h昼夜交替光照、可自由饮水与取食的环境下饲养至6月龄。所有小鼠在行为学实验前至少适应实验室环境1周，行为学实验环境需保证光线适度、整洁无异味、安静无噪音干扰，适应期间每天将小鼠放置于实验环境中1 h左右。

1.3 高架十字迷宫（EPM）实验检测小鼠焦虑水平

EPM由1个中心区、2个封闭臂、2个开放臂五部分组成，将两组小鼠头朝向开放臂放入中心区，摄像记录5 min小鼠自由活动过程。利用MATLAB 2018软件分析并记录小鼠在开放臂、封闭臂自由探索的时间及跑动平均速度等参数，以此为据判断小鼠焦虑水平。实验重复3次，结果取均值。

1.4 免疫荧光染色测定小鼠下丘脑小胶质细胞分布密度

使用10%氨基甲酸乙酯麻醉各组小鼠后，固定于泡沫板上，切开小鼠胸腔，充分暴露心脏，将准备好的注射器插入左心室，剪开右心房，推入50 mL生理盐水，待从右心房流出的液体变澄清后拔出针头。将小鼠开颅，完整取出脑组织，沿矢状面切取一半脑组织置于装有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定，次日将溶液换为质量浓度300 g/L的蔗糖溶液。待脑组织沉到EP管底后取出，用冰冻切片机将脑组织沿冠状面40 μm厚切片，置于含有PBS缓冲液的24孔板中。将切片用PBS缓冲液清洗3次（每次10 min）后，使用封闭液常温封闭1 h，再将Iba1一抗（1∶1 000）加入小鼠脑组织切片中，4 ℃下摇床孵育过夜后再用PBS缓冲液清洗3次（每次10 min）后，加入兔AF488二抗（1∶500）室温孵育1 h，PBS缓冲液清洗2次（每次10 min）后贴片，将含DAPI的封片液滴于载玻片，缓慢盖上盖玻片，于显微镜下拍照并保存。使用Image J软件分析照片图像从而得出小胶质细胞密度。实验重复3次，结果取均值。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测小鼠下丘脑离子钙结合接头分子（Iba1）、CD68和髓系细胞触发受体2（Trem2）mRNA表达水平

将1.4中剩余部分下丘脑组织置于1.5 mL的无酶离心管中，加入裂解液研磨至混悬液后，4 ℃下12 000 r/min离心5 min；取上清液加入新无酶EP管中，并加入体积分数0.7的乙醇溶液700 μL，涡旋振荡后将液体加入分离柱，待洗脱蛋白质及无机盐后加入30 μL无酶水，将液体离心转移至新无酶EP管中。用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度后按RNA逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，按SYBR Green荧光定量试剂盒说明书配制反应体系后扩增，以GAPDH作为内参照，计算Iba1、CD68及Trem2的相对表达水平。引物名称及其序列见表1。

1.6 统计学分析

采用Graph Pad Prism 6统计学软件对数据进行处理。符合正态分布的计量资料以[AKx-D]±s表示，两组间比较采用双尾t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 两组小鼠焦虑水平比较

EPM实验结果显示，GHS-R1a-/-组及WT组小鼠开放臂探索时间占总时间之比分别为（9.53±3.47）%、（8.73±5.65）%，平均速度分别为（4.56±0.77）、（4.69±0.87）cm/s，两组小鼠上述指标比较无显著差异（P>0.05）。

2.2 两组小鼠下丘脑小胶质细胞密度比较

组织免疫荧光染色结果显示，GHS-R1a-/-组与WT组下丘脑小胶质细胞密度分别为（10.71±3.25）%和（4.38±0.87）%，GHS-R1a-/-组小鼠下丘脑中小胶质细胞密度显著高于WT组小鼠（t=4.61，P<0.05）。见图1。

2.3 两组小鼠下丘脑Iba1、CD68及Trem2 mRNA表达水平比较

qRT-PCR技术检测结果显示，GHS-R1a-/-组小鼠Iba1、CD68及Trem2 mRNA相对表达量分别为1.18±0.06、0.65±0.18、1.24±0.20，WT组小鼠上述指标分别为1.01±0.04、1.43±0.47、0.92±0.16。GHS-R1a-/-组小鼠下丘脑Iba1和Trem2 mRNA表达水平显著高于WT组（t=3.63、3.01，P<0.05），CD68 mRNA表达水平显著低于WT组（t=3.79，P<0.05）。

3 讨  论

GHS-R1a作为G蛋白偶联受体家族的重要成员，是胃饥饿素ghrelin的功能性受体，具有抗炎、抗细胞凋亡、参与学习记忆等生物学功能[6，9]。研究显示，ghrelin在下丘脑-垂体-肾上腺轴应激反应中发挥着重要作用，在下丘脑注射ghrelin可引起小鼠短期内的焦虑行为[10]，但目前GHS-R1a调节情绪的具体机制尚不明确。此外，作为脑组织中GHS-R1a含量最高的部位，下丘脑除了在控制机体进食、新陈代谢和能量平衡方面发挥着关键作用，还参与了伴随情感活动而出现的机体自主性活动、躯体活动及内分泌活动，与情绪反应有着密切关系[11]。研究显示，在慢性压力刺激下，下丘脑腹内侧核神经元的簇状放电也同时参与了焦虑与能量代谢的调控过程[12]。但本研究结果表明，GHS-R1a敲除对小鼠自发活动及焦虑情绪无明显影响。推测原因可能是由于焦虑的产生通常在短期实验中较易观察，而本研究实验周期较长，小鼠对环境已经适应，因此小鼠的焦虑状况不明显。

小胶质细胞作为CNS中最重要的组织特异性巨噬细胞，可动态检测脑组织环境变化中的病原体及危险信号，保护正常细胞的生理功能[13]。此外，小胶质细胞还能与神经元交互作用，在神经元早期发育过程中修剪多余突触，去除神经元之间的多余连接[14]。当CNS受到急性损伤时，发挥防御保护功能的小胶质细胞在数分钟内被激活，然后增殖、迁移到病变部位[15]，从分支较多的形态变为圆形或阿米巴样形态[16]，同时释放相关炎症因子，使得自身进一步被激活，吞噬能力增强。但是在阿尔茨海默病（AD）和帕金森病等神经退行性疾病过程中，慢性持续性炎症会使小胶质细胞被过度激活，造成机体正常组织受损[17-18]。研究显示，小胶质细胞对神经元树突棘的吞噬有助于消除由急性应激引起的焦虑样行为，但是目前对神经元-小胶质细胞相互作用的动态机制及其在急性应激所致焦虑的恢复中的作用机制仍未明确[8]。本研究中组织免疫荧光染色及qRT-PCR技术检测结果均显示，下丘脑中小胶质细胞的数量因GHSR-1a敲降而明显上调，这可能与GHSR-1a缺失造成的小胶质细胞重编程有关，具体机制仍待进一步探索。

Trem2属于免疫球蛋白超家族成员，为一种单次跨膜受体，在CNS中特异性表达于小胶质细胞膜表面[19]，其配体包括阴离子、两性离子、磷脂、糖脂、凋亡细胞、脂质化颗粒和脂蛋白等[20-21]。研究显示，Trem2缺乏与AD早期β-淀粉样蛋白负荷的降低有关，Trem2在AD代谢稳态当中发挥着重要的作用[22]。另有研究显示，Trem2的缺失可降低小胶质细胞对凋亡细胞、细胞碎片和细菌的吞噬作用[23]。

Iba1是一种相对分子量为17 000的钙结合蛋白，在CNS中特异表达，通常在活化的小胶质细胞中表达增加，是小胶质细胞的标志物。

CD68是一种相对分子质量为110 000跨膜糖蛋白，主要在小胶质细胞和巨噬细胞溶酶体中表达，不仅能作为小胶质细胞被激活的标志，还在肿瘤的免疫调节及预后中起重要作用[24]。本研究结果显示，GHS-R1a敲除可使Iba1、Trem2基因表达水平上调，CD68基因表达水平下调，表明GHS-R1a受体可能抑制小鼠下丘脑小胶质细胞的吞噬功能，并促进小胶质细胞的活化。尽管GHS-R1a在CNS中广泛分布，但是目前在小胶质细胞中未检测到其表达[25]。因此我们猜测GHS-R1a敲除可能通过影响神经元或星形胶质细胞与小胶质细胞之间的相互作用，造成小胶质细胞数量的上调，但具体机制仍需进一步探讨。

综上所述，GHS-R1a敲除对小鼠的自发焦虑水平无明显影响，但能引起下丘脑小胶质细胞数量及Iba1、CD68及Trem2表达水平的变化，GHS-R1a可能在抑制小胶质细胞增殖及吞噬功能、促进小胶质细胞活化的过程中发挥调节作用。

伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学实验动物福利伦理委员会的审核批准（文件号20220701Ghs-R1aKO2620231120101）。所有实验过程均遵照《伦理委员会标准》条例进行。

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