液相色谱仪计量检定中的技术问题与对策探讨

胡锦灵 蔡玉剑

摘 要： 随着我国工业、农业、化工、医药、科技等行业的快速发展，实验室对液相色谱仪的需求量不断增加。此仪器在使用较长时间后，会出现各种问题，影响所测数据的准确性，需要定期对其进行计量检定。在检定的过程中存在一些技术问题，影响检定的正常进行。探讨液相色谱仪计量检定中的技术问题与对策，以供同行参考借鉴。

关键词： 液相色谱仪 计量检定 技术问题 对策

中图分类号： TH833文献标识码： A文章编号： 1679-3567（2024）01-0024-03

液相色谱仪（HPLC）是分析实验室常用的测试仪器之一，随着我国工业、农业、化工、医药、食品、环保科技等行业的快速发展，其应用的领域也越来越广泛，实验室对液相色谱仪的需求量也不断增加。此仪器在使用较长的时间后，会出现各种问题，影响所测数据的准确性[1] 。因此，需要定期对其进行计量检定。在检定的过程中，会遇到一些常见的技术问题，影响了检定的正常进行。对此，笔者对这些技术问题及其对策进行归纳汇总，以供同行参考，确保检定的顺利开展。

1 液相色谱仪概述

液相色谱法是一种新型分析、分离技术，拥有高分析效率、高灵敏度的特点，在食品检测、生物制药、化妆品检测等领域得到了广泛应用。液相色谱法需要在液相色谱仪上进行，由于液相色谱仪采用的检测器属于非破坏性的，样品在被液相色谱仪分析之后，通常情况下，可以除去流动相，可以回收珍贵的样品。同时，液相色谱仪不但检测灵敏度好，分离效能高，而且选择性好，分析速度快，因此它的应用领域不断扩大，在工业、农业、化工、医药、食品、石油、生物、化学、环保、科研等行业和领域广泛应用。

液相色谱仪使用前，为了确保检测结果的精密度高，准确可靠，做好液相色谱仪的计量检定至关重要，其目的是保证仪器处于正常运行的状态。检定合格后，可以放心使用。液相色谱仪一般由计量部门检定，这种大型仪器国家规定两年检定一次，按液相检定规程操作，采萘标准溶液，先要调节检测器的灵敏度。流速的检定，在《液相色谱仪检定规程》（JJG 705—2014）中规定，使用容量瓶收集后，再用电子天平称重进行计量；波长准确度的检定，根据现在使用版本的检定规程，紫外检测器使用紫外分光光度计溶液进行检定。如果当地计量部门不能检定，应联系外地计量部门进行检定，否则一旦上级主管部门发现问题，会作为不符合项要求整改。对于大型的仪器设备，一般检测人员要做维护、保养和期间的核查工作，对于不能检定的，要进行校验，一年或半年校验一次。

实验室内部仪器校准中，液相色谱仪的准确度试验，又叫做回收率试验，含量和杂质试验都需要做。操作方法是低浓度3个、中浓度3个、高浓度3个。如含量测定，就是80%浓度样品3个、100%浓度样品3个、120%浓度样品3个。如果是外标的话，另外再做对照品。结果是回收率，也就是测得量/加入量×100%。

精密度试验包括重复性、中间精密度和重现性试验。重复性就是100%浓度的样品，直接是样品平行配置6个。中间精密度试验，需要换时间、换实验员、换仪器，结果是6个结果之间的RSD%。准确度试验考察的是一个浓度范围内，样品测定结果的准确度，而精密度试验考察的是同一个浓度的数据平行性。

液相色谱仪是一种极高精度的测量分析仪器，在实际进行检定工作的过程中，检定人员应依照具体的操作规范和要求，正确开展检定工作，避免因为操作不规范引起仪器损坏或检定结果失准的现象。同时，还应根据检定目标的差异，使用最为适合的检定方法及手段，还要注意检定的细节，对相关的注意事项进行全面分析，实现对检定环节的深入控制，使检定结果客观、真实地反映出液相色谱仪的实际情况。检定工作完成后，检定人员要对相应的数据信息，进行细致、准确的收集，并按照公式进行计算，并特别注意数据的单位换算问题，以避免计算错误，确保检定结果的准确性和可靠性。

2 液相色谱仪计量检定中的技术问题与对策

2.1 存在气泡

2.1.1 出现气泡的原因

对液相色谱仪进行计量检定时，如果其中存在气泡，会导致仪器的灵敏度降低。出现气泡的原因主要有以下3种：

（1）在流动相溶液中，进入了空气；

（2）液相色谱仪流路中残存一些空气，没有被排干净；

（3）注入样品时操作不规范，导致空气进入。

2.1.2 对策

为了避免气泡的出现，检定人员对液相色谱仪进行计量检定时，首先对流动相要严格进行脱气处理；其次，在液相色谱仪开始工作前，利用注射器，对流路中存在的空气，彻底排除干净；最后，在注入样品时，要严格按照规范操作，避免混进去空气。

2.2 基线噪声大

2.2.1 引发基线噪声大的原因

引发基线噪声大的原因主要有以下4种：

（1）使用了低纯度溶剂，或者流动相受污染；

（2）检测器流通池，流动相内有气泡；

（3）通过检测池的能量不足；

（4）波长设定过短。

2.2.2 对策

对此，检定人员应当取用纯度更高的溶剂，并检查样品池中的情况，一旦发现污染，应及时清洗样品池。如果样品池污染严重，检定人员可拆开样品池，将透镜进行超声清洗。

此外，空气中漂浮的灰尘等，也会导致基线噪声大，因此，在对液相色谱仪进行计量检定的过程中，要注意保持室内清洁。

2.3 进样后没有出现色谱峰

进样后，如果液相色谱仪没有色谱峰，首先，要对检测器、色谱仪泵进行检查，如果检测器、色谱仪泵已经打开，检查废液管是否有废液流出，如果有废液流出，检查流速快慢，是否正常。如果废液管中流出的废液流量非常小，甚至没有废液流出，那么，导致进样后没有出现色谱峰的原因，一般有两种：一是流路内有气泡；二是过滤器堵塞。对于流路内有气泡的情况，检定人员要断开色谱柱，并以5 mL/min的流量，对管路进行冲洗，以将气泡冲洗出来。对于过滤器堵塞的情况，可将过滤器放入5%硝酸溶液中浸泡，采用超声清洗5 min左右即可[2]。

2.4 压力和流量不稳

压力和流量不稳的原因有以下3种：

（1）存在气泡，检定人员要进行排除；

（2）单向阀内存在杂物，对此，检定人员可以卸下单向阀，将其浸入丙酮内，进行超声清洗；

（3）砂滤棒内存在气泡，或存在微生物，造成砂滤棒堵塞。对此，可卸下砂滤棒，将其浸入到流动相内，进行超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸内，除去里面的微生物，然后，再进行清洗。

为避免压力过高，检定人员可采用流动相过滤、样品过滤等方法，滤掉溶剂和样品中的微小颗粒与细菌，以避免色谱柱、流路的堵塞[3]。而压力波动，则是由宝石球沾在球座上、宝石球或球座受污染，所导致的密封差。此时，检定人员可选择合适的器械，将连接入口的单向阀顶开，并进行清洗。

2.5 色谱峰分叉

色谱峰分叉的原因主要有以下几方面。

2.5.1 色谱柱的问题

溶解样品的溶剂太强、色谱柱柱头污染或部分堵塞、分离效果差、柱填料老化塌陷等现象，都有可能导致色谱柱出现问题。

解决方法如下：找一点标准品萘溶液，走一针比对柱子的说明书看峰位峰形，如果和说明书上的图差异很大，则需要更换色谱柱；如果色谱峰分叉是由于色谱柱柱头污染引起的，需要对色谱柱进行冲洗，使用比流动相更强的溶剂，来冲洗色谱柱。

2.5.2 样品进样量太浓、标品不纯、柱头塌陷等问题

样品进样量太大太浓，则需要稀释；标品不纯或样品分离效果不好，里边裹峰或者流动项被污染。柱头塌陷或柱内填料流失，导致了死体积和柱内空隙；或者连接柱子时选用的peek头不配套：色谱柱虽能固定住，但管线与柱头仍有一定空间，涡流导致峰前延或分叉。对此，换个配套的peek头后，重新接色谱柱即可。

2.5.3 流动相配制的问题

流动相配制可能会出现问题，例如：配制的时间比较久；用流动相当溶剂去溶解样品，单用有机溶剂溶样也会出现分岔峰。可以重配一次或配制不同比例的流动相即可。也可以换一下溶剂，换成流动相，或者调整一下流动相的比例，尽量让流动相中乙腈所占的比例与溶剂中所占的比例接近。之前的检定工作中也出现过色谱峰分叉问题，色谱柱也没换过，梯度用流动相（乙腈∶水∶60∶40）从0、0.1、0.3、0.5、0.7、1各隔5 min梯度上升走过一遍，即可解决问题。

2.6 泵漏液

液相色谱仪的泵漏液，有柱塞密封垫磨损漏液与清洗垫磨损漏液两种情况。手动进样器的漏液，通常是由转子密封垫出现磨损，而引起漏液；检测器的漏液，大多是由于流通池堵塞，引起漏液，而柱子接头处的漏液，通常是由于接头出现磨损，进而松动，出现不匹配等情况引起的漏液[4]。为预防、解决泵漏液的这一类问题，液相色谱仪的操作人员，应每两年便更换仪器相应的部件。

在液相色谱仪实际检定的过程中，特别是在检定色谱柱的柱箱温度时，基本都是应用恒温操作的方式完成，这就需完全依照规范和要求操作，控制好实验温度变化，避免影响恒温操作效果[5]。温度控制区域一般不能超过3℃，如果使用示差折光率检测器，更要严格控制好温度，使温度变化区域控制在2 ℃以内。此外，液相色谱仪检定的过程中，环境的湿度控制也是非常重要的方面，整体的空气湿度应控制在20%～85%之间，以避免由于环境因素影响过大，而使最终的检定结果出现较大的误差。

需要注意的是，液相色谱仪作为一种高精密度的仪器，要确保仪器的精准度，做好日常的维护、保养，就显得至关重要 。细节决定成败，要重视保养细节，例如：流动相的过滤、溶剂过滤头、泵密封垫、脱气、系统管路等，每次使用过后，都要坚持认真清洗，否则，易导致色谱柱堵塞、色谱峰异常等故障，影响液相色谱仪的正常使用[6]。在进行计量检定工作过程中，检定人员要注意检定的细节和知识的积累，及时记录检定工作中遇到的各种技术问题，并归纳整理，总结经验，有助于以后仪器检定工作的顺利开展。

3 结语

综上所述，液相色谱仪检定时会遇到很多技术问题，检定人员要采取相应的对策将其解决。随着液相色谱技术的不断进步，液相色谱仪朝着自动化、智能化的方向发展，技术更先进，灵敏度更高，分析时间更短，分类速度更快，对此，检定技术也要与时俱进，不断发展进步，以确保更先进仪器检定结果的准确性和可靠性。

参考文献

[1]杨莺.高效液相色谱仪检测的影响因素及解决方法[J].化学工程与装备，2022（1）：206-207，222.

[2]黄宁，王婷.浅谈液相色谱仪计量检定中常见问题分析及仪器日常维护[J].中国检验检测，2022，30（2）： 59-60，75.

[3]郁蕉竹，王韵，周长民，等.高效液相色谱仪的使用与故障分析[J].品牌与标准化，2022（3）：72-74.

[4]仝慧.高效液相色谱仪的故障分析及解决办法[J].山东化工，2020，49（12）：88-89，91.

[5]周婕，邱旸，罗明.液相色谱仪检定中的问题及建议[J].上海计量测试，2023（4）：36-38，42.

[6]柴梅梅.浅谈高效液相色谱仪日常维护经验[J].食品安全导刊，2020（27）：174.