农贸市场食品来源大肠埃希菌的耐药性及其ESBL耐药基因的研究

摘 要：目的：调查云南省保山市农贸市场售卖畜禽肉蛋和蔬菜超广谱β- 内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）大肠埃希菌污染情况，研究样品分离获得的大肠埃希菌ESBL耐药基因类型。方法：收集农贸市场食品样本，分离鉴定样品中的大肠埃希菌并进行药敏试验，扩增大肠埃希菌的ESBL基因，对扩增产物进行测序和同源性比对分析。结果：245份食品样本中分离获得大肠埃希菌75株，其中产ESBL大肠埃希菌25株。对ESBL耐药基因测序结果进行系统发育分析，发现耐药基因为CTX-M型，CTX-M-15序列有9株，占比为36%；CTX-M-14有16株，占比为64%。结论：肉类和蔬菜携带ESBL大肠埃希菌，多重耐药菌及其耐药基因可能通过食品在社区传播。

关键词：食品；大肠埃希菌；多重耐药菌；超广谱β-内酰胺酶；耐药基因

Study on the Resistance of Escherichia coli from Food Sources in Agricultural Markets and Its ESBL Resistance Genes

ZHENG Yue， CAI Peng*， LI Yan， ZHANG Yunxia， WU Zhiyun， WANG Xuelong

（Baoshan College of Traditional Chinese Medicine， Baoshan 678000， China）

Abstract： Objective： To investigate the contamination of ESBL in Escherichia coli sold in livestock and poultry meat， eggs and vegetables in Baoshan city， Yunnan province， and to study the types of extended-spectrum β-lactamase （ESBL） resistance genes of Escherichia coli isolated from the samples. Method： Food samples were collected in Baoshan farmers’ market， and Escherichia coli was isolated and cultured for identification and drug susceptibility test， and ESBL gene was amplified by PCR， sequenced and analyzed for homology comparison. Result： A total of 75 strains of Escherichia coli were isolated from 245 food specimens， including 25 strains of ESBL E. coli. Phylogenetic analysis of the sequencing results of ESBL resistance genes showed that the drug resistance genes were CTX-M type， and there were 9 strains in the CTX-M-15 group， accounting for 36%. There were 16 strains in the CTX-M-14 group， and the detection rate was 64%. Conclusion： Meat and vegetables carry ESBL Escherichia coli， and multidrug-resistant bacteria and their resistance genes may be transmitted in the community through food.

Keywords： food; Escherichia coli; multidrug-resistant bacteria; extended-spectrum β-lactamase; resistance gene

β-内酰胺类抗生素是一种广谱抗生素，超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamase，ESBL）是一组酶，可以水解多种β-内酰胺类抗生素，包括第四代头孢菌素，对其他抗生素类别（如喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和磺胺类药物）具有一定耐药性。ESBL的扩散是全世界主要公共卫生问题之一[1]。大肠埃希菌是人畜肠道正常菌群，也是养殖动物腹泻和社区尿路感染主要的病原菌[2]。流行病学研究表明，由质粒介导ESBL在各种革兰氏阴性杆菌中传播速度非常快，产ESBL大肠埃希菌是医院内获得性感染的重要致病菌之一，临床治疗难度高，死亡率比感染普通大肠埃希菌明显增加[3-4]。

人类接触或食用未经高温处理的食物，耐药细菌通过食物从环境转移到人体内，感染或携带ESBL大肠埃希菌的健康人群不会有任何临床症状，但会提高社区感染耐药菌风险。畜禽类在养殖过程中大量使用或滥用抗生素，提高了养殖畜禽类动物携带细菌的耐药性，因此畜禽类产品所携带的耐药细菌一直是细菌耐药监测追踪的热点。相比而言，研究者们对蔬菜被产ESBL大肠埃希菌污染情况的关注度较低，但随着素食主义的兴起，生食蔬菜逐渐流行。蔬菜可能在种植过程中被灌溉水、动物粪便等污染源污染，也可能在收获、加工、储存或运输等阶段被环境和工作人员携带的耐药细菌污染，这些都可能使新鲜蔬菜成为传播产ESBL大肠埃希菌的媒介。

本研究调查云南保山地区农贸市场售卖肉类和蔬菜的ESBL大肠埃希菌污染情况，分析大肠埃希菌对临床常用抗生素耐药情况以及大肠埃希菌ESBL耐药基因的类型，以期为了解产ESBL大肠埃希菌及耐药基因在该地传播和扩散的情况提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样本

2021年9月—2022年9月，收集云南省保山市隆阳区农贸市场食品样本共245份，包括肉类110份（鸡肉50、猪肉60）、蔬菜110份（生菜50、黄瓜20、韭菜20、豆芽20）、鸡蛋25份。新鲜样品装入无菌采样袋，置于消毒低温箱内保存，2 h内带回实验室。

1.2 材料与试剂

ss培养基、EC肉汤、MH琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术有限公司；细菌生化微量鉴定管，购自杭州微生物试剂有限公司；药敏纸片，购自温州市康泰生物科技有限公司；亚胺培南，购自英国oxoid公司；PCR Master Mix、DNA Marker，购自上海擎科生物技术有限公司；PCR引物由上海擎科生物技术有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 样本处理

无菌称取25 g新鲜肉类和蔬菜样品（表面），用灭菌剪刀切碎，加入225 mL EC肉汤中，36 ℃摇瓶增菌培养18～24 h。划线接种到含有头孢呋辛（32 μg·mL-1）的ss平板和普通ss平板中。

使用无菌湿润棉签涂抹整个鸡蛋样品表面后，将棉签头放入225 mL EC肉汤中，36 ℃摇瓶增菌培养18～24 h。划线接种到含有头孢呋辛（32 μg·mL-1）的ss平板和普通ss平板中。

1.3.2 大肠埃希菌的分离鉴定

ss平板36 ℃培养18～24 h，优先挑取含有头孢呋辛ss平板上边缘整齐、光滑湿润的粉红色单菌落，每个样本挑选1株，使用细菌微量生化反应管鉴定。如果含有头孢呋辛ss平板上没有目标细菌生长，则随机挑取不含头孢呋辛ss平板边缘整齐、光滑湿润的粉红色单菌落，使用细菌生化微量鉴定管进行菌种鉴定。

1.3.3 药敏实验

根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的药敏试验标准（2020年），采用纸片扩散法检测亚胺培南等抗生素对分离获得的大肠埃希菌抑菌圈的大小，以大肠埃希菌ATCC 25922作为标准质控。药敏实验结果用敏感（S）、中敏（I）和耐药（R）报告，对3类及以上抗菌药物同时耐药的菌株记为多重耐药菌。

1.3.4 ESBL大肠埃希菌表型确证实验

按照CLSI标准，用头孢他啶（CAZ）与头孢他啶/克拉维酸（CCV）、头孢噻肟（CTX）与头孢噻肟/克拉维酸（CTC）两组纸片同时检测，将两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌环直径相比，差值≥5 mm则判断为产ESBL菌株。以肺炎克雷伯菌ATCC 700603作为阳性对照，大肠杆菌ATCC 25922作为阴性对照。

1.3.5 耐药基因的扩增和测序

挑取单菌落作为模板进行PCR。PCR扩增反应：根据张青青等[5]提出的方法合成blaCTX-M、blaSHV、blaTEM耐药基因引物序列。PCR反应体系（30 μL）：H2O 13.8 μL，PCR Master Mix 15 μL，上、下游引物各0.6 μL。变性温度为95 ℃，退火温度根据扩增基因的不同各有差异（表1），延伸温度为

72 ℃，30个循环后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶，100 V进行电泳检测。将CTX-M阳性的耐药基因扩增产物送上海擎科生物技术公司进行序列测定。

1.3.6 耐药基因系统发育分析

测序结果在NCBI网站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对，分析耐药基因的型别。使用MEGA11进行多序列比对分析，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，确定耐药基因的类型和系统发育关系。

1.4 数据分析

使用WHONET 5.6软件对药敏实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 大肠埃希菌分离鉴定结果

经选择培养基筛选及微量生化管鉴定，从245份样本中分离筛选出75株符合大肠埃希菌培养特征的菌株。肉类样品中分离出45株大肠埃希菌，其中50份鸡肉样本中分离出17株，分离率为34.00%；60份猪肉样品中分离出28株，分离率为46.67%。蔬菜样品共分离获得26株大肠埃希菌，分离率为23.64%。鸡蛋外壳分离到4株大肠埃希菌，分离率为16.00%。

2.2 临床常见抗生素药敏实验结果

75株非重复大肠埃希菌对临床常见抗生素的耐药情况如图1所示（本实验将鸡肉和鸡蛋中分离的大肠埃希菌药敏试验结果合并统计，统称为鸡类）。可以看出，鸡类、猪肉和蔬菜3类样品中分离出的大肠埃希菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药率最高，分别为85.71%、75.00%和76.92%；对亚胺培南的耐药率最低，说明大肠埃希菌对亚胺培南敏感。

所有样本分离获得的大肠埃希菌中，ESBL大肠埃希菌共25株，占比33.33%；多重耐药菌共有31株，占比41.33%。不同样本产ESBL大肠埃希菌和多重耐药菌的分离情况见图2。

2.3 产ESBL大肠埃希菌药敏实验结果和耐药基因类型

25株产ESBL大肠埃希菌对亚胺培南敏感，三代头孢类抗生素头孢噻肟和头孢曲松耐药率高达100%。ESBL耐药基因全部为blaCTX-M，未检测到blaTEM和blaSHV。将PCR扩增结果测序后在NCBI网站进行序列比对，结果显示CTX-M-15序列有9株，占比为36%（9/25）；CTX-M-14有16株，占比为64%（16/25）。25条CTX-M基因序列的系统发育、药敏试验结果如图3所示。

3 讨论与结论

本研究调查了保山市农贸市场售卖食品被产ESBL大肠埃希菌污染的情况，在市中心城区主要农贸市场采集样本共245份，分离获得大肠埃希菌75株，分离率最高的是猪肉样品（分离率为46.67%），其次为鸡肉（分离率为34.00%）。有研究显示，北京鸡肉样品中大肠埃希菌分离率为77.38%，猪肉样品中该菌分离率为42.86%[6]；广州鸡肉样品中该菌分离率为16.9%，猪肉样品中该菌分离率为83.1%[7]；新疆猪肉样品中该菌分离率为56.0%，鸡肉样品中该菌分离率为33.3%[8]，地域差异明显。畜禽肉类样品在处理、运输和售卖过程中动物粪便污染程度和肉类的新鲜程度是大肠埃希菌分离率不同的主要原因。

本次研究结果显示，不同样品分离大肠埃希菌差异明显。蔬菜种植过程中较少涉及抗生素的直接使用问题，其表面大肠埃希菌污染主要来源于种植场所受动物粪便污染的土壤和水，以及种植、采摘、运输和售卖环节工作人员或其他环境污染。本次研究中，蔬菜中大肠埃希菌分离率为24.5%，比学者研究的扬州蔬菜样品中大肠埃希菌的分离率（13.82%）高[6]，其原因可能是城市集约化种植肥料使用和蔬菜处理流程更规范，而农村散户种植使用动物粪便作为肥料或使用被粪便污染的水进行简单清洗以便售卖，使得更多的蔬菜样品中分离出大肠埃希菌。鸡蛋表面光滑，水分容易流失，如果放置时间较长，耐干燥能力弱的大肠埃希菌因缺水死亡而无法被成功分离，所以本次研究中鸡蛋表面的大肠埃希菌分离率最低，25份样品中仅分离出4株大肠埃希菌。

研究大肠埃希菌对临床常见抗生素的药敏实验结果发现，平均耐药率最高的是磺胺类代表药物甲氧苄啶/磺胺甲噁唑，耐药率为75.36%，其次是四环素，耐药率为72.10%，与其他学者的研究结果差别不大[5，7-10]。但三代头孢类抗生素耐药率地域差异明显，有研究人员发现，广州肉类样品中分离大肠埃希菌对三代头孢类抗生素的耐药率不超过5%[7]、乌鲁木齐肉类样品分离大肠埃希菌对三代头孢类抗生素的平均耐药率不超过8%[8]，山东鸡肉样品中分离大肠埃希菌对头孢噻肟的耐药率为51.7%，猪肉样品中分离大肠埃希菌对头孢噻肟的耐药率为20.4%[10]。本研究中，鸡肉样品中分离出的大肠埃希菌对头孢噻肟和头孢曲松耐药率均为47.26%，对头孢他啶的耐药率为23.81%；猪肉中分离出的大肠埃希菌对头孢噻肟和头孢他啶的耐药率分别为42.85%和17.86%。鸡肉类中分离出的大肠埃希菌对大多数抗生素的耐药率较其他样品高，与上述研究结果一致。禽类养殖密度高、时间短，养殖过程中需要使用大量抗生素防治细菌感染和传播。禽类样品中能分离到更多耐药细菌，分离到的细菌耐药率也更高。养殖场养殖方式和抗生素的使用以及ESBL耐药基因流行情况如何影响细菌三代头孢耐药率的地区差异，有待后续研究跟进。

蔬菜样品中分离出大肠埃希菌可能与被动物粪便污染的土壤和水，处理、售卖过程中，工作人员携带大肠杆菌或被环境中少量目标菌污染有关，蔬菜样品的大肠埃希菌分离率较低，分离获得的大肠埃希菌对临床常见抗生素的耐药率较肉类样品中分离的大肠埃希菌低。

研究结果显示，鸡肉类产ESBL大肠埃希菌的分离率为17.3%、猪肉为12%、蔬菜为4%，与其他研究人员的结果类似[9，11-12]。以上研究数据表明，食品携带ESBL大肠埃希菌、多重耐药菌可能通过食物链传播。

ESBL耐药基因主要有3个类型，TEM、SHV和CTX-M。CTX-M可有效水解头孢噻肟，是目前全球最流行的ESBL基因类型。根据序列同源性差异，CTX-M基因分为CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25 5个大组，超过200种变体或亚型，1组包括CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-15等变体，2组包括CTX-M-2、CTX-M-4、CTX-M-7等变体，9组包括CTX-M-13、CTX-M-14、CTX-M-16等变体[13]。本研究分离到25株ESBL大肠埃希菌，耐药基因均为CTX–M，其中CTX-M-15有9条，CTX-M-14有16条。有研究人员从四川食品动物源分离123株ESBL大肠埃希菌[11]，CTX-M耐药基因占比91.9%，其中CTX-M-55最多，占比40%左右。还有研究发现山东禽畜肉源分离大肠埃希菌ESBL耐药基因以blaCTX-M-9组为主，占比20.4%[10]。以上结果表明食品分离ESBL大肠埃希菌耐药基因变体类型分布存在地域差异。

产ESBL大肠埃希菌是抗生素抗性基因的存储库，是影响人体和畜牧养殖动物健康的危险因子，耐药细菌及其耐药基因通过食物链直接或间接传播是复杂且影响深远的过程[14]。本次研究结果表明，多种食品被ESBL大肠埃希菌污染，其耐药基因以CTX-M为主。食品是助推多重耐药菌在社区扩散的潜在媒介，为降低社区健康人群感染多重耐药菌风险，相关部门需要加强相关检测，以更好地了解和有针对性地控制ESBL细菌在社区传播。

参考文献

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基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目“食源标本分离多重耐药菌及其耐药基因的研究”（2021J1137）。

作者简介：郑月（1979—），女，四川宜宾人，硕士，讲师。研究方向：微生物耐药。

通信作者：蔡鹏（1982—），男，回族，云南保山人，本科，讲师。研究方向：分子遗传学。E-mail：407086943@qq.com。