HPLC法同时检测陕西平利绞股蓝中13种酚酸含量

王珂 周琼 李建科

摘要：为建立同时检测陕西平利绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）中13种酚酸含量的测定方法，采用高效液相色谱法（HPLC），利用甲醇水溶液（80%）常温涡旋，超声波提取，色谱柱为Dimensions C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，P/N： 227-30011-07，C/N：18C03033），流动相为甲醇（100%）和磷酸水溶液（0.5%），洗脱方法为梯度洗脱，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样体积为5 μL。结果表明，13种酚酸在浓度为5～100 mg/L时线性关系良好，相关系数（R2）≥0.998；在样本加标回收试验中，平均加标回收率为61.8%～131.0%。该测定方法精密度、重复性、稳定性好，适用于陕西平利绞股蓝中酚酸含量的测定。

关键词：陕西平利绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）；酚酸；高效液相色谱法（HPLC）；含量

中图分类号：TS272         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0182-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.032            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous detection of 13 phenolic acids in Gynostemma pentaphyllum from Pingli， Shaanxi Province by HPLC

WANG Ke， ZHOU Qiong， LI Jian-ke

（School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University， Ankang  725000，Shaanxi，China）

Abstract： In order to establish a method for simultaneously detecting the content of 13 phenolic acids in Gynostemma pentaphyllum from Pingli， Shaanxi，high performance liquid chromatography （HPLC） was used. Methanol aqueous solution （80%） was used for room temperature vortex and ultrasonic extraction，the chromatographic column was Dimensions C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，P/N： 227-30011-07， C/N： 18C03033）， with a mobile phase of methanol （100%） and phosphoric acid aqueous solution （0.5%）. The elution method was gradient elution， with a detection wavelength of 280 nm， column temperature of 30 ℃， flow rate of 1.0 mL/min， and injection volume of 5 μL. The results showed that there was a good linear relationship among the 13 phenolic acids at concentrations of 5～100 mg/L， with a correlation coefficient （R2） ≥ 0.998； in the sample spiking recovery experiment， the average spiking recovery rate was 61.8%～131.0%. This determination method had good precision， repeatability， and stability， and was suitable for the determination of phenolic acids content in Gynostemma pentaphyllum from Pingli， Shaanxi.

Key words： Gynostemma pentaphyllum from Pingli，Shaanxi； phenolic acid； high performance liquid chromatography （HPLC）； content

收稿日期：2023-03-20

基金项目：陕西省科技厅创新人才推进计划基金项目（2019TD-042；2023AYPT06）

作者简介：王 珂（1999-），男，陕西汉中人，本科生，专业方向为果蔬贮藏与保鲜，（电话）15929597791（电子信箱）wk199955@163.com；

通信作者，周 琼（1971-），女，贵州瓮安人，教授，博士，主要从事植物资源的研发与利用研究，（电话）13992550047

（电子信箱）kanqiongtao@163.com。

王 珂，周 琼，李建科. HPLC法同时检测陕西平利绞股蓝中13种酚酸含量［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：182-186．

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，又名七叶胆［1］。陈武等［2］认为绞股蓝性寒，其药性应属平性偏微温、味甘、微苦，归肺、脾、心、肾经，具备清热解毒、清肺化痰止咳、补气养阴生津、养心安神、固精之效用。在中国秦岭和长江流域以南广大地区分布较广［3，4］。绞股蓝是药食同源类植物资源，有南方人参和第二人参的美誉。

酚酸是指结构中带有酚类基团的有机酸，它是植物中仅次于黄酮类化合物的第二大次生代谢物［5］。近年来，酚酸作为抵抗癌症和心脏病的潜在保护因子，受到学者越来越多的关注，其部分原因是它们潜在的抗氧化活性、抗癌作用、对慢性疾病的保健作用以及在植物源食品中的广泛存在性［6，7］。同时，已有研究表明，酚酸不仅具有抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化及预防心血管疾病的作用，而且还具有抗癌、抗炎症和抗血小板凝聚等功能［8］。关于酚酸检测有较多报道，胡华等［9］建立了利用高效液相色谱法同时测定酱油中8种酚酸的方法；黄小兰等［10］建立了同时测定地笋中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸7种酚酸的高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-PDA）并对不同产地地笋中酚酸成分进行分析评价；陈少洲等［11］、翁芳华等［12］也分别针对向日葵籽和蓝莓酒建立了测定其酚酸含量的方法。综上，针对陕西平利绞股蓝，探究其酚酸类化合物的测定方法及其含量的测定，优化其提取分离工艺，探究其药效物质基础，从而为其进一步地开发利用提供理论依据。

本研究通过对色谱条件（流动相、检测波长、梯度洗脱条件等）进行优化，以期建立同时测定陕西平利绞股蓝中13种酚酸（鞣花酸、水杨酸、肉桂酸等）的一种简单快速准确的分析方法，为陕西平利绞股蓝中酚酸的检测提供技术依据，同时也为绞股蓝功能性成分的研究和绞股蓝资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

绞股蓝为陕西省平利县的陕西平利绞股蓝，中国国家地理标志产品；品种为平利1#、平利2#、平利3#、平利4#。

没食子酸、新绿原酸、绿原酸等对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司，对照品信息如表1所示。

1.2 仪器与设备

LC-2040C PLUS型高效液相色谱仪（日本株式会社岛津制作所）；SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；TDZ5-WS型医用离心机、电热鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；H1650R型离心机［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］；超声波清洗器（昆山力波超声波设备有限公司）；CP224C型万分之一天平（天津瑞泽分析仪器有限公司）；全新气流式超微粉机（上海一恒科技有限公司）；标准分样筛（40目0.45 mm，上海力辰邦西仪器科技有限公司）。

1.3 色谱条件

色谱柱Dimensions C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，P/N： 227-30011-07， C/N： 18C03033）；流动相A为100%甲醇，流动相B为0.5%磷酸水溶液。采用低压梯度洗脱的分离方法，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为5 μL。具体洗脱程序如表2所示。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理 使用万分之一天平准确称量5 g样品，移入50 mL离心管中，加入甲醇水溶液（80%）40 mL，涡旋振荡器涡旋1 min，超声波处理60 min，使样品中酚酸充分溶出，5 000 r/min 离心5 min，将上清液移入10 mL比色管，加入甲醇水溶液（80%）定容至10 mL，过0.22 μm膜，上机检测［13-15］。

1.4.2 对照品储备溶液和混合对照品使用液的配制 使用万分之一天平分别精确称取13种酚酸对照品10.00 mg，用甲醇（100%）溶解并定容至10 mL。此时，每个对照品储备溶液的浓度为1 000 mg/L，为了得到不同浓度的对照品储备溶液，进一步用甲醇（100%）稀释。分别准确吸取1 mL 1 000 mg/L的   13种对照品储备溶液，分别用甲醇（100%）定容至10 mL得到浓度为100 mg/L的对照品储备溶液。分别移取0.5 mL 100 mg/L的各对照品储备溶液，充分混匀，得到浓度为100 mg/L的混合对照品使用液。溶液置于4 ℃冰箱中避光保存。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长 将13种100 mg/L的对照品储备溶液稀释后上机测定，检测波长分别为280 nm和320 nm。通过比较2种波长下的色谱图及出峰情况，发现13种酚酸在检测波长为280 nm时有更好的吸收。

2.1.2 流动相 甲醇水溶液、乙腈水溶液可以作为流动相分离酚酸［16］，但羟基在水溶液中容易发生电离，极性增强，在固定相表面形成双重保留，色谱峰拖尾严重。通过加入少量酸性调节剂可以改善此类情况。酸性调节剂有多种选择，如甲酸、乙酸、磷酸等［9］，在预试验中，选择甲醇-0.5%乙酸水溶液作为流动相，将13种100 mg/L的对照品储备溶液上机检测，得到13种对照品储备溶液的出峰时间。由表3的出峰时间可以判断，以甲醇-0.5%乙酸水溶液作为流动相并不理想。同时，甲醇和乙腈均具有较好分离效果，但乙腈的毒性较大，因此选择甲醇作为有机流动相。综上，本试验以甲醇（100%）作为有机流动相（流动相A），以磷酸（0.5%）作为酸性调节剂（流动相B）。

2.1.3 梯度洗脱 采用等度洗脱的模式，流动相A（100%甲醇）与流动相B（0.5%磷酸水溶液）以1∶1的比例进行洗脱，总时长为1 h，流速为0.3 mL/min，在此模式下，分离度较差，达不到本试验的预期目的。因此将等度洗脱改为梯度洗脱，流速为1 mL/min，通过对13种酚酸色谱（280 nm）（图1）进行分析可知，梯度洗脱程序能很好地将13种酚酸分离，得到较好的色谱图。

2.2 标准曲线的建立

为了准确计算陕西平利绞股蓝样品中酚酸含量，分别取100 mg/L混合对照品使用液适量，用甲醇配制成5个不同浓度的混合对照品使用液，分别为100、50、25、10、5 mg/L，在280 nm波长和梯度洗脱条件下进样检测，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。由表4可知，13种酚酸在浓度为5～100 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（R2）≥0.998。

2.3 精密度试验

取平利3#样品，按照“1.4.1”方法对样品进行前处理，得到上机检测样品溶液，重复进样5次［17］，记录峰面积，同时根据标准曲线计算溶液中酚酸含量，计算相对标准偏差（RSD），如表5所示。结果表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取平利3#样品，按照“1.4.1”方法对样品进行前处理，分别在0、4、8、12、16、24 h进样［13］。计算峰面积、酚酸含量的相对标准偏差（n=6），如表6所示。结果表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

取同一平利3#样品，按照“1.4.1”方法对样品进行前处理，平行5份［18，19］，在波长280 nm和梯度洗脱条件下检测，记录峰面积以及计算酚酸含量，从而计算相对标准偏差（n=5），如表7所示。结果表明该方法重复性良好。

2.6 加标回收试验

根据本试验方法，分别精密称取5份平利3#粉末5 g，按“1.4.1”方法对样品进行前处理，精密加入0.5 mL 100 mg/L的混合对照品使用液，混匀后在280 nm波长和梯度洗脱条件下进行测定，重复进样5次，计算平均加标回收率［20，21］，如表8所示。9种酚酸的平均加标回收率为61.8%～131.0%，表明该方法准确可靠，可用于绞股蓝中酚酸含量的测定。

2.7 样品测定

由表9可知，平利1#叶样品检出8种酚酸，分别为新绿原酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、鞣花酸，总含量为13.440 mg/g，平均含量为1.680 mg/g。平利1#茎样品检出9种酚酸，总含量为13.093 mg/g，平均含量为1.455 mg/g。平利2#叶样品检出6种酚酸，总含量为1.330 mg/g，平均含量为0.222 mg/g。平利2#茎样品检出7种酚酸，总含量11.939为 mg/g，平均含量为1.706 mg/g。平利3#号样品检出9种酚酸，总含量为18.203 mg/g，平均含量为2.023 mg/g。平利4#样品检出7种酚酸，总含量为13.300 mg/g，平均含量为1.900 mg/g。

3 小结

不同品种、不同采集部位的陕西平利绞股蓝中13种酚酸含量存在较大差异，如平利1#叶中鞣花酸含量高达10.56 mg/g，而平利2#叶、平利2#茎、平利3#、平利4#中未检出鞣花酸。本研究建立同时检测陕西平利绞股蓝中13种酚酸含量的高效液相色谱法，以甲醇（100%）和磷酸水溶液（0.5%）作为流动相，该测定方法精密度、重复性、稳定性好，适用于陕西平利绞股蓝中酚酸含量的测定，可以为绞股蓝的进一步开发与利用提供参考。

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