儿童肺炎支原体肺炎肺泡灌洗液CARDSTX、HMGB1、TLR2表达及临床意义

李玉琴 王喆 丁莹 储矗 周卫芳

【摘要】目的研究肺炎支原体肺炎（MPP）患儿肺泡灌洗液中社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（CARDSTX）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）、Toll样受体2（TLR2）表达，探讨其在MPP发病中的临床意义。

方法回顾性分析55例MPP病例组及20例对照组临床资料，同时检测两组支气管肺泡灌洗液（BALF）中CARDSTX、HMGB1、TLR2、TLR4、晚期糖基化终末产物受体（RAGE）及髓样分化因子88（MyD88）表达，体外检测不同浓度CARDSTX刺激下HMGB1、TLR2的表达并进行比较。

结果与对照组相比，MPP组LYM绝对值计数、PA、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+明显下降，CRP、LDH、D-二聚体、IgA、IgG、IgM、CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88均升高，差异有统计学意义（P<0.05或0.001）。CARDSTX刺激后HMGB1、TLR2的表达升高，且呈正相关，差异有统计学意义（P<0.001）。

结论CARDSTX可能通过HMGB1-TLR2-MyD88途径参与肺炎支原体（MP）的致病。

【关键词】肺炎支原体肺炎；社区获得性呼吸窘迫综合征毒素；高迁移率族蛋白1；Toll样受体2；髓样分化因子88

中图分类号：R725.6文献标志码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.05.003

ExpressionandclinicalsignificanceofCARDSTX，HMGB1andTLR2inbronchoalveolarlavagefluidinchildrenwithmycoplasmapneumoniaepneumonia

LIYuqin，WANGZhe，DINGYing，CHUChu，ZHOUWeifang

（DepartmentofInfectiousDiseases，Children'sHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215000，Jiangsu，China）

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofcommunity-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin（CARDSTX），highmobilitygroupbox-1protein（HMGB1）andToll-likereceptors2（TLR2）inbronchoalveolarlavagefluidinchildrenwithmycoplasmapneumoniaepneumonia（MPP），andtoexploretheclinicalsignificanceofCARDSTX，HMGB1andTLR2inthepathogenesisofMPP.

MethodsRetrospectiveanalysiswascarriedoutontheclinicaldataof55MPPchildrenand20childrenincontrolgroup.AndtheexpressionsofCARDSTX，HMGB1，TLR2，TLR4，receptorofadvancedglycationendproducts（RAGE）andmyeloiddifferentiationprimaryresponse88（MyD88）inbronchoalveolarlavagefluid（BALF）ofthetwogroups.Inaddition，theexpressionsofHMGB1andTLR2afterstimulationwithdifferentconcentrationsofCARDSTXinvitroweredetectedandcompared.

ResultsComparedwiththecontrolgroup，LYMabsolutevaluecount，PA，CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD19+，NKcell，andCD19+CD23+weresignificantlydecreased，whileCRP，LDH，D-dimer，IgA，IgG，IgM，CARDSTX，HMGB1，TLR2andMyD88weresignificantlyincreased，anddifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05or0.001）.TheexpressionofHMGB1andTLR2increasedafterCARDSTXstimulation，therewasapositivecorrelationbetweenthem，anddifferencewasstatisticallysignificant（P<0.001）.

ConclusionCARDSTXmaybeinvolvedinthepathogenesisofmycoplasmapneumoniae（MP）throughHMGB1-TLR2-MyD88pathway.

【Keywords】mycoplasmapneumoniaepneumonia（MPP）;community-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin（CARDSTX）;highmobilitygroupbox-1protein（HMGB1）;Toll-likereceptor2（TLR2）;myeloiddifferentiationprimaryresponse88（MyD88）

肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae，MP）可以通过呼吸道飞沫传播及直接接触传播，儿童普遍易感，最终发展为肺炎支原体肺炎（mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP）的概率超过30%，且感染后长期存在，易反复发作。MPP占住院儿童社区获得性肺炎（communityacquiredpneumonia，CAP）的比例超过10%，因此，早期诊断并及时治疗MPP，成为儿科医生急需关注的问题。本研究通过观察MPP患儿的临床特征，以及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）中社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（communityacquiredrespiratorydistresssyndrometoxin，CARDSTX）、高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）及其受体表达量及各指标之间的相关性，探索CARDSTX、HMGB1、Toll样受体2（Toll-likereceptor2，TLR2）在MPP发病中的可能机制，为MPP诊疗提供新的思路。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1研究对象

选取2018年1月至2019年6月期间在苏州大学附属儿童医院住院治疗，确诊为MPP并行支气管镜检查的患儿55例为MPP组［月龄（25.86±14.68）个月，男女比例33/22］，同时选取同期因支气管异物行支气管镜检查的儿童20例作为对照组［月龄（27.89±16.64）个月，男女比例12/8）］。两组性别、月龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2纳入及排除标准

MPP组入选标准：符合MPP诊断标准［1］。排除其他病原体的混合感染，有支气管肺发育不良、免疫缺陷、先天性心脏病等病史及病史资料不完整的病例。对照组入选标准：有异物吸入史，病程小于3天，影像学检查表现为明确的异物征象且未提示炎性改变，最近2个月内无下呼吸道感染。本研究为回顾性研究，通过医院伦理委员会的批准（伦理审批号：2020CS035），且征得研究对象家长的知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集

采集BALF，所有患儿用37℃生理盐水进行灌洗（0.5～1mL/kg，不超过5～10mL/kg），再通过负压将灌洗液吸出，获得的BALF保存于灭菌收集器分别送病原学检测（MP、CP核酸定量检测试剂盒；广州达安基因股份有限公司，病毒快诊试剂盒：DIAGNOSTICHYBRIDSUSA）。BALF标本离心后管底沉淀加入0.5mLTrizol，提取总RNA，RNA逆转录合成cDNA。使用RT-qPCR法检测CARDSTX、HMGB1、TLR2、Toll样受体4（Toll-likereceptor4，TLR4）、晚期糖基化终末产物受体（receptorforadvancedglycationendproduct，RAGE）及髓样分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）表达。采集外周血标本，患儿入院后2h内抽取外周血，进行血常规、生化全套、凝血功能、体液免疫、T淋巴细胞亚群等检测。

1.2.2检测方法

培养THP-1细胞，细胞生长至对数期时，调整细胞密度至1×106/mL，接种于24孔板上，后使用不同CARDSTX（北京义翘神州生物科技股份有限公司上海分公司）（0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）浓度刺激THP-1细胞，收样后离心获取THP-1细胞沉淀，提取总RNA，并逆转录成cDNA，进行RT-qPCR实验，检测不同浓度CARDSTX刺激下HMGB1、TLR2的表达。引物序列顺序见表1。

1.3收集并统计临床资料

收集入组患儿的血常规、生化全套、凝血常规及免疫等实验室检查结果。

1.4统计学方法

运用SPSS24.0软件包进行统计学数据分析。计量资料满足正态分布的，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析，不满足正态分布的，以中位数［M（Q1，Q3）］表示，两组间比较用Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Spearman相关分析，检验水准α=0.05，双侧检验。

2结果

2.1实验室检查比较

MPP组淋巴细胞（lymphocyte，LYM）绝对值计数、前白蛋白（prealbumin，PA）、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+较对照组明显下降，差异有统计学意义（P<0.05或0.001）。C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）、D-二聚体、IgA、IgG、IgM较对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05或0.001）。见表2。

2.2CARDSTX、HMGB1、TLR2、TLR4、RAGE和MyD88表达水平及相关性

MPP组患儿BALF中CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88的相对表达量较对照组升高，差异有统计学意义（P<0.001），两组间TLR4、RAGE的相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。MPP组BALF中CARDSTX的表达量与HMGB1、TLR2及MyD88的表达量呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05）；HMGB1的表达量与TLR2及MyD88的表达量呈正相关，差异有统计学意义（P<0.001）。见表3、表4。

2.3CARDSTX诱导THP-1细胞表达HMGB1、TLR2

不同浓度CARDSTX的刺激下，HMGB1、TLR2的相对表达量经方差分析差异均有统计学意义（P<0.05），在CARDSTX10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL浓度刺激下的HMGB1、TLR2相对表达量均较空白组升高，差异有统计学意义（P<0.001）。见表5。

2.4CARDSTX、HMGB1、TLR2间表达量的相关性分析

CARDSTX与HMGB1、TLR2表达量均呈正相关，差异有统计学意义（P<0.001），CARDSTX刺激THP-1细胞，HMGB1与TLR2表达量呈正相关，差异有统计学意义（P<0.001）。见表6。

3讨论

MP是一种没有细胞壁的微生物，可引起MPP，是引起CAP最常见的非典型病原菌。接受纤维支气管镜治疗的下呼吸道感染患儿中，MP检出率最高［2］。近几年，MPP的发病率呈上升趋势，且发展迅猛，病程长，易耐药，还可能进展为难治性肺炎支原体肺炎（refractorymycoplasmapneumoniaepneumonia，RMPP）甚至引起皮肤损害、胃肠道功能紊乱、中枢神经系统损害及心血管系统病变等肺外组织改变，严重影响儿童的生活质量及生命健康。

MP感染促进机体细胞因子及炎症因子的高表达，过度的炎症反应可能导致淋巴细胞的快速凋亡以及脏器损害，从而使血循环表现为白细胞、中性粒细胞升高，淋巴细胞降低［3］，并引起CRP、LDH升高，PA下降。有研究表明［4］，LDH可以作为评估MPP病情严重程度及是否需要使用全身糖皮质激素治疗的参考指标之一。D-二聚体是反映机体凝血功能的特异性指标，其增高反映了机体的高凝和纤溶状态［5］。MPP患者中普遍存在D-二聚体水平的升高［6］，D-二聚体水平与病情密切相关，D-二聚体升高，MPP患儿病情加重。

MP引起的免疫反应是MP致病的重要原因，本研究中，MP感染后机体CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+水平下调，表明MP感染后机体免疫功能下降，免疫调节功能失衡，从而增加了机体对MP的易感性及抑制了MP的清除［7］。研究表明［8］，MP抗原与人体组织存在相似的抗原成分，可选择性激活B细胞，产生特异性或非特异性的IgA、IgM、IgG，使体内免疫蛋白增高从而产生免疫效应，并可以产生自身抗体，最终导致多系统免疫损伤。这与我们研究中MPP组IgA、IgM、IgG升高的结果一致。

CARDSTX是MP产生的唯一外毒素，可以通过表面活性剂蛋白A和膜联蛋白A2与气道上皮细胞结合发挥ADP-核糖基化活性及空泡活性，诱导炎症反应，在MP发病中发挥作用。CARDSTX可模拟类似于MP感染后的病理改变，可引起感染小鼠纤毛停滞、空泡化、核固缩和炎症因子释放等改变［9］。并且CARDSTX浓度与MP感染的小鼠肺组织病理学评分呈正相关［10］。MP感染的小鼠肺泡灌洗液中CARDSTX的浓度与MP基因表达量及小鼠肺部疾病的严重程度呈正相关［11］。MPP的CARDSTX表达量越高，患儿临床症状越重，发热热程及住院天数越长，并且更易形成胸腔积液及支气管黏液栓，更易发生肺外并发症，是提示RMPP的重要指标［12］。同时，阻断CARDSTX可以减轻MPP的严重程度［13］。可以推测CARDSTX可能是MP致病过程中的主要毒素。

HMGB1是一种具有促炎效应的细胞因子，可由坏死细胞被动分泌以及单核细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞主动分泌，可与TLR2、TLR4或RAGE受体结合激活MyD88依赖性信号通路引起炎症因子IL-1、IL-6等的大量释放，促进炎症反应，从而在败血症、关节炎、肺炎等炎症性疾病的致病过程中发挥重要作用。MP-DNA阳性的大叶性肺炎患儿肺泡灌洗液HMGB1表达升高，且HMGB1与疾病严重程度呈正相关［14］。MPP患儿外周血HMGB1表达随着疾病严重程度升高，恢复期明显下降［15］。表明HMGB1在MPP的发生发展中发挥一定的作用。TLR2-MyD88信号通路是肺部感染中一条重要的炎性调控通路。通过对实验小鼠鼻内接种MP发现，巨噬细胞表面的TLR，尤其是TLR2，可以通过识别MP特异性抗原，激活MyD88-核因子-B（nuclearfactor-B，NF-B）信号通路，从而将入侵肺部的MP清除，表明TLR-MyD88-NF-B通路参与了MP感染后肺部MP的清除过程［16］。本研究中MPP患儿BALF中CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88相对表达量明显高于对照组，且CARDSTX、HMGB1与TLR2、MyD88的表达量呈正相关，进一步体外利用不同浓度的CARDSTX刺激THP-1细胞，发现HMGB1与TLR2的表达量呈正相关，均随CARDSTX浓度的增加而增加，提示MP可能通过CARDSTX介导机体细胞损伤刺激HMGB1的释放，进而通过HMGB1-TLR2-MyD88途径参与MPP的发病。

综上所述，MP感染后存在炎症因子的过度激活、淋巴细胞再分配、血液高凝及免疫功能紊乱，进一步研究发现，MP感染后，可能通过CARDSTX刺激HMGB1的释放，从而经TLR2-MyD88途径激活下游的信号通路，发生免疫炎症反应，为MP致病机制的研究及临床诊断、治疗提供一定的帮助。但本研究仅涉及体外细胞培养，未通过动物实验验证，且样本量相对较小，体外不同浓度CARDSTX刺激THP-1细胞后未检测MyD88表达，后期仍需更大样本量及进一步基础实验验证。

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