基于差分脉冲伏安法快速检测花椒油树脂中的麻味物质

白春晖 蒋茜 赵志峰 谷学权 幸勇 莫小燕 何强

摘要：麻味物质含量是花椒油树脂的重要品质指标，文章基于电化学原理中的差分脉冲伏安法首次建立了一种采用未修饰的丝网印刷电极测定花椒油树脂中麻味物质的快速检测方法，通过优化电化学工作站中的富集时间、电压以及待测液中的甲醇占比、pH值，并以紫外分光光度计检测法为对照构建出了该方法。结果表明，以未修饰的丝网印刷电极检测花椒油树脂中麻味物质的适宜条件：富集时间为120 s，富集电压为0.2 V，甲醇在待测液中占比小于5%，pH值为1，2，3，山椒素的电流值与其浓度在2～50 mg/L范围内呈良好的线性关系（R²=0.999），加标回收率在97.60%～108.40%之间，检出限为0.22 mg/L。经验证，该方法与行业标准GH/T 1290—2020方法具有良好的检测一致性（RSD=4.75%），建立的快速检测方法既具有操作简单、方便快速的优点，又兼具传统方法的准确性与重复性，因此可以作为花椒及其制品中麻味物质的快速检测方法进行科学研究与企业生产实践，且有望基于该方法开发出便携式麻味物质快速检测仪器。

关键词：花椒；山椒素；差分脉冲伏安法（DPV）；丝网印刷电极；紫外分光光度法

中图分类号：TS225.1

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0162-06

Rapid Detection of Numb-Taste Substances in Zanthoxylum bungeanum

Oleoresin Based on Differential Pulse Voltammetry

BAI Chun-hui¹， JIANG Xi¹， ZHAO Zhi-feng¹， GU Xue-quan²，

XING Yong²， MO Xiao-yan²， HE Qiang^1*

（1.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2.Sichuan Wufeng Lihong Food Co.， Ltd.， Ya'an 625302， China）

Abstract： The content of numb-taste substances is an important quality index of Zanthoxylum bungeanum oleoresin. Based on differential pulse voltammetry in electrochemistry principles， a rapid detection method for the determination of numb-taste substances in Zanthoxylum bungeanum oleoresin with unmodified screen-printed electrode is established for the first time. By optimizing the enrichment time， voltage in the electrochemical workstation， the proportion of methanol in the tested solution and pH value， the method is constructed with ultraviolet spectrophotometer detection method as the control. The results show that the optimum conditions for the detection of numb-taste substances in Zanthoxylum bungeanum oleoresin with unmodified screen-printed electrode are as follows： enrichment time is 120 s， enrichment voltage is 0.2 V， the proportion of methanol in the tested solution is less than 5% and pH value is 1， 2， 3， the current value of sanshool shows a good linear relationship with its concentration in the range of 2～50 mg/L （R²=0.999）， the spiked recovery rates are 97.60%～108.40% and the limit of detection is 0.22 mg/L. It is verified that this method has good detection consistency with the industry standard GH/T 1290—2020 method （RSD=4.75%）. The established rapid detection method not only has the advantages  of simple， convenient and fast operation， but also has the accuracy and repeatability of the traditional method. Therefore， it can be used as a rapid detection method of numb-taste substances in Zanthoxylum bungeanum and its products for scientific research and enterprise production practice， and it is expected to develop a portable rapid detection instrument of numb-taste substances based on this method.

Key words： Zanthoxylum bungeanum; sanshool; differential pulse voltammetry （DPV）; screen-printed electrode; ultraviolet spetrophotometry

收稿日期：2024-01-05

作者简介：白春晖（1999—），男，硕士，研究方向：健康食品工程。

*通信作者：何强（1971—），男，教授，博士后，研究方向：农产品加工及质量安全。

花椒（Zanthoxylum bungeanum）系芸香科花椒属植物，花椒油树脂是通过萃取工艺制得的具有高浓缩风味物质的半固态萃取物，目前作为椒麻味香精香料已经广泛应用于食品行业中^[1]。在花椒领域，以花椒油树脂为代表的花椒制品中麻味物质的检测方法主要有GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工产品 花椒酰胺总含量的测定 紫外分光光度法》、GH/T 1291—2020《花椒及花椒加工产品 花椒酰胺总含量的测定 高效液相色谱法》^[2-3]。然而，紫外分光光度法和高效液相色谱法因所需要的仪器设备价格较高且操作相对复杂、人员需要培训等而无法满足中小型企业的实际需求。为解决大型仪器的检测弊端，近年来电化学方法因具有操作简单、检测效率高、稳定性好等优点而被广泛应用于各类物质的快速检测^[4]。例如关于使用电化学方法检测辣椒中辣椒素的文章已经被大量报道^[5]。陆超群等^[6]研究了使用玻碳电极检测辣椒素时，辣椒素的电流值与其浓度在5～80μmol/L范围内呈较好的线性关系，检测限为2.30μmol/L；Sun等^[7]使用玻碳电极通过电化学方法对花椒中山椒素进行检测，结果表明基于电化学原理新构建的检测方法与传统方法具有良好的一致性，同时新方法具有操作简单、不需要大型仪器等优点。而在已经建立的多种电化学方法中，起到传感作用的电极材料是其核心配件，与广泛使用的玻碳电极相比，丝网印刷电极（screen-printed electrode）是一类灵敏度高、性能稳定、体积小、易携带、成本相对较高的新一代电极片，是目前最有潜力开发成快速检测仪器的关键配件^[8]。Jiménez等^[9]研究表明使用未修饰的丝网印刷电极检测辣椒素时，辣椒素的电流值与其浓度在4.7～150.3μmol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.4μmol/L。然而，在花椒及其制品中麻味物质的定量检测中，还未见基于丝网印刷电极进行电化学快速检测方法开发的文献报道。

因此，本研究采用未修饰的丝网印刷电极，基于差分脉冲伏安法建立了一种定量测定花椒油树脂中麻味物质的方法，以6种商品化花椒油树脂的实证数据与行业标准GH/T 1290—2020方法相比较，证明该方法具有操作简单、方便快速、准确性与重复性良好、检测限低的优点。本文为花椒及其制品中麻味物质含量的检测提供了一种新的便捷、快速的现场检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验原料

花椒油树脂：由四川五丰黎红食品有限公司提供。

1.1.2 主要试剂

羟基-α-山椒素（纯度≥98.00%）：成都麦德生科技有限公司；甲醇（色谱纯）、盐酸（分析纯）等其他化学品：成都市科隆化学品有限公司。

1.1.3 主要仪器与耗材

UV-1900I型紫外分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；PalmSens4便携式电化学工作站 雷迪美特（中国）有限公司；No.TE100-SB Three Electrode SPE（丝网印刷电极） 禅谱科技股份有限公司；PHS-3电子精密 pH 计 上海雷磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 电化学待测液的制备

花椒油树脂提取液的制备：参考蒲升惠等^[10]的方法并加以修改，称取0.2 g花椒油树脂于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇后超声处理30 min，超声后将混合物全部转移到100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，即得提取液。

电化学待测液的制备：用移液枪准确移取0～0.5 mL提取液于10 mL容量瓶中，使用pH为1的盐酸作为缓冲液定容至刻度线，摇匀，即得电化学待测液。

1.2.2 电化学测定过程

按照图1中流程，以羟基-α-山椒素标准品为溶质，制备麻味物质浓度为20 mg/L的电化学待测液，甲醇占比为5%，以pH为1的盐酸溶液作为缓冲液。测定前，将丝网印刷电极片连接在电化学工作站上，用移液枪移取200μL电化学待测液，将其准确滴加在未修饰的丝网印刷电极片中心，设置实验参数后，即可开始测定。

1.2.3 电化学测定条件的优化

1.2.3.1 富集时间和富集电压的优化

在实验过程中，待测液与丝网印刷电极接触时间的长短会影响最终所测电流值的大小，而电流值的大小对于检测限和检测范围的影响较大^[11]。因此，选择麻味物质含量为20 mg/L的电化学待测液，甲醇占比为5%，pH值为1，采用DPV法研究了富集电压均为0 V、富集时间分别为0，30，60，90，120，150，180 s对未修饰的丝网印刷电极测定麻味物质的影响，以及富集时间均为120 s、富集电压分别为－0.3，－0.2，－0.1，0，0.1，0.2，0.3 V对未修饰的丝网印刷电极测定麻味物质的影响。

1.2.3.2 甲醇占比的优化

电化学实验中的待测液主要由麻味物质提取液与盐酸溶液混合制成，麻味物质提取液的主要成分为甲醇，过多的甲醇占比会影响待测液的pH值，从而影响待测液中麻味物质含量的检测^[7]。因此，需要控制甲醇在待测液中的占比。

选择麻味物质浓度为20 mg/L的电化学待测液，甲醇占比为5%，以pH为1的盐酸溶液作为缓冲液，采用DPV法研究了甲醇在待测液中占比分别为1%、2%、3%、4%、5%对未修饰的丝网印刷电极测定麻味物质的影响。

1.2.3.3 缓冲液pH的优化

麻味物质的氧化峰电流与配制待测液的盐酸溶液的pH值密切相关^[12]。选择麻味物质浓度为20 mg/L的电化学待测液，甲醇占比为5%，采用DPV法研究了缓冲液pH值分别为1，2，3，4，5，6，7对未修饰的丝网印刷电极测定麻味物质的影响。

1.2.4 电化学检测方法的构建

1.2.4.1 确定电化学检测标准曲线与检测限

将羟基-α-山椒素标准品配制成浓度为1 000 mg/L的母液，分别移取0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL至10 mL容量瓶中，再用pH为1的盐酸溶液定容至刻度线，得到麻味物质浓度分别为2，5，10，20，30，40，50 mg/L的电化学待测液。采用差分脉冲伏安法（DPV）测定山椒素氧化峰电流值，以麻味物质浓度为横坐标、氧化峰电流值为纵坐标绘制麻味物质的电化学检测标准曲线，通过标准曲线的斜率（k）和空白样测定的标准偏差（standard deviation，SD）计算得出检出限（LOD=3SD/k）。

1.2.4.2 加标回收率的测定

取已知麻味物质含量的样品12份，分别加入等体积不同浓度（2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L）的羟基-α-山椒素标准溶液，每个浓度制备3个平行样品，采用DPV法检测3次。将测得的响应电流值代入标准曲线中，计算得出麻味物质含量和加标回收率。加标回收率按照公式（1）进行计算：

加标回收率（%）=实际测得的山椒素浓度（mg/L）-本底值（mg/L）加入的山椒素浓度（mg/L）×100%。（1）

1.2.5 紫外分光光度法测定麻味物质

紫外分光光度法标准曲线的构建：配制质量浓度分别为0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L的羟基-α-山椒素标准溶液，采用紫外分光光度法对各浓度标准溶液进行测定。以山椒素浓度为横坐标、溶液在270 nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

花椒油树脂的检测：参考GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工产品 花椒酰胺总含量的测定 紫外分光光度法》中的方法^[2]，精密称取0.2 g花椒油树脂样品置于具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇，超声萃取0.5 h，冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，经0.22μm滤膜过滤后于270 nm波长处测定吸光度。

1.3 统计分析

文中涉及实验的结果均测定3次，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析进行显著性差异分析，P＜0.05表明具有显著性，利用Origin 2021软件绘制实验数据图。

2 结果与分析

2.1 氧化还原电位的确定

由于循环伏安法（CV）操作简单且耗时短，因此基于该方法在未富集的条件下研究了丝网印刷电极上山椒素的电化学行为。确定羟基-α-山椒素的还原电位，以此确定实验的检测范围。而差分脉冲伏安法（DPV）较循环伏安法（CV）更灵敏，因此基于该方法进行山椒素中麻味物质的定量检测。CV模式下的扫描条件：电位范围0.6～1.2 V，扫描速度0.1 V/s。DPV模式下的扫描条件：电位范围0.6～1.2 V，阶跃电位0.005 V，脉冲电位0.05 V，脉冲时间0.02 s，扫描速度0.05 V/s。

20 mg/L的电化学待测液在循环伏安法和差分脉冲伏安法下的实验结果见图2。

由图2中a可知，在循环伏安法（CV）的检测过程中，羟基-α-山椒素在0.927 V处显示出明显的氧化，且阳极峰不可逆。由图2中b可知，在差分脉冲伏安法（DPV）的检测过程中，羟基-α-山椒素在0.872 V处显示出明显的氧化。两种电化学方法的检测结果类似，均表明羟基-α-山椒素的出峰范围在0.8～1.0 V附近。因此，确定在两种模式下麻味物质的检测范围为0.6～1.2 V。

2.2 富集时间和富集电压的优化

富集时间的长短和富集电压的大小对麻味物质检测的灵敏度具有一定的影响^[13]。不同的富集时间和富集电压对DPV法测定的山椒素的影响见图3。DPV法测定麻味物质检测实验固定参数设置：扫描电位范围0.6～1.2 V，阶跃电位0.005 V，脉冲电位0.05 V，脉冲时间0.02 s，扫描速度 0.05 V/s。图3中a的富集电压为0 V，图3中b的富集时间为0 s。

由图3中a可知，当富集时间为0～120 s时，实验产生的电流值先随着富集时间的增加而增大，当富集时间达到120 s时，实验产生的电流值最大，当富集时间超过120 s后，实验产生的电流值随着富集时间的增加而减小。由图3中b可知，当富集电压为 －0.3～－0.1 V时，实验产生的电流值先随着富集电压的升高而增大，当富集电压为0 V时，实验产生的电流值最小。当富集电压为0～0.3 V时，实验产生的电流值随着富集电压的升高呈现先增大后减小的趋势，当富集电压为0.2 V时，实验产生的电流值最大。因此，选择富集时间120 s、富集电压0.2 V作为适宜的测定条件。

2.3 甲醇占比的确定

待测液中甲醇占比不同对DPV 法测定山椒素的影响见表1。

由表1可知，当甲醇占比小于5%时，平行测定的同一花椒油树脂（21.48 mg/g）的氧化峰电流值的RSD为2.10%，此时测定具有较好的稳定性。因此，选择甲醇在待测液中占比小于5%作为适宜的测定条件。

2.4 pH值的优化

由图4中a和b可知，当 pH值为1，2，3时，山椒素的检测电流值处于较高的水平。当pH值为2～7时，检测到的电流值逐渐降低，这与pH值对玻碳电极测定山椒素的影响一致^[7]。因此，pH值为1，2，3可以视为较优的实验条件，用于后续研究。

2.5 电化学标准曲线和检出限的测定

图5 麻味物质的电化学标准曲线

Fig.5 Electrochemical standard curve of numb-taste substances

为了实现在电化学方法中定量检测花椒油树脂中麻味物质的含量，通过上述实验，确定了实验条件的最佳范围。在优化后的检测条件下，研究了氧化峰电流值与羟基-α-山椒素标准溶液浓度之间的关系。由图5可知，羟基-α-山椒素的氧化峰电流值y与其浓度x在2～50 mg/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=0.121 88x－0.163 08（R²=0.999）。根据标准曲线的斜率（k）和空白样测定的标准偏差（standard deviation，SD），求得其检测限（LOD=3SD/k）为0.22 mg/L。

2.6 方法加标回收率的测定

由表2可知，2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L 4个不同浓度的麻味物质样品的加标回收率在97.60%～108.40%之间。结果表明，通过未修饰的丝网印刷电极测定麻味物质的结果准确可靠，可以应用于花椒及其制品中麻味物质含量的检测。

2.7 电化学方法与行业标准方法的结果比较

为了验证电化学检测中DPV法的准确性，依据GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工产品 花椒酰胺总含量的测定 紫外分光光度法》建立了标准曲线，见图6。

由图6可知，线性方程为y=0.234 8x+0.053 87（R²=0.999）。其中吸光度值y与羟基-α-山椒素标准溶液浓度x在0～3.0 mg/L范围内呈良好的线性关系。6种商品化花椒油树脂的电化学检测方法和紫外分光光度法测定结果见表3。

由表3和图7中a、b可知，6种花椒油树脂的电化学测定结果与紫外分光光度法测定结果基本一致，图7中a曲线A的斜率为1.002 04，体现了检测的一致性。同时分析了两种方法所测得的6个实际样品的RSD在0.54%～4.75%之间（<5%），证明本文建立的基于DPV模式采用未修饰的丝网印刷电极的电化学快速检测方法具有较高的准确性，可以作为传统检测方法的一种新型替代法，能够证明电化学法可以用于花椒及其制品中麻味物质含量的实际检测。

3 结论

本文将未修饰的丝网印刷电极应用于麻味物质的测定，并对测定条件进行了优化，建立了一种快速检测花椒及其制品中麻味物质含量的电化学检测方法。该方法检测花椒油树脂中麻味物质含量的适宜条件：在0.6～1.2 V下进行检测，富集时间为120 s，富集电压为0.2 V，甲醇在待测液中的占比小于5%，缓冲液的pH值为1，2，3。麻味物质的电流值与其浓度在2～50 mg/L范围内呈良好的线性关系，具有较好的检出限、稳定性和加标回收率。此外，与标准方法中的紫外分光光度法进行对比，该方法具有良好的检测一致性。因此，该方法可代替行业标准中的紫外分光光度法对麻味物质进行定量检测，具有操作简单、成本低廉、检测效率高等优点。未来结合新的电极修饰手段将是该研究领域的趋势。

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