葛仙米多糖提取物对模型体系中PhIP抑制效果研究

于迪 李优优 姜东华 孔繁磊 皮亦华

摘要：高蛋白肉制品在热处理中容易生成稠环芳烃杂环胺，其中PhIP（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine）是日常家庭烹饪中含量较高且有致癌风险的一种极性杂环胺。葛仙米为我国一种珍贵的野生蓝藻生物，是含有多种活性物质的一种新食品原料。该实验在苯丙氨酸和肌酐为前体物质的模型体系中，分别加入0，30，50，100，150μg的葛仙米多糖提取物进行反应，利用UPLC-MS/MS对模型体系中反应前体物质苯丙氨酸和肌酐、中间产物苯乙醛及产物PhIP进行鉴定并监测含量变化，实验结果表明，葛仙米多糖提取物能较好地抑制杂环胺PhIP的生成，模型体系中苯丙氨酸、肌酐和苯乙醛含量均呈现先减少后增多的趋势。在葛仙米多糖提取物添加量为50μg时，对模型反应体系中PhIP的抑制效果最好，抑制率为84.9%。推测葛仙米多糖提取物作用机制是通过抑制苯丙氨酸降解生成苯乙醛，阻碍其与肌酐发生反应，最终抑制PhIP的生成。该研究为利用葛仙米多糖提取物抑制食品热加工中PhIP的生成奠定了理论基础，有利于进一步开发具有葛仙米特殊风味的功能性调味品，为调味品产业发展提供了新的思路。

关键词：葛仙米多糖提取物；苯丙氨酸；肌酐；苯乙醛；PhIP；抑制机制

中图分类号：TS201.2

文献标志码：A

文章编号：1000-9973（2024）06-0009-06

Study on Inhibitory Effect of Nostoc sphaeroides Polysaccharide

Extracts on PhIP in Model System

YU Di ^1，2， LI You-you¹， JIANG Dong-hua¹， KONG Fan-lei¹， PI Yi-hua^2*

（1.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200， China;

2.Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-incidence

Infectious Diseases with Integrative Medicine， Nanning 530200， China）

Abstract： High-protein meat products are prone to generate polycyclic aromatic heterocyclic amines during heat treatment， among which， PhIP （2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine） is a polar heterocyclic amine with high content in daily home cooking and a risk of cancer. Nostoc sphaeroides is a type of precious wild cyanobacteria in China， which is a new food raw material containing many kinds of active substances. In this experiment， 0， 30， 50， 100， 150μg Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts are added into the model system with phenylalanine and creatinine as the precursor substances for reaction. UPLC-MS/MS is used to identify the precursor substances for reaction such as phenylalanine and creatinine， the intermediate product phenylacetaldehyde and the product PhIP in the model system and monitor the content changes. The results show that Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts could inhibit the generation of heterocyclic amine PhIP， and the content of phenylalanine， creatinine and phenylacetaldehyde in the model system decreases firstly and then increases. The inhibition effect on PhIP in the model reaction system is the best when the addition amount of Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts is 50μg， with the inhibition rate is speculated that the mechanism of Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts is inhibiting the degradation of phenylalanine to produce phenylacetaldehyde， hindering its reaction with creatinine， and finally inhibiting the generation of PhIP. This study has laid a theoretical foundation for inhibiting the generation of PhIP in heat treatment of food by Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts， which is conducive to further developing functional condiments with special flavor of Nostoc sphaeroides， and has provided a new idea for the development of condiment industry.

Key words： Nostoc sphaeroides polysaccharide extracts; phenylalanine; creatinine; phenylacetaldehyde; PhIP; inhibitory mechanism

收稿日期：2023-11-21

基金项目：国家自然科学基金（32060576）；广西中医药大学“桂派杏林青年英才”（2022C026）；广西中医药大学校级科研课题（2023MS013）；广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室开发课题（KJT20007）；广西中医药大学‘桂派中医药传承创新团队资助项目：农作物废弃物药用研究创新团队（2022A005）

作者简介：于迪（1982—），男，副教授，博士，研究方向：食品质量与安全。

*通信作者：皮亦华（1977—），女，讲师，硕士，研究方向：食品质量与安全。 of 84.9%. It

肉类富含蛋白质且味道鲜美，是人体获取多种营养元素的重要来源之一，然而在高温加工过程中肉类独特风味形成的同时会通过美拉德反应与自由基反应等形成一些致癌、致畸的有害物质如杂环胺（heterocyclic amines，HAs）^[1-3]。在家庭烹饪中含量最高的一种杂环胺是PhIP（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine），基于不同类型杂环胺的致癌性，国际癌症研究机构将PhIP划分为2B类潜在致癌物^[4]。已有研究发现，PhIP会诱发机体突变，提高乳癌和大肠癌的发病率，同时随着PhIP摄入量的增加，患癌几率增高，在摄入杂环胺而致癌的风险中，有半数是由PhIP引起的，对人体健康造成极大的威胁^[5-7]。

目前抑制PhIP的形成有很多途径，在自身加工方面，选择合适的加工方法、合理控制加工的温度和时间等可以一定程度上抑制PhIP的生成。Gibis等^[8]在煎烤猪肉片时发现温度控制在150～170 ℃比在200～220 ℃条件下生成的杂环胺含量减少一半。赵电波等^[9]对比发现卤煮-油炸工艺使杂环胺的种类和生成量增加。添加外源性成分也是抑制PhIP的常用方法，在抑制PhIP形成的基础上能改善肉制品的风味。此外，抑制PhIP形成的方法还有外源性添加剂，例如香辛料、植物提取物和抗氧化剂等。研究表明，黑胡椒粉能够降低鱼肉制品中杂环胺的生成^[10]。余甘子提取物对模型反应体系中PhIP有良好的抑制效果，含量达到8.0 mg/mL时，抑制率可达83.1%^[11]。Rounds等^[12]将苹果皮、洋葱、辣椒和孜然等天然植物提取物加入到牛肉饼中，发现这些植物提取物都非常有效地抑制了PhIP的生成。

2002年，Zochling等^[13]发现苯乙醛作为中间体与苯丙氨酸、肌酐等前体物质和PhIP共同存在于模拟体系和烤肉等肉制品中。经Strecker降解反应后，苯丙氨酸分解产生苯乙醛，苯乙醛与肌酐经羟醛缩合反应生成丁间醇醛，再经一系列反应最后生成PhIP^[14]。

葛仙米（Nostoc sphaeroides）属于蓝藻门（Cyanophyta）、蓝藻纲（Cyanophyceae）的拟球状念珠藻，俗称天仙米、天仙菜、水木耳等，学名为球状念珠藻（Nostoc sphaeroides Kützing），是我国一种传统且珍贵的药食两用蓝藻^[15-16]。葛仙米性寒，具有清热、益气、明目等功效，主治夜盲症、脱肛；外用可治烧烫伤^[17]。葛仙米营养成分丰富，含有蛋白质、氨基酸、多糖、脂肪酸、多种维生素、矿质元素等营养物质^[18-19]，其中多糖有一定的生物活性，添加植物多糖可以改变肉类的品质特性，并抑制杂环胺的生成^[20]。研究表明葛仙米多糖主要为葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖，具有较强的抗补体活性，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗高脂血症和抗动脉粥样硬化等作用^[21-24]。葛仙米口感脆嫩、味道清甜，将其开发成健康的特殊风味调味品，不仅利于丰富调味品的种类，而且为调味品产业发展提供了新的思路。

本文参考于迪^[25]的研究，将苯丙氨酸与肌酐作为合成PhIP模型的反应前体物质。将不同含量的葛仙米多糖提取物加入肌酐与苯丙氨酸构成的模型体系中反应，利用液质联用仪监测葛仙米多糖提取物含量对反应物、中间产物和生成物杂环胺PhIP的影响，为后期推测PhIP的反应抑制机理研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛仙米：中南林业科技大学合作实验室；甲醇（质谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；肌酐、L-苯丙氨酸（均为分析纯，99%）：阿拉丁生化科技有限公司；PhIP标准品（分析纯，98%）、苯乙醛（分析纯，95%）、甲酸（质谱纯，≥99%）、邻苯二胺（分析纯，98%）：麦克林生化科技有限公司；乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

FA1204分析天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-S6恒温水浴锅巩义市予华仪器有限责任公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海煜南仪器有限公司；TG16WS台式高速离心机 湖南迈达仪器有限公司；BPMJ-250F霉菌培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Agilent 1290 Infinity Ⅱ-6470超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪 安捷伦科技（中国）有限公司；不锈钢反应釜、聚四氟乙烯反应管广西中医药大学食品质量与安全实验室自制。

1.3 实验方法

1.3.1 葛仙米多糖的提取、分离与纯化

称取20 g葛仙米干粉于烧杯中，加入600 mL水，放入90 ℃恒温水浴锅中加热3 h，将提取液高速离心15 min。按以上步骤，反复提取2次，取上清液并混合。在上清液中添加3倍体积的95%乙醇后，高速离心15 min。取下层沉淀用水溶解后，使用截留分子量为3 500 Da的透析袋进行透析。将多糖溶液减压浓缩后冷冻干燥，即得到葛仙米多糖提取物，得率为16.6%。

1.3.2 模型体系的制备

空白组PhIP模型体系的制备：分别精密称取0.6 mmol苯丙氨酸和0.6 mmol肌酐于烧杯中，加入去离子水10 mL，超声使其充分溶解后，倒入聚四氟乙烯反应管中，将反应管装入特制反应釜中，充分密封后在180 ℃下反应。3 h后取出并立即冰水浴降温，用可调式混匀仪进行充分摇匀，获得空白模型反应液。取1 mL反应液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，得到的溶液在低温下进行贮存。

对照组PhIP-葛仙米多糖提取物模型体系的制备：分别精密称取4份0.6 mmol苯丙氨酸和0.6 mmol肌酐，分别加入30，50，100，150 g葛仙米多糖提取物，加入10 mL去离子水，置于聚四氟乙烯反应管中，再将反应管装入不锈钢反应釜中，充分密封，在180 ℃下反应3 h。取出并冰水浴降温后，用可调式混匀仪进行充分摇匀，获得模型反应液。取1 mL反应液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm 的微孔滤膜进行过滤，得到的溶液在低温下进行贮存。

1.3.3 苯乙醛衍生反应液的制备

准确称取1 mg邻苯二胺，加入1 mL PBS缓冲溶液，制成浓度为1 mg/mL的邻苯二胺溶液。取1 mL邻苯二胺溶液，加入1 mL苯乙醛，放置在25 ℃培养箱中衍生12 h，使其生成苯并咪唑（2-PB）。取1 mL该溶液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，得到的溶液在低温下进行贮存。

取1 mL模型体系反应液，加入1 mg/mL邻苯二胺1 mL，混匀后放置在25 ℃培养箱中衍生12 h，生成苯并咪唑（2-PB）。取1 mL反应液用水定容至10 mL容量瓶中，用0.22μm注射器式过滤器过滤，将所得溶液置于低温下保存。

1.3.4 色谱条件

Welch Ultimate UHPLC AQ-C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；进样量3μL；柱温（25±5.0） ℃；流速0.25 mL/min；流动相A为甲醇，流动相 B为0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0～1 min 5% A，1～3 min 5%～30% A，3～9 min 30%～100% A，9～10 min 100% A，10～13 min 100%～5% A。

1.3.5 质谱条件

电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）；质量扫描范围（m/z）：10～500 amu；离子源温度300 ℃；喷雾电压500 V；鞘气温度300 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压3 500 V。

2 结果与分析

采用超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），以模型体系中的前体物质苯丙氨酸和肌酐、中间产物苯乙醛及产物 PhIP为研究对象，进行定性与定量分析。

2.1 模型体系中成分定性分析

由图1可知，苯丙氨酸标准品的保留时间为3.8 min，模型体系中在保留时间为3.8 min时出现一个单峰（见图2）。以10 eV的碰撞能将模型体系中该峰对应的物质击碎，由图3可知，在正离子模式下母离子m/z=166与二级碎片离子m/z=120，103，可定性该物质为苯丙氨酸。

由图4可知，肌酐标准品的保留时间为1.2 min，模型体系中在保留时间为1.2 min时出现一个单峰。以20 eV碰撞能将模型体系中该峰对应的物质击碎，由图5可知，在正离子模式下母离子m/z=114与二级碎片离子m/z=86，72，可定性该物质为肌酐。

由图6可知，PhIP标准品的保留时间为5.8 min，模型体系中在保留时间为5.8 min时出现一个单峰（见图7）。以40 eV碰撞能将模型体系中该峰对应的物质击碎，由图8可知，在正离子模式下母离子m/z=225与二级碎片离子m/z=210，183，与文献[20]的结果一致，可定性该物质为PhIP。

首先测定苯乙醛与邻苯二胺溶液生成的2-PB，确定反应体系中衍生后该物质的保留时间。由图9可知，2-PB的保留时间为5.7 min，在多反应监测模式下发现模型体系中在保留时间为5.7 min时出现一个单峰。以30 eV碰撞能将模型体系中该峰对应的物质击碎，由图10可知，在正离子模式下母离子m/z=209与二级碎片离子m/z=131，91，与文献[20]的结果一致，可定性该物质为2-PB。

2.2 模型体系中成分定量分析

通过苯丙氨酸-肌酐-葛仙米多糖提取物模型反应体系发现，反应模型中的前体物质都随着葛仙米多糖提取物添加量的增加先减少后增多，添加量达100μg后都缓慢减少但是都比空白模型含量高。由图11可知，苯丙氨酸含量先缓慢减少，当葛仙米多糖提取物添加量达到50μg时，苯丙氨酸含量达最低后急剧增多，100μg时苯丙氨酸含量最高，且超过未添加葛仙米多糖提取物的空白模型中苯丙氨酸的含量，此后苯丙氨酸含量缓慢减少。由图12可知，肌酐与苯丙氨酸含量变化趋势接近，其含量先缓慢减少，当葛仙米多糖提取物添加量达到50μg时，肌酐含量达最低后急剧增多，100μg时肌酐含量最高，且超过未添加葛仙米多糖提取物的空白模型中肌酐的含量，此后肌酐含量缓慢减少。

对反应模型中生成物PhIP含量进行分析，由图13和图14可知，将葛仙米多糖提取物加入模型体系中反应，杂环胺PhIP的生成量明显减少，当葛仙米多糖提取物添加量为50μg时PhIP含量最低，此后PhIP含量略微上升且趋于平缓。当葛仙米多糖提取物添加量分别为30，50，100，150μg时，其抑制率分别为48.8%、84.9%、83.1%、82.1%，可见葛仙米多糖提取物添加量为50μg时，葛仙米多糖提取物对杂环胺PhIP的抑制效果最好，其抑制率可达到84.9%。

为了进一步推测葛仙米多糖提取物与反应物之间的关系，观察模型体系中经过衍生后苯乙醛含量的变化情况，据此来推测葛仙米多糖提取物对苯乙醛的影响。由图15可知，随着葛仙米多糖提取物的增加，2-PB含量在该范围内呈先下降后上升的趋势，但均低于未加入葛仙米多糖提取物的模型，当葛仙米多糖提取物添加量为100μg时2-PB含量最低，此后2-PB含量缓慢增加。

综上所述，模型体系中杂环胺PhIP的生成量随着葛仙米多糖提取物的增加而逐渐减少，当葛仙米多糖提取物添加量为50μg时对PhIP的抑制效果最好，其抑制率达到84.9%，表明葛仙米多糖提取物对PhIP具有良好的抑制效果。葛仙米多糖提取物添加量大于50μg时，PhIP含量存在轻微升高的现象，而前体物质肌酐和苯丙氨酸的含量却大幅升高，且明显大于空白模型中的含量，造成这种现象可能是因为葛仙米多糖提取物中多糖成分复杂，在高温环境下葛仙米多糖提取物含量足够多时，导致葛仙米多糖提取物的自身反应剧烈，且在反应体系中占据主导地位，分解产物可能少量参与了生成杂环胺PhIP的反应，使得PhIP含量略微增加但仍远低于空白模型中的含量，同时也抑制了苯丙氨酸生成苯乙醛的反应，进而阻碍了前体物质肌酐与苯乙醛的反应，造成了两种前体物质含量的升高。而当葛仙米多糖提取物添加量为100μg时，体系中反应前体物质苯丙氨酸和肌酐的含量均达到最大，且中间产物苯乙醛含量达最低值，可能是因为葛仙米多糖提取物在此时抑制苯丙氨酸分解成苯乙醛的效率达最高值，故苯丙氨酸含量较空白模型中的含量更高，且苯乙醛含量最低。葛仙米多糖提取物添加量大于100μg时，推测葛仙米多糖提取物分解产物与苯乙醛竞争性参与生成杂环胺PhIP，导致苯乙醛含量有小幅上升但仍低于空白模型中的含量。

3 结论

综合实验数据分析，葛仙米多糖提取物对苯丙氨酸-肌酐模型体系中PhIP的生成具有一定的抑制效果，抑制途径可能是通过抑制苯丙氨酸降解使体系中的苯乙醛含量降低，使得参与杂环胺PhIP合成的反应物含量降低，最终导致PhIP的生成量减少。但由于葛仙米多糖提取物结构较复杂，目前还未推断出葛仙米多糖提取物中干预苯丙氨酸降解的具体活性成分，且由于多糖分解还会带来较小促进作用，后期还需对葛仙米多糖提取物添加量做更详细精确的研究。本文通过葛仙米多糖提取物抑制PhIP的化学机理研究，能够为多糖类物质在高蛋白食品加工中抑制PhIP形成的相关研究提供理论支撑，有利于进一步开发具有葛仙米特殊风味的功能性调味品，可为葛仙米等具有中国特色的传统食品提供新的利用途径，为调味品产业发展提供新的思路。

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