蒸汽爆破对杜仲叶水提液活性成分、抗氧化活性及香气组分的影响

摘要：【目的】通过分析蒸汽爆破（汽爆）后杜仲成熟叶片活性成分、抗氧化活性和香气组分变化，探究汽爆辅助制备杜仲叶茶的可行性。【方法】对比两个杜仲品种‘华仲8号’和‘华仲12号’成熟叶片的揉捻和不揉捻处理，采用2因素3水平完全试验设计，以叶片总黄酮、多酚和多糖含量确定最佳汽爆参数；采用紫外分光法和高效液相色谱法（HPLC）测定叶片活性成分，测定DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS[2，2-联氮-双-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]自由基清除率并分析叶片抗氧化活性与活性成分间的相关性；采用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用法（HS-SPME/GC-MS）测定三硝基苯香气组分。【结果】依据总黄酮等含量确定最佳汽爆参数为：蒸汽压强0.45 MPa，稳压时间300 s。该条件下‘华仲8号’不揉捻和‘华仲12号’揉捻叶片处理总黄酮和多酚含量较对照分别提高10.87和21.51倍，多酚含量较对照分别提高1.14和0.87倍，环烯醚萜类等6种活性成分含量均极显著提高（P＜0.01）。其中‘华仲8号’不揉捻和‘华仲12号’揉捻处理叶片的京尼平苷酸较对照分别提高了0.88和1.23倍，绿原酸较对照分别提高0.45和0.31倍，没食子酸甲酯较对照分别提高10.41和8.06倍。汽爆后杜仲叶抗氧化活性均极显著提高，‘华仲8号’不揉捻强于‘华仲12号’揉捻处理；IC₅₀值与京尼平苷酸、车叶草苷、绿原酸等含量均呈显著负相关（P＜0.05）。叶片挥发性化合物中产生了苯甲醇和β-环柠檬醛等芳香物质，具有花香气味的酮类占比最高，相对含量提高了1.93～3.38倍。【结论】蒸汽爆破处理显著提高了杜仲成熟叶水提液的活性成分水溶率和抗氧化活性，其芳香类物质种类增加且含量提高。鉴于目前国内绿叶杜仲资源量远高于红叶杜仲，本研究所提出的杜仲成熟叶片萎凋后直接蒸汽爆破简化了制茶工艺步骤，有效降低了绿叶杜仲茶生产成本，为规模化的杜仲叶加工利用提供了新思路。

关键词：杜仲；活性成分；抗氧化；香气组分；蒸汽爆破

中图分类号：TS272；TS201 文献标志码：A开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

文章编号：1000-2006（2024）03-0245-12

Steam explosion impact on the active ingredients， antioxidant activity and aroma components of the aqueous extract from Eucommia ulmoides leaves

ZHOU Yunfei^1，2，DU Qingxin^1，3，WANG Zhiyong^1，3， WANG Lu^1，3， WANG Yan^1，3， LIU Panfeng^1，3， SUN Zhiqiang^1，3*

（1. Research Institute of Non-timber Forestry， Chinese Academy of Forestry， Zhengzhou 450003， China; 2. College of Forestry and Grassland， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China; 3. Key Laboratory of Non-timber Forest Germplasm Enhancement amp; Utilization of State Forestry and Grassland Administration， Eucommia Engineering Research Center of State Forestry and Grassland Administration， Zhengzhou 450003， China）

Abstract：【Objective】 To evaluate the feasibility of manufacturing Eucommia ulmoides leaf tea via steam explosion （SE）， the changes of active ingredients， antioxidant activity and aroma components were compared between tea produced using E. ulmoides mature leaves with and without an SE. 【Method】Treatments based on physically rolling or not rolling the leaves were applied using E. ulmoides ‘Huazhong 8’ and ‘Huazhong 12’ mature leaves. A two-factor， three-level complete experimental design was used to determine the optimal SE parameters according to the contents of total flavonoids， polyphenols and polysaccharides， which were determined by UV spectroscopy. The active ingredients were detected by high-performance liquid chromatography （HPLC）. The antioxidant activity of the samples was assessed using 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and 2，2′-diazo-di（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diamine salt （ABTS） radical scavenging assays. Additionally， the correlation between the active ingredients of the samples and antioxidant activity was analyzed. The aroma components were determined by headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME/GC-MS）. 【Result】 The optimal SE parameters were a pressure of 0.45 MPa and retention time of 300 s. Under these conditions， the total flavonoid and polyphenol contents of ‘Huazhong 8’ and ‘Huazhong 12’ were increased by 10.87 and 21.51， and 1.14 and 0.87-fold compared with the control， respectively. The contents of six active ingredients increased significantly （P lt; 0.01）， with chlorogenic acid and gallic acid increased by 31.31% and 30.72%， respectively and methyl ester increased by 10.41 and 8.06-fold in non-twisted ‘Huazhong 8’ and twisted ‘Huazhong 12’ compared with the control， respectively. Overall， the antioxidant activity of mature E. ulmoides leaves was enhanced significantly with an SE， in which the antioxidant activity of non-twisted ‘Huazhong 8’ was greater than that of twisted ‘Huazhong 12’. The half-maximal inhibitory concentration （IC₅₀） was negatively correlated with the contents of kynurenine， carnoside， and chlorogenic acid （Plt;0.05）. Aromatic substances such as benzyl alcohol and β-cyclocitral were generated from the volatile compounds. 【Conclusion】An SE treatment significantly improved the water solubility and antioxidant activity of the active ingredients of the aqueous extract of mature E. ulmoides leaves， with an increase in the type and content of aromatic substances. Because the resource availability of green-leaved E. ulmoides is much greater than that of red-leaved E. ulmoides at present， our results suggest that mature E. ulmoides leaves without a physical twisting treatment prior to an SE would result in a simplified tea-making process and effectively reduce the production cost of E. ulmoides green leaf tea， providing novel ideas for the large-scale processing and utilization of E. ulmoides leaves.

Keywords：Eucommia ulmoides; active ingredients; antioxidant; aroma components; steam explosion

杜仲（Eucommia ulmoides）为杜仲科杜仲属（Eucommia）多年生落叶乔木，雌雄异株，是我国传统中药材^[1]，其叶与皮有效成分基本一致，药理作用相近^[2]，2005版中国药典将杜仲叶收录其中。杜仲叶片新近被列入“药食同源”类原料，为有效利用杜仲资源、拓展杜仲叶片高附加值的综合利用起到了推动作用^[3]。杜仲叶富含环烯醚萜类、木脂素类、苯丙素类、黄酮类、多糖类化合物，以及多种氨基酸、维生素和微量元素等活性成分^[3]，这些活性成分具有降血压、降血脂、抗氧化、保护心血管系统、消炎、抗癌、保护神经细胞、保护肠道系统和免疫系统等诸多保健功效^[4-5]。作为一种新的食品原料，杜仲叶常被制作成杜仲茶、杜仲发酵醋、杜仲胶囊、杜仲饮品和杜仲饲料等。其中，杜仲茶是发展最早且产品最多的一种杜仲食品，是目前研究的热点^[6]。传统意义上的杜仲茶是以杜仲叶片或雄花为原料，经萎凋、揉捻、日晒、发酵、干燥等一系列工艺制成的保健饮品^[7]。

目前关于杜仲茶制作工艺的探索较多，例如：将杜仲嫩叶与传统绿茶质量比3∶7混合可以改善口感^[8]；对杜仲成熟叶片接种乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）发酵4 d时，总黄酮、总酚和绿原酸含量最高，抗氧化活性显著增强^[9]；将杜仲叶片接种冠突散囊菌（Eurotium cristatum 2650），绿原酸含量为0.478 mg/g，且金花茂盛，颗粒饱满^[10]；对杜仲叶进行杀青条件为125 ℃、3 min时，杜仲茶关键成分指标最佳^[11]；复火杜仲茶发现，温度为110 ℃、时间 1～2 h时最有利于改善其汤色和口感^[12]。总之，杜仲茶通常的加工步骤是杀青→揉捻→揉切→烘干，必要时增加一个类似红茶和乌龙茶的发酵步骤，在这一过程中，茶叶的活性成分和生物活性会发生不同程度的改变。其中，揉捻是传统制茶的重要工序，通过撕扯、挤压、摩擦等起到打破叶肉细胞原有结构的作用^[13]，该过程促进了糖类物质向糖胺化合物转化，可提高总糖含量，催化多酚类物质发生酶促氧化反应，加快脂质氧化以及类胡萝卜素降解^[13]，亦是杜仲茶特殊风味形成的重要步骤。为提高杜仲茶的活性成分含量，优化其感官品质，需探索揉捻的力度、形状、温度、湿度、含氧量和时长，同时避免重度揉捻造成氨基酸、叶绿素、多酚类和黄酮类化合物流失^[14]。成形后可以进行渥堆发酵，促进酚类物质氧化、挥发性化合物分解重组，渥堆时堆心较堆面的反应更强烈，叶堆内部容易产生“熟老菱气”影响杜仲茶品质，应注意温度上升时及时翻堆，使叶片均匀反应，叶色由绿色转暗褐色则渥堆完成^[15]。然而，传统制茶工艺对技术要求较高，实际生产多是凭感官经验，可能导致茶品质不稳定，同时，杜仲叶片本身口感较涩且茶汤中存在着难以去除的青草气，也限制着杜仲茶品质和价值，而提高茶汤口感的关键在于解决杜仲叶中活性成分溶出率低的问题^[16-17]。

为提高杜仲叶水提液活性成分的溶出率，前人采用了超微粉碎物理破壁技术，通过适度打破其原本紧密结合的细胞壁，促使杜仲叶有效成分释放^[18]。蒸汽爆破（汽爆）是近年来广泛应用于生物质能源转化、农作物秸秆类再利用、膳食纤维改性等领域的一项技术^[19-20]。有学者发现，经汽爆后，松针中黄酮类化合物的提取率是未处理样品的2.54倍^[21]；汽爆后杜仲皮中黄酮和绿原酸的醇提物得率较未处理样品提高了1.65和2.30倍^[22]；杜仲叶片总黄酮得率提高了4倍^[23]，绿原酸产率提高62%，提取效率提高423%^[24]。蒸汽爆破条件可控，生产过程中仅使用水，环境友好、成本低廉、生产效率极高。然而，有关杜仲叶片汽爆后抗氧化活性及香气组分的研究极少，鲜见对汽爆在杜仲茶的生产制作应用上的报道。

采集杜仲成熟叶片进行揉捻和不揉捻两种工艺处理，以叶片的多酚、总黄酮和多糖含量为依据确定蒸汽爆破最佳参数；采用高效液相色谱法（HPLC）测定最佳参数下不同处理的叶片7种活性成分含量，同时，结合叶片的DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS[2，2-联氮-双-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]自由基清除能力分析其抗氧化活性，采用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用法（HS-SPME/GC-MS）测定分析和对比汽爆前后叶挥发性物质种类及其含量，以期为蒸汽爆破辅助制作杜仲茶提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

材料：试验材料为2021年6—7月在中国林业科学研究院经济林研究所孟州试验基地（112°42′58″E，34°51′38″N）采集的杜仲品种‘华仲8号’（E. ulmoides ‘Huazhong 8’）和‘华仲12号’（E. ulmoides ‘Huazhong 12’）成熟叶片。这两个杜仲品种为中国林业科学研究院经济林研究所选育的两个高产杜仲良种，其中，‘华仲8号’叶片呈绿色，具有结果早、产量高，高产稳产、适应性强的特点；‘华仲12号’叶片呈紫红色或红色，是叶片变异型品种，其叶片较其他绿叶杜仲的更厚，黄酮类物质含量较高^[25-26]。

试剂：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），车叶草苷，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%；ABTS [2，2-联氮-双-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]，上海麦克林生化科技有限公司；芦丁、没食子酸、京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷、没食子酸甲酯均购自索莱宝科技有限公司，纯度 ≥ 98%；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

QBS-80GB蒸汽爆破试验台，鹤壁正道生物能源有限公司；多功能煮茶器，小熊电器股份有限公司；ACQUITY Arc 型高效液相色谱仪（配置2998 PDA 型二极管阵列检测器），美国Waters公司；6890N-G5795B气相色谱仪质谱仪，美国Agilent公司；HT-300 BQ 超声波清洗机，济宁天华超声电子仪器有限公司；5430 R 高速冷冻离心机，德国 Eppendorf 公司；XS204 万分之一电子天平，梅特勒-托利多上海仪器有限公司；Milli-Q Integral 超纯水机，美国 Merck Millipore公司。

1.3 蒸汽爆破处理及样品溶液制备

采集的叶片萎凋至形成自然蜷曲后，分作2份：一份轻度揉捻3～5 min，制做形为圆筒状；另一份不作处理。得到‘华仲8号’揉捻（A1）和不揉捻（A2），及‘华仲12号’揉捻（B1）和不揉捻（B2），共4个处理的样品。将处理后的叶片55 ℃烘干至质量恒定，进行蒸汽爆破处理。CK1和CK2分别为不揉捻且不作汽爆处理的‘华仲8号’和‘华仲12号’杜仲叶片。

按照表1参数设置采用2因素3水平完全试验设计进行汽爆处理。杜仲叶片汽爆处理的蒸汽压强选择0.30、0.45、0.60 MPa，稳压时间选择100、200、300 s。汽爆前12～24 h，将杜仲叶均匀喷湿，密封保存使原料充分浸润至含水率为25%～30%。汽爆后的叶片适当切碎后，于55 ℃烘干至质量恒定，随后蒸汽熏蒸30～40 s回软，制成茶饼，再次于55 ℃烘干至恒定质量，得到杜仲茶成品。

称取（5.00±0.02）g杜仲茶成品，放入装有500 mL超纯水的多功能煮茶器中，加热水温至100 ℃后持续3 min，过滤，待其冷却至室温，离心取上清液。

1.4 总黄酮、总多酚和多糖含量的测定

1）总黄酮含量。参照肖作为等^[27]的方法，精确称取芦丁标准品18 mg置于烧杯中，用60%乙醇溶解后定容至20 mL容量瓶中，摇匀，即可得0.9 mg/mL的芦丁标准溶液。精确吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，蒸馏水定容至相同体积。分别取1 mL于试管中各加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL摇匀，放置6 min后，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，再放置6 min，加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，再用60%乙醇溶液稀释至20 mL，放置15 min后，510 nm处测定后，吸光度作为纵坐标，浓度作为横坐标，绘制标准曲线。按芦丁标准曲线的步骤加入试剂。根据公式（1）计算杜仲叶水提液中黄酮类化合物的含量。

C₁ =c₁×n₁×V₁/m₁。 （1）

式中：C₁为杜仲叶水提液中黄酮类化合物含量，mg/g；c₁为总黄酮的质量浓度，mg/mL；n₁为稀释倍数；V₁为待测杜仲水提液定容后的体积，20 mL;m₁为杜仲茶样品干质量，g。

2）总多酚含量。参照LI等^[28]的方法，精确吸取没食子酸标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，蒸馏水定容至相同体积。分别取1.0 mL于试管中各加入0.5 mL福林酚试剂摇匀，放置3～8 min后，加入15%碳酸钠溶液4.0 mL摇匀，避光放置30 min，765 nm处测定后，吸光度A作为纵坐标，浓度作为横坐标，绘制标准曲线。按照没食子酸标准曲线的步骤加入试剂。根据公式（2）计算杜仲茶中多酚类化合物的含量，结果以每克杜仲茶干品中总多酚质量浓度（mg/g）表示。

C₂ =c₂×n₂×V₂/m₂。（2）

式中：C₂为杜仲叶水提液中多酚类化合物含量，mg/g；c₂为多酚的质量浓度，mg/mL；n₂为稀释倍数；V₂为待测杜仲水提液定容后的体积，25 mL;m₂为杜仲茶样品干质量，g。

3）多糖含量。参照王黎明等^[29]的方法，精确称量半乳糖标准品50 mg，在50 mL容量瓶中定容，精确吸取半乳糖标准溶液各0.0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8、2.0 mL于试管中，加蒸馏水稀释至2.0 mL，样品中加入4.0 mL质量分数为 0.05%的蒽酮-硫酸试剂，振荡混匀后置于冰水冷却，沸水浴5 min，定容至25 mL。使用蒸馏水做空白对照，在675 nm处测定后，吸光度作为纵坐标，浓度作为横坐标，绘制标准曲线。按照半乳糖标准曲线的步骤加入试剂。根据公式（3）计算杜仲叶水提液中多糖类化合物的含量。

C₃ =c₃×n₃×V₃/m₃。（3）

式中：C₃为杜仲叶水提液中多糖类化合物含量，mg/g；c₃为多糖的质量浓度，mg/mL；n₃为稀释倍数；V₃为配制样品溶液的体积，25 mL；m₃为杜仲茶样品干质量，g。

1.5 7种活性成分含量测定

参照孟益德等^[30]的方法，通过高效液相色谱法同时测定杜仲叶水提液中7种活性成分（京尼平苷酸、车叶草苷、原儿茶酸、没食子酸甲酯、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸）含量。HPLC的色谱条件如下：色谱柱采用赛默飞 Syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；梯度洗脱程序：0～7min，5% 乙腈；7～10 min，5%→17%乙腈；10～25 min，17%乙腈；25～26 min，17%→20%乙腈；26～33 min，20%乙腈；33～34 min，20%→5%乙腈；检测波长：239 nm（京尼平苷酸，14.5～15.0 min；车叶草苷，31.5～32.2 min）、247 nm（原儿茶酸，13.5～14.0 min）、264 nm（没食子酸甲酯，16.2～17.0 min）、276 nm（儿茶素，15.5～16.5 min；松脂醇二葡萄糖苷，23.8～24.5 min）、325 nm（绿原酸，14.0～14.5 min）。

将京尼平苷酸、车叶草苷、原儿茶酸、没食子酸甲酯、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸7种标准品混合，配制成质量浓度梯度为0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L的混合标准工作液，以吸光度为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（x），按上述方法得到HPLC图。7种活性成分的回归方程分别为Y₁=9.220 5×10⁵x-7.406 7×10⁵，Y₂=9.605 7×10⁵x-5.892 4×10⁵，Y₃=3.739 2×10⁵ x-1.776 6×10⁵，Y₄=3.899 4×10⁶x-4.064 3×10⁶，Y₅=4.394 7×10⁶x-4.184 9×10⁶，Y₆=3.974 5×10⁵x-2.715 9×10⁵，Y₇=3.227 5×10⁵x-2.828 1×10⁵，标准曲线决定系数R²均大于0.999。

1.6 抗氧化活性测定

参照肖作为等^[27]的方法，称取DPPH粉末适量，加入体积分数75%乙醇稀释成0.1 mmol/L的DPPH工作液。将待测样品用蒸馏水稀释成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/L的样品溶液，分别取上述溶液各2 mL于试管中，各加入DPPH工作液2 mL，混匀，避光反应30 min，于517 nm处得到吸光度A_s1；取样品溶液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_b1；取DPPH工作液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_c1。平行3次，代入公式（4）计算DPPH自由基清除率P_DPPH：

P_DPPH =1-（A_s1-A_b1）A_c1×100%。（4）

参照唐思颉等^[31]的方法，称取ABTS粉末适量，加入75%乙醇稀释成7.0 mmol/L的ABTS水溶液，称取过硫酸钾粉末适量，加入超纯水溶解成2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，两者等体积比混合，制备得ABTS工作液，置于4 ℃冰箱，避光保存10～16 h备用。将待测样品用蒸馏水稀释成1.3、1.9、2.5、3.1、3.8、4.4、5.0 g/L的样品溶液，分别取上述溶液各1 mL于试管中，各加入ABTS工作液2 mL，混匀，避光反应6 min，于517 nm处得到吸光度A_s2；取样品溶液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_b2；取ABTS工作液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_c2。平行3次，代入公式（5）计算ABTS自由基清除率P_ABTS：

P_ABTS =1-（A_s2-A_b2）A_c2×100%。（5）

1.7 HS-SPME/GC-MS分析

参照Gay等^[32]的方法，采用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用法（HS-SPME/GC-MS）测定杜仲叶水提液香气组分。称取适量样品于顶空瓶中，加入饱和氯化钠，压盖，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再将固相微萃取针扎进顶空中，继续放入80 ℃水浴中30 min，250 ℃进样口解析5 min。仪器方法如下：色谱柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温为初温50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；进样口温度为250 ℃；传输线温度为280 ℃；载气流速为1.0 mL/min；分流比为不分流；质谱条件：离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质谱为EI源，模式为全扫（m/z）40～600。

1.8 数据分析

每个处理作3次重复，采用SPSS 21.0进行数据处理和分析，试验结果以平均值±标准差（means±SD）表示。其中抗氧化活性以50%的清除率/质量浓度（IC₅₀）表示，IC₅₀值越小，代表抗氧化能力越强，反之亦然。采用双因素方差分析蒸汽压强和稳压时间对主要活性成分的影响，以及t检验比较对照间的差异，并对各指标进行方差齐性检验，若P＞0.05，采用最小显著差异法（LSD）进行多重比较，否则采用Tamhane’s T2法；采用Pearson法进行活性成分和抗氧化活性的相关性分析。利用Excel 2008和Origin 2021软件作图。从http：//www.thegoodscentscompany.com/上查询香气阈值及气味描述，将气味活度值（OAV）＞1的挥发性化合物筛选为主要香气物质。

2 结果与分析

2.1 汽爆对杜仲叶水提液中总黄酮、多酚和多糖含量的影响

双因素方差分析结果见表2。由表2可知，蒸汽压强、稳压时间对总黄酮、多酚和多糖的影响均

达极显著水平（P＜0.01），且两者之间存在极显著交互作用（P＜0.01），说明蒸汽爆破过程中蒸汽压强和稳压时间的改变对杜仲叶水提液活性成分含量的影响起重要作用。t检验结果显示，两种杜仲成熟叶片对照处理的总黄酮（t=-30.337，F=3.273，P＜0.001）和多酚（t=-25.773，F=4.589，P＜0.001）含量存在显著性差异，且‘华仲8号’的含量显著高于‘华仲12号’；多糖（t=3.881，F=10.214，P=0.056）含量差异不显著。

蒸汽爆破处理中，除了P₂T₂处理的B1中多酚含量高于P₂T₃处理，P₃T₁处理的A1中总黄酮和多糖含量及B₂中多酚含量高于P₂T₃处理，P₃T₃处理的A2中多糖含量个别高于P₂T₃处理外，其他均以P₂T₃处理为最高（表3）。因此，蒸汽压强为0.45 MPa，稳压时间为300 s时，最有利于杜仲茶中黄酮类、酚类和多糖类物质的溶出。由表3可知，P₂T₃处理中，A2处理的总黄酮含量较对照提高了10.87倍，B1处理的总黄酮含量较对照提高了21.51倍。A2多酚比对照提高了1.14倍；B1比对照提高了0.87倍。多糖含量以B1最高，A2次之。

2.2 杜仲叶水提液中7种活性成分和抗氧化活性分析

2.2.1 活性成分

HPLC法测定结果如表4所示。A2的7种活性成分含量均显著高于A1，发现除原儿茶酸外， A1和A2的其他6种成分含量均极显著高于CK1（P＜0.01）；B1的7种活性成分含量均显著高于B2，且均极显著高于CK2。可以看出，除原儿茶酸B1显著低于A2外，其他6种成分的B1含量均极显著高于A2（P＜0.01），且在所有处理中为最高，排序均为：B1＞A2＞B2＞A1＞CK1＞CK2，各处理间差异均达极显著水平。B1处理的京尼平苷酸、车叶草苷、绿原酸、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷和没食子酸甲酯含量较CK2分别提高122.79%、81.83%、44.50%、124.01%、51.69%和1 040.85%，A2处理较CK2分别提高87.98%、48.46%、31.31%、85.52%、25.17%和806.00%。

2.2.2 抗氧化活性

1）DPPH自由基清除能力。半抑制浓度（IC₅₀值）越低，对应自由基的清除能力越强。在杜仲叶水提液质量浓度为1.0～5.0 g/L范围内，DPPH自由基的清除率随着质量浓度增大而增大（图1）。IC₅₀值显著分析表明，除了A2与B1无显著差异外，其他处理间均存在显著性差异。DPPH自由基清除能力（以IC₅₀值为参考）由强到弱排序为B1＞A2＞A1＞B2＞CK1＞CK2。其中，对照组CK1和CK2的IC₅₀值分别是6.033和8.079 g/L，即汽爆前DPPH自由基清除能力‘华仲8号’显著强于‘华仲12号’；B1和A2处理的DPPH自由基清除能力IC₅₀值最小，为2.119 和2.428 g/L，分别是汽爆前（8.079 g/L）的26.23%和30.05%，其次是A1和B2处理的IC₅₀值，为2.781和3.207 g/L，分别是汽爆前的34.42%和39.70%，以IC₅₀值为参考，即经汽爆后两种杜仲成熟叶的抗氧化活性揉捻处理分别提升了1.91和1.85倍，不揉捻处理分别提升了2.33和0.88倍。与杜仲商品茶相比，A2和B1处理的IC₅₀值分别是CK2的40.25%、35.12%，其次是A1和B2处理的IC₅₀值分别是CK2的46.10%、53.16%，即汽爆茶揉捻处理抗氧化活性分别提升了 1.17和1.09倍，不揉捻处理分别提升了1.20和0.88倍。

2）ABTS自由基清除能力。在杜仲叶水提液质量浓度为1.3～5.0 g/L范围内，ABTS自由基的清除率随着质量浓度增大而增大（图1）。IC₅₀值显著性分析表明，所有处理间均存在显著性差异。ABTS自由基清除能力（以IC₅₀值为参考）由强到弱排序为A2＞B1＞A1＞B2＞CK1＞CK2。其中，对照组CK1和CK2的IC₅₀值分别是5.924和7.190 g/L，即汽爆前ABTS自由基清除能力‘华仲8号’显著强于‘华仲12号’；A2和B1处理的ABTS自由基清除能力IC₅₀值最小，为2.688和3.448 g/L，分别是汽爆前（5.924 g/L）的45.37%和58.20%，其次是A1和B2处理的IC₅₀值，为3.754和4.583 g/L，分别是汽爆前的63.37%和77.36%。即经汽爆处理，两种杜仲成熟叶的抗氧化活性揉捻处理分别提升了0.58和1.09倍，不揉捻处理分别提升了1.20和0.57倍。与杜仲商品茶相比，A2和B1处理的IC₅₀值分别是CK2（7.190 g/L）的37.39%、47.96%，其次是A1和B2处理的IC₅₀值分别是CK2的52.21%、62.35%，即汽爆茶揉捻处理分别提升了 0.92和1.09倍，不揉捻处理分别提升了1.20和0.29倍。

2.2.3 活性成分与抗氧化活性的相关性分析

活性成分与DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的相关性分析显示，总黄酮、多酚、京尼平苷酸、车叶草苷、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素和松脂醇二葡萄糖苷与DPPH自由基和ABTS自由基清除能力均呈显著负相关（P＜0.05），而多糖与没食子酸甲酯对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力无显著影响（表5）。

结果显示汽爆后总黄酮、多酚、京尼平苷酸、车叶草苷、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素和松脂醇二葡萄糖苷这些活性成分的释放是杜仲叶水提液抗氧化能力显著性增强的主要原因。

2.2.4 HS-SPME/GC-MS初步分析香气组分

HS-SPME/GC-MS从A2、B1和CK1中共鉴定出145种挥发性化合物，A2、B1和CK1中可鉴定的峰面积分别占比为100.00%、93.48%和94.89%，根据化合物类型将其分为碳氢化合物、杂环类化合物、醇类化合物、醛类化合物、酮类化合物、酯类化合物、酚类化合物和其他类化合物（表6）。

由表6可见，CK1挥发物相对含量最高的是酯类，占41.71%； A2和B1的挥发物相对含量最高均为酮类，分别占29.05%和23.32%。CK1的挥发性化合物成分共鉴定出52种，而A2和B1的挥发性化合物种类为68和69种，分别增加了16和17种。汽爆后的醛类、酮类和酚类化合物均有增加，其中，A2的醛类、酮类和酚类分别增加了3、10和3种，B1分别增加了4、7和5种。

根据查询挥发性化合物的嗅闻阈值及香气描述，从A2、B1和CK1的挥发性化合物中初步筛选出11种呈香物质（表7）。其中A2处理中壬醛、大马士酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯5种芳香物质相对含量分别比对照增加了1.37、0.09、2.34、1.85和6.49倍，并产生了苯甲醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-环柠檬醛和香兰素，相对含量分别达8.70%、5.29%、0.89%和0.81%；B1处理中壬醛、癸醛、大马士酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯5种芳香物质相对含量分别比对照增加了1.29、0.97、0.73、2.51和3.73倍，并产生了（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-环柠檬醛、香兰素和α-紫罗兰酮4种新的芳香物质，相对含量分别达3.78%、0.99%、0.45%和0.64%。基于气味活度值（OAV）分析结果，CK1主要呈香物质有大马士酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、癸醛和二氢猕猴桃内酯等5种，OAV值分别为330.00、192.86、74.00、3.50和2.66，呈现玫瑰香、花香和紫罗兰香；A2呈香物质有α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、大马士酮、香叶基丙酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、二氢猕猴桃内酯、香兰素、苯甲醇和壬醛等9种，OAV值分别为810.00、550.00、360.00、247.00、103.73、19.92、1.62、1.58和1.27，呈现木香、花香、紫罗兰香、玫瑰香、木兰香气； B1呈香物质有大马士酮、香叶基丙酮、α-紫罗兰酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、二氢猕猴桃内酯、癸醛和壬醛等7种，OAV值分别为570.00、260.00、160.00、74.12、12.58、6.90和1.23，呈现玫瑰香、木兰香气、木香、花香等。

3 讨 论

尽管有研究显示，‘华仲12号’（亦被称为红叶杜仲）的黄酮含量高于其他绿叶杜仲^[34]，但是本研究中对照组‘华仲8号’总黄酮和多酚含量显著高于‘华仲12号’，汽爆后两者含量均极显著增加。由此表明，杜仲叶片不经加工时，活性成分水溶解率极低；虽然杜仲叶片都属于薄革质，但红叶杜仲比其他绿叶杜仲更厚^[35]，不经揉捻处理可能使活性成分难以被溶出。

通过比较9个不同汽爆条件下总黄酮、多酚和多糖含量发现，汽爆后的总黄酮和多酚含量较对照均有显著提高（P＜0.05），蒸汽压强、稳压时间对总黄酮、多酚和多糖影响均达到极显著水平（P＜0.01），且两者间存在极显著交互作用（P＜0.01），说明汽爆处理对杜仲叶片活性成分的水溶解率提高起关键作用。依据总黄酮、多酚和多糖含量确定最佳处理为蒸汽压强0.45 MPa，稳压时间300 s，其中，A1、A2、B1和B2的总黄酮含量较对照分别提高了1.93、10.87、21.51和21.71倍，多酚含量较对照分别提高了0.43、1.14、0.87和0.67倍。前期研究发现，汽爆过程中蒸汽在高压下瞬时释放打破了叶片细胞壁结构，使物料比表面积成倍增加，溶剂可及性增强，因而活性成分溶出率显著提高^[26，36]。研究发现，利用汽爆和酸提取相结合的技术来处理桔皮，显著提高了可溶性食物纤维的产量^[37]；汽爆后，漆树（Toxicodendron vernicifluum）果实出油率增加了16.04%，比未处理样品的出油率增加约4倍^[38]；对番茄（Solanum lycopersicum）皮汽爆后，皮渣中的螯合可溶性果胶、水溶性果胶和可溶性膳食纤维总量分别提高了5.00、1.95和0.26倍，持油力、体外抗氧化能力等有所改善^[39]。此外，汽爆条件不同，目标产物得率也不同，这主要由于物料中各种结构组织对汽爆处理响应程度不一样。例如，芦苇（Phragmites communis）在汽爆压强为1.2 MPa时比1.5 MPa生成的细纤维更多，能更好地改善纤维质量^[40]；汽爆过程中，豆渣中可溶性膳食纤维含量随压强的增加先升后降^[41]；Fu等^[23]发现，汽爆时，杜仲叶片比表面积随蒸汽压强的增加呈先升后降的趋势，Ding等^[42]也有类似发现。

揉捻处理一般在凋萎之后进行，也是发酵的前过程，该处理破坏了杜仲叶细胞组织，使叶内多酚类化合物与多酚氧化酶充分接触；揉捻得宜则茶汤色泽红亮，揉捻过度则有大量氧化物质，导致茶汤色泽偏深，叶底红暗等情况出现^[41]。对比两种工艺处理， P₂T₃处理下，A2比A1的总黄酮、多酚及7种活性成分含量显著提高，表明‘华仲8号’叶片揉捻后，黄酮类和多酚类等活性成分与叶中多种氧化酶接触充分反应后被氧化，其含量均不同程度降低，与前人结论一致^[43-45]；‘华仲12号’揉捻后多酚和多糖含量显著高于不揉捻处理，即揉捻能促进‘华仲12号’叶片中活性成分释放，这很可能与‘华仲12号’叶片较厚有关。 汽爆后，‘华仲12号’总黄酮含量显著高于‘华仲8号’，与前人结论相符^[34-35，46]。

作为杜仲次生代谢产物，多酚类和环烯醚萜类化合物是杜仲饮品的重要成分，既对杜仲叶水提液的抗氧化活性起到关键作用，也是影响杜仲茶口感的主要风味物质（如绿原酸、没食子酸甲酯等）^[19]。P₂T₃条件下，京尼平苷酸、车叶草苷、绿原酸、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷和没食子酸甲酯6种成分含量均极显著提高，以A2和B1最佳，其中，A2较对照提高了87.98%、48.46%、31.31%、85.52%、25.17%和806.00%，B1较对照提高了122.79%、81.83%、44.50%、124.01%、51.69%和1 040.85%。与几种市售商品杜仲茶相比，A2比杜仲黑茶^[36]中绿原酸（2.81 mg/g）和原儿茶酸（0.29 mg/g）含量分别提高了3.54和3.38倍，B1分别提高2.63和2.48倍；A2和B1较杀青工艺生产的杜仲茶^[13] 绿原酸含量（4.2 mg/g）分别提高了2.02和1.91倍，比杜仲金花茶^[12] 绿原酸含量（0.478 mg/g）提高了25.72和24.98倍。

相关性分析发现，总黄酮、多酚、京尼平苷酸、车叶草苷、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素和松脂醇二葡萄糖苷与DPPH自由基和ABTS自由基清除能力均呈显著正相关（P＜0.05），与前人发现总黄酮、多酚、绿原酸和原儿茶酸等含量与杜仲叶片抗氧化能力密切相关的结论一致^[47]。抗氧化活性表现最佳为A2和B1，DPPH自由基清除能力IC₅₀值分别是杜仲商品茶的40.25%、35.12%，ABTS自由基清除能力IC₅₀分别是杜仲商品茶的37.39%、47.96%。由于汽爆后杜仲叶活性成分溶出率显著提高^[42]，而这些活性成分与DPPH自由基和ABTS自由基清除率显著相关，因此在低浓度下依然表现出较强的抗氧化活性。

为改善杜仲茶香气，前人进行了诸多尝试。采用4种乳酸菌发酵后，挥发性成分增加了7～20种，以酮类、醇类和杂环类居多，相对含量分别为18.8%、18.3%和25.7%，提高了2.10、1.90和3.99倍^[48]；采用泾阳茯砖茶加工工艺制备的杜仲叶茯砖茶，6个阶段共鉴定出 152 种挥发性物质，酸类（19.06%～30.59%）、酯类（15.58%～21.87%）、酮类（11.84%～14.30%）和醇类（10.52%～20.07%）为各样本中总体含量较高的挥发性成分^[49]；以杜仲等3 种中草药为原料，加枣汁、蔗糖等调节风味后，检测出杜仲饮品中挥发性化合物有27种，醛类和醇类化合物居多，相对含量分别为38.89%和6.79%^[50]。本研究发现，A2 和B1挥发性化合物分别为68和69种，增加了16和17种，其中酮类化合物占比最高，相对含量分别为29.05%和23.32%，比对照增加了3.38和3.52倍，酮类物质在茶汤中多为花香气味，性质稳定，且花香持久，例如，大马士酮为类似玫瑰的芳香气味，β-紫罗兰酮为紫罗兰香气等^[48]。其中，A2的主要呈香物质为壬醛、大马士酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯，其含量比对照显著增加，并产生了苯甲醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-环柠檬醛和香兰素4种新的芳香物质；B1的主要呈香物质是壬醛、癸醛、大马士酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯，其含量比对照显著增加，并产生了（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-环柠檬醛、香兰素和α-紫罗兰酮4种新的芳香物质。由于当前绿叶杜仲的资源量远远大于红叶杜仲，因此本研究选择‘华仲8号’杜仲叶作为挥发性化合物分析的对照，使其更具代表性。后续将采用电子鼻和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术，基于OAV值、主成分分析以及正交偏最小二乘法深入解析汽爆前后挥发性化合物的差异情况。杜仲茶整体品质不仅受活性成分及香气组分的影响，色、味也是评价茶叶品质的关键因素^[42]，杜仲叶片汽爆后由暗绿色转为暗褐色，叶色一致，茶汤有类似红茶的色泽，同时，因活性成分含量高，茶汤口感醇厚。本研究所探索的方法彻底改变了杜仲发酵茶制作时，渥堆过程凭感观经验操作可能造成的 “熟老菱气”和叶色不均的问题。

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（责任编辑 李燕文）