海南省东方市甜瓜细菌性果斑病病原鉴定

李鹏声 黄清泰 范咏梅 王萌 杨叶

摘要：细菌性果斑病严重影响甜瓜生产，为确定其病原菌种类，从海南省东方市种植基地采集大量疑似细菌性果斑病的甜瓜样本，进行病原菌分离纯化，并按柯赫法则对获得的菌株进行致病性测定。通过菌落形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列比对分析，对分离病原菌进行鉴定。结果表明，大田采集的所有甜瓜病果中均分离到培养性状一致的细菌，细菌分离率为100%；所有分离菌株均对甜瓜果实具有致病性，该病原菌革兰氏反应呈阴性，其菌落形态及生理生化测定结果与已报道的西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）一致；BLAST比对与A. citrulli 菌株的同源性可达100%，系统发育分析也进一步证实该病菌为A. citrulli。研究结果确定了甜瓜果斑病的致病菌，为该病的有效防治提供了依据。

关键词：甜瓜；细菌性果斑病；病原菌鉴定；西瓜嗜酸菌；海南省东方市

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0124

中图分类号：S652；S436.5 文献标志码：A 文章编号：1008‐0864（2024）03‐0117‐07

甜瓜（Cucumis melo L.）为葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植物，是我国最早作为果品的瓜类。甜瓜在国内外广泛种植，中国是最大的甜瓜生产国，栽培历史悠久，并出口到东南亚等许多国家［1‐2］。因为气候变化和栽培管理措施不足，甜瓜生产中出现的病害种类越来越多，其中细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）对甜瓜危害最严重，可造成甜瓜的大范围减产[3]，陕西省1988年就有该病的报道[4]。目前，由西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的瓜类细菌性果斑病在我国发生较为普遍，而甜瓜细菌性果斑病在新疆、内蒙古、北京、山东、吉林、福建等地均有发生，造成甜瓜减产甚至绝收[5-9]。于海博等[9]发现，果实感病初期呈淡绿或褐色水渍状病斑，随后病斑扩大，病菌侵入果肉组织，并导致褐变及腐烂。A. citrulli 除了为害果实，还可侵染叶片、种子等部位，在甜瓜整个生长周期均有可能被侵染[10‐11]。倪玉杰[12]研究指出，A. citrullis可在种子和土壤表面越冬，可通过风雨、昆虫、农事操作传播从伤口和气孔侵染，高温和高湿更有利于其发生。自1998 年张荣意等[13]首次报道海南乐东、东方等市县种植的西瓜上发现细菌性果斑病以来，该病害在海南不断发生和扩散。吉训聪等[14]在海南乐东等甜瓜产区发现细菌性果斑病为害甜瓜果实。近年来，海南因其独特的气候条件已成为甜瓜的新兴产区。海南大棚种植甜瓜的面积逐年增加，随之而来的各种病害也时有发生且蔓延。其中，瓜类细菌性果斑病的危害就非常突出，据报道，该病在海南每年造成的损失可达5亿元[15]。甜瓜是海南省东方市大力推广种植的主要农业作物之一，2022 年东方市甜瓜多茬累计种植面积1.73 万hm2，年产量91 万t，占海南全省甜瓜总产量的32.5%左右[16]。2021—2022年笔者在海南省东方市多个甜瓜大棚基地调查发现，果实上有大量疑似细菌性果斑病的症状发生。由于该病具有发病迅速、传播快、爆发性强等特点，田间一旦发病很难被控制，对瓜类种植业的危害极大。因此，本研究从海南省东方市3个甜瓜生产基地采集病果进行病原菌分离纯化，并通过培养菌株形态、生理生化测定及分子鉴定的方法，对病原菌进行鉴定，旨在了解该病害的发生原因，明确其病原菌的种类，为生产中病害的综合管理及有效防治提供理论依据，以促进甜瓜产业在海南的健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的甜瓜果实采自海南省东方市共3个甜瓜种植基地，品种分别为‘ 红冠‘ 金香玉和‘玉菇。

1.2 病害症状观察与病原菌分离、纯化

2021年11月和2022年4月在海南省东方市的3个甜瓜种植基地（经纬度分别为18.882 688°N、108.659 103° E，18.900 692° N、108.674 856° E，18.934 168°N、108.685 075°E）的甜瓜进行病害的田间调查并记录发病症状，将新鲜的感病样本带回实验室分离病原菌。

采用常规的组织分离法分离病原菌。首先于低倍显微镜下（40 ×）观察病健交界处组织有无溢菌现象；然后将有溢菌的新鲜样本用流水冲洗，待自然凉干后，选取要分离的病斑进行标记。用灭菌的解剖刀切取病健交界处的组织（5～10 mm），放入0.5%升汞中浸泡35 s，随后放入75%酒精中洗脱8 s，最后用无菌水冲洗3次；然后取出组织块加1 mL无菌水捣碎，浸泡30 min后，用接种环蘸取组织浸出液在LB培养基（蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂粉15.0 g加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.2）上划线，于28 ℃恒温培养箱培养24～48 h，待长出单个菌落后，用接种环刮取菌液连续3次划线接种到新的LB培养基平板中进行病原菌纯化[9]。将纯化菌株分别接种于斜面培养，并于4 ℃保存备用。

1.3 病原菌致病性测定

将纯化获得的20个菌株在LB培养基上培养24 h 后，再转移到LB 液体培养基于200 r·min-1、28 ℃摇培24 h。用分光光度计测定菌体含量，配制成1×108 CFU·mL-1细菌悬浮液备用。

采集成熟、健康的甜瓜（品种‘红冠）果实备用，采用针刺法进行致病性测定。首先在甜瓜表面用灭菌针在每个点位进行刺伤，然后每个刺伤点接种20 μL细菌悬浮液，并用无菌水作为阴性对照。每个菌株在每个果实上接种3个点，重复5次，即每个菌株接种15个点。将接种好的甜瓜果实放入保鲜盒于30 ℃的培养箱中保湿培养，2 d后观察并记录发病情况，若接种果实上产生与田间症状相似的褐斑，于显微镜下观察到喷菌现象即为发病，并从病果上再次分离病菌，按柯赫法则确定菌株的致病性。

1.4 病原菌形态学观察和革兰氏染色

按照常规细菌形态学观察方法[17‐18]，将分离纯化后的菌株接种于LB培养基上，于28 ℃恒温箱中培养24 h，观察菌落在培养基上的生长形态、大小、颜色及菌落表面和边缘生长状况。参照格革兰氏染色液试剂盒（上海吉至生化科技有限公司）使用说明书对菌株进行革兰氏染色，并显微观察菌株形态及拍照。

1.5 病原菌生理生化特性测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]，选取2个代表性菌株（HNTG01和HNF2.3），对病原菌进行荧光试验及耐盐性、淀粉水解、V-P测定、明胶液化、硝酸盐还原和精氨酸双水解酶产生、碳氮源利用等生理生化特性测定，重复3次。

1.6 病原菌16S rDNA 序列分析

将菌株加入LB液体培养基中，摇培24 h后的菌悬液转入离心管离心，并用细菌DNA提取试剂盒（北京酷来搏技术有限公司）提取DNA，将获得的DNA进行PCR扩增。参照文献[9]合成16S rRNA通用引物序列5′-TGTACACACCGCCCGTCACAC-3′和5′-CCATTCAGAAATCTCCGGATC-3′。PCR 体系为：引物各1 μL、提取的DAN 1 μL、无菌水9.5 μL、Tag酶12.5 μL。PCR程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。将扩增好的PCR产物进行凝胶电泳分离，使用DNA 回收试剂盒回收目标DNA 片段，将其送往上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将测得的基因序列在GenBank的采用BLAST进行对比分析。

2 结果与分析

2.1 甜瓜细菌性果斑病的田间症状及病原菌的分离

2021 年11 月和2022 年2 月对海南东方市3个甜瓜基地的田间调查发现，所有品种的甜瓜果实上均发现疑似细菌性病害的发生，其中‘金冠品种的发病最严重，一些大棚的发病率高达100％。该病的典型病症为：初期果实表面出现水渍状小斑点并逐渐扩大，且初期病变只局限于果皮，随着时间延长渐变为褐色大斑，并造成穿孔，后期感染部位的果皮出现龟裂、凹陷（图1），里面的果肉出现褐变腐烂。潮湿条件下，在病斑表面常常有溢出粘稠、透明的琥珀色菌脓。同时，在成熟叶片上也可发现病斑，早期为水渍状斑点，后期受叶脉限制而呈现多角形或不规则褐色坏死病斑，病斑周围明显发黄，严重时病斑稍有凹陷，多个病斑可融合成大斑（图1）。

采集‘红冠‘金香玉和‘玉菇3个品种的37个病果上均分离到培养性状非常相似的细菌，细菌分离率为100%。

2.2 病原菌对甜瓜果实的致病力

致病力测定发现，所有供试菌株的发病率均达100％。菌悬液接种2 d就出现明显水渍状病斑，4 d后部分菌株及其病斑出现流脓现象，切开甜瓜，可见果肉部分也出现明显褐变，而对照部位无任何变化（图2）。接种病原菌的甜瓜上均表现出与田间病害相似的症状，且从接种的病瓜上又重新分离到相同的菌株，根据柯赫氏法则证实分离菌株为病原菌。

2.3 病原菌形态和革兰氏染色

供试菌株在LB培养基上培养，初期菌落呈圆形、乳白色，表面光滑不透明，中间微隆起，边缘整齐（图3A）。革兰氏染色反应为阴性（图3B），菌体短杆状，大小为（2.0～3.0） μm×0.5 μm，无芽孢。

2.4 病原菌生理生化特性

生理生化特性测定结果如表1所示，2个供试菌株的试验结果基本一致。测定结果为阳性的有：耐盐性、过氧化氢酶、氧化酶、硝酸盐还原和吐温80 的分解试验、明胶液化、葡萄糖发酵、甘露醇、山梨醇和肌醇的利用；测定结果为阴性的有：KBA培养基不产荧光、淀粉水解、甲基红测定、乙酰甲基甲醇测定、吲哚的产生、产生果聚糖和精氨酸双水解试验。

2.5 病原菌16S rDNA 序列分析

将致病菌株HNTG01和HNF2.3的16S rDNA进行扩增，分别得到长为863和890 bp的片段，与GenBank中的核酸数据库进行BLAST对比分析表明，该序列与西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli 3 菌株（ GU339091.1），M6 菌株（CP029373.1）和 JZ17 菌株（MG655621.1）的同源性为100％。系统发育分析结果也表明，致病菌株与A. citrulli 菌株聚为一类（图4）。

3 讨论

西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）引起的瓜类细菌性果斑病是为害西瓜和甜瓜等葫芦科植物的一种毁灭性病害，也是世界各国公认的检疫性病害。已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录及全国农业植物检疫性有害生物名单[15，19]。早期，致病菌被命名为燕麦噬酸菌西瓜亚种（Acidovoraxavenae subsp. citrulli）[20]，2008 年Schaad 等[21]将其更名为西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）。本次在海南省东方市的调查发现，该病比较常见，且在个别甜瓜种植区发病极为严重。从海南省东方市甜瓜基地采集回来的疑似瓜类细菌性果斑病的新鲜病果中均分离到培养性状比较一致的细菌，结合形态特征、生理生化特性及分子生物学3个方面对病原菌进行鉴定，确定其为西瓜噬酸菌。采用16S rDNA 通用引物能够准确、便捷地鉴定出西瓜噬酸菌，供试菌株与已报道的多个西瓜噬酸菌株的同源性达100%；同时，系统发育进化树也证明本研究中的分离菌株与西瓜噬酸菌的亲缘关系最近。

在调查中发现，甜瓜大棚中由于高温、高湿，病害比较严重，除了细菌性果斑病，由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的靶斑病对甜瓜叶片及果实为害也比较严重，还发现由镰刀菌（Fusarium solani）引起的根腐病等。本研究在少数果实的同一病斑上同时分离到细菌与真菌，其中细菌为西瓜噬酸菌，真菌经鉴定为多主棒孢。本次调查还发现，甜瓜生产上使用的杀菌剂种类多、施药频繁，个别大棚中使用的专门针对细菌病害的药剂就有5种以上，但还是未能有效控制细菌性果斑病。推测可能存在以下原因：一是甜瓜品种抗病性差异，本次调查以‘红冠品种发病最严重，同一大棚中，该品种全部发病，而另一甜瓜品种‘西州蜜的发病则很少；二是田间管理水平的差异，由于农业管理措施存在问题，在同一区域、相隔不到20 m不同种植户的大棚内，甜瓜病害发生就存在明显差异；三是有可能在杀菌剂选择压力下病原菌产生抗药性。因此，本研究在确定细菌性果斑病菌后，还需加强对该病害在海南甜瓜上的发病流行规律、致病机理进行深入研究。另外，针对海南甜瓜多种病害的发生，后续就上述可能存在问题，有必要展开更深入的调查及研究工作，以建立高效安全的综合防控措施，有效减轻和阻止甜瓜病害在海南进一步蔓延及为害。

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（责任编辑：张冬玲）