牙髓再生中根管消毒药物的浓度研究及进展

方 卉 李全利

2016年，美国牙髓病学者学会（American association of endodontist， AAE）将牙髓再生定义为：一种通过生物学手段替代受损牙齿结构（如牙髓-牙本质复合体、牙根结构和细胞等）的治疗方法。牙髓再生途径可以分为两类：一种是基于外源性干细胞移植技术的有细胞再生性牙髓治疗，另一种是基于内源性干细胞归巢技术的无细胞再生性牙髓治疗［1］。 其中无细胞再生性牙髓治疗是目前学者们认为更有可能实现临床转化的再生方式［2］。它是通过诱导根尖周内源性干细胞向根管内迁移、增殖和分化，以实现牙髓牙本质复合体的再生。可能细胞来源包括牙髓干细胞（dental pulp stem cells， DPSCs）、根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla， SCAP） 和骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BM-MSCs） 等［3］。

牙髓再生治疗的成功除了需要干细胞的参与外，还离不开良好的根管系统感染控制。但是，近年来一系列的研究显示，高浓度的根管消毒糊剂具有明显的干细胞毒性，会影响牙髓再生中干细胞的存活及分化［4-5］。所以为了提升牙髓再生治疗的成功率，临床亟需寻找合适的根管消毒药物浓度。本文将对牙髓再生治疗中根管消毒糊剂的浓度研究现状作一综述，并介绍部分新型抗菌策略。

1 根管消毒糊剂的种类

牙髓再生治疗中应用最广泛的根管消毒糊剂是Hoshino等［6-7］在1996年提出的三联抗生素糊剂（triple antibiotic paste，TAP）。TAP 由甲硝唑，环丙沙星和米诺环素组成的混合物，能够有效控制感染坏死的根管。但是由于米诺环素的存在会导致牙齿变色，所以又诞生了甲硝唑和环丙沙星组成的二联抗生素糊剂（double antibiotic paste， DAP）［8］。此外，2012年Ruparel 在传统三联抗生素糊剂的基础上提出使用头孢克洛替代米诺环素，并证明其对SCAP 具有良好的生物相容性9］。此方案和后来提出的使用克林霉素替代米诺环素［10］方案均被称为改良三联抗生素糊剂（modified-triple antibiotic paste， mTAP）。另有一些其它研究报道使用Ca（OH）2作为血运重建步骤中的根管消毒糊剂［11］，但是Ca（OH）2抗菌活性相对较弱，无法有效清除顽固性感染根管中的粪肠球菌。所以为了提高抗菌效果，2007年Pallotta等提出将氢氧化钙、甲硝唑及环丙沙星联合使用，简称为CMC（calcium hydroxide， metronidazole and ciprofloxacin）并证实CMC对粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和脆弱拟杆菌的抗菌效果强于氢氧化钙的单独应用［12］。

2 根管消毒糊剂浓度对干细胞的影响

2.1 TAP TAP 的干细胞毒性与其药物浓度及作用时间有关［13-14］。2012年，Ruparel 等发现当TAP 浓度为10～100 mg/mL时，SCAP 的细胞存活率＜20%；当TAP 浓度为1 mg/mL 时细胞的存活率约为58%，且随着药物浓度的进一步稀释（0.1～1 mg/mL）细胞存活率呈现明显上升趋势［9］。2014年Labban 等［15］通过乳酸脱氢酶细胞毒性检测法（LDH 检测法）和细胞增殖比色法（WST-1 检测法）对不同浓度TAP 的DPSCs 细胞毒性及细胞增殖影响进行了评估；实验结果发现，在不同浓度（5，2.5，2，1.51，1，0.5 和0.3 mg/mL）TAP 组中，当TAP 浓度高达5 mg/mL 时会对DPSCs 产生明显细胞毒性且造成细胞增殖率的显著下降。Jamshidi 等［13］对不同浓度TAP 在不同时间点对SCAP 的细胞毒性进行了研究，结果发现随着TAP 浓度（0.1～100 mg/mL）上升和反应时间（24 h、48 h 和72 h）延长，SCAP 细胞存活率呈现下降趋势，反应24 h 和48 h 时，10 mg/mL 和100 mg/mL TAP 组的SCAP 细胞存活率明显低于对照组（P＜0.05）；在72 h 时，1、10 和100 mg/mL TAP 均导致SCAP 细胞存活率明显下降。除此以外，最新研究还发现低浓度（0.1～0.8 mg/mL）TAP 也会对SCAP 活性及其牙源性分化潜能造成不利影响［16］，而此结论同目前AAE推荐使用的药物浓度（1～5 mg/mL）相矛盾。所以究竟是否需要进一步降低牙髓再生中TAP 药物浓度仍需要更多实验来证实。

2.2 DAP 与TAP 相比较，DAP（甲硝唑+环丙沙星）的抗菌效果降低，无法消灭感染根管中的粪肠球菌［11］。但是，研究发现甲硝唑和阿莫西林组成的DAP 对粪肠球菌的抗菌效果和TAP 相似。可能原因是阿莫西林作用于细菌的细胞壁，而环丙沙星是通过抑制DNA 的合成在细胞内发挥作用，所以前者可能比后者具有更强更快的杀菌作用［17］。

DAP 的干细胞毒性与TAP 相似，具有浓度相关性。Ruparel等［9］证明DAP 以剂量依赖性的形式引起SCAP 活力降低，并且当浓度低于0.1 mg/mL 时对细胞活力没有副作用。Jamshidi 在2021年的研究中指出当DAP 浓度≤1 mg/mL 时对SCAP 的存活没有显著负面影响，而相同浓度下TAP 比DAP 具有更高的细胞毒性［13］。2022年的最新研究发现低浓度（0.1～0.8 mg/mL）DAP对SCAP 活性及其牙源性分化潜能无不利影响［16］。甚至有学者证明低浓度抗菌药物可能对细胞生长和增殖发挥积极影响。Khoshkhounejad 等［18］分别对7 μg/mL（最小抑菌浓度）、31 μg/mL（最小杀菌浓度）和156 μg/mL（最小生物膜抑制浓度）DAP 的干细胞毒性展开研究，结果发现低浓度DAP 对SCAP 具有增殖促进作用。 所以未来对于DAP 在牙髓再生中研究可能更倾向于在保证其细胞相容性的同时提升DAP 药物浓度，实现其抗菌性和细胞相容性的兼顾。

2.3 mTAP mTAP 是针对传统TAP 中米诺环素导致牙体变色问题而衍生出的一种改良三联抗生素糊剂。Rahhal 等［19］分析了250、500 和1 000 μg/mL 三个浓度mTAP 对SCAP 的影响，发现所有浓度的mTAP 均导致细胞活性和分化潜能不同程度降低。其中250 μg/mL mTAP 组的细胞存活率最高（71.56%）。Ruparel等也证实100 μg/mL mTAP 对SCAP 没有细胞毒性［9］。除此以外，Saberi 等在2019年还研究了mTAP（头孢克洛）与氯己定混合后对SCAP 的细胞毒性影响，他们发现与氢氧化钙组对比，mTAP（0.125～10 mg/mL）组细胞存活最低，且在与氯己定混合后细胞毒性显著增加。TBE（Trypan Blue）和MTT 检测结果显示在使用浓度＞5 mg/mL mTAP 作为根管内封药时，无论是何种媒介都会造成细胞存活率下降至20% 以下［20］。所以，目前AAE 推荐在牙髓再生治疗中使用1～5 mg/mL 浓度的mTAP 作为根管内消毒药物。

2.4 氢氧化钙 Ca（OH）2是临床上最常用的一种根管消毒药物，它的抗菌活性依赖于与细菌的直接接触。Ca（OH）2对粪肠球菌和白色念珠菌的抗菌效果较差。但是有研究发现，当将Ca（OH）2基化合物颗粒添加到更复杂的配方中时，它的抗菌活性得到了提升，如商品化的UltraCal 糊剂（Ultradent Products，Inc.， South Jordan， UT， USA）已经被证实具有与TAP 一样的杀菌能力［17］。除此以外，近期还有学者发现将水杨酸和氢氧化钙混合后不仅能够提高其抗菌性能还对DPSCs 细胞活性无影响［21］。

与TAP、DAP 以及mTAP 相比较，相同浓度的Ca（OH）2对干细胞的不良影响最低［9，13，22］。Labban 等［22］发现Ca（OH）2对DPSCs 无细胞毒性的最高浓度是2.5 mg/mL。Jamshidi 等［13］发现Ca（OH）2在任何浓度（0.1、0.5、1 和10 mg/mL）以及时间点（24、48、72 h）对SCAP 都不具有细胞及基因毒性，并且在浓度为1 mg/mL 时能有效促进细胞增殖。原因可能是低浓度Ca（OH）2上调磷酸化细胞外信号相关激酶，而这正是牙髓细胞和牙周膜干细胞的一个增殖标记。Selis 甚至提出Ca（OH）2作为临床牙髓学根管内用药的金标准［23］。

3 新型根管抗菌策略

牙髓再生是一项以干细胞为基础的治疗方法，控制根管感染与创造干细胞再生所需微环境至关重要［24］。虽然目前临床上提倡使用低浓度的根管消毒糊剂，但其是否实现了生物相容性消毒与牙本质-牙髓复合体可预测性再生的完美结合仍具有争议。因此，部分学者仍致力于探寻新型抗菌策略，其中就包括天然抗菌材料和人工合成抗菌材料。

3.1 天然抗菌材料

3.1.1 蜂胶 蜂胶不仅具有广谱抗菌活性［25］，还具有抗氧化、抗龋坏和抗炎的特性［26］。早在2011年开始蜂胶树脂材料就被提倡作为漱口水［27］、牙膏［28］的天然添加成分。研究还发现，蜂胶可以预防龋齿、菌斑形成［29］，可以作为牙齿撕脱后的细胞保存介质［30］以及牙髓暴露的处理剂［31］。2023年一篇系统性综述对蜂胶的抗粪肠球菌性能进行了分析比较，结果发现蜂胶作为根管内用药时表现出比Ca（OH）2更强的抗粪肠球菌效果［33］。关于蜂胶在牙髓再生治疗中的效果，有报道指出浓度≤4 mg/mL 的蜂胶对牙髓及牙周膜成纤维细胞的细胞毒性比Ca（OH）2至少低10倍［32］。当在动物体内牙髓再生研究中使用蜂胶作为根管内封药时，其带来的软硬组织沉积效果与TAP 相似，甚至优于TAP结果［34］。

3.1.2 壳聚糖基颗粒 壳聚糖是一种阳离子天然无毒化合物，目前已经被广泛用作药物载体，具有良好的生物相容性、降解性及无毒性。一项研究中使用壳聚糖作为TAP 和Ca（OH）2颗粒的载体，当与使用生理盐水作为载体相比较时，发现壳聚糖基化合物的抗菌效果明显高于后者［35］。而这一发现可以通过壳聚糖分子固有的可能抗菌作用机制来解释。因为壳聚糖中带正电的氨基葡萄糖NH3+可能与带负电的细菌表面成分相互作用，继而改变细胞通透性，导致细胞死亡。Ducret 等人在体外实验中使用新型富含壳聚糖的纤维蛋白水凝胶，发现壳聚糖的加入更有利于促进人牙髓组织再生，并且对牙髓细胞的形态、活力、增殖以及胶原基质的产生无有害影响［36］。

3.1.3 石墨烯基材料 石墨烯是近年来发展起来的，一种由碳原子紧密堆积成的单层二维蜂窝状晶格结构的新型材料。因其独特的机械性能、电化学物理性质（如机械强度、高比表面积、热稳定性及独特的表面特性）以及抗菌性能而具有广泛的生物医学应用价值［37-39］。尤其是在组织工程方面，它不但表现出良好的生物相容性，还能够促进和维持干细胞生长及分化［40］。为了研究石墨烯对牙髓组织再生的影响，Rosa 等［41］对DPSCs 在氧化石墨烯基基底上的增殖和分化潜能展开了研究，结果发现氧化石墨烯基组的DPSCs 表现出细胞牙源性基因表达上调。除此以外，近年来为了增强根管消毒能力，还在氧化石墨烯基质上合成出了AgNPs 并证实其在抗菌活性及破坏生物膜方面都具有理想效果［42］。

3.2 人工合成抗菌材料

3.2.1 生物活性玻璃 生物活性玻璃是一种表面活性材料，具有促软、硬组织再生的能力［43］。据统计，迄今为止，至少有25 种生物活性玻璃已被批准用于临床，其用途之广涉及骨空隙充填，牙本质过敏，伤口敷料以及癌症治疗等［44］。其中纳米生物活性玻璃因其独特的理化性能（比表面积大，生物降解能力快，生物活性离子释放快）以及卓越的生物活性更是引起牙齿组织再生研究的广泛关注。研究发现纳米生物活性玻璃能够募集干细胞向牙本质迁移并促进细胞附着、牙源性分化，最终形成牙髓-牙本质样组织［45］。除此以外，生物活性玻璃还可以通过添加抗菌剂和再生制剂来实现功能化，如一项研究成功合成了Ag-MBGs，并对其根管内抗生物膜活性进行评估，发现Ag-MBGs 通过银离子的释放对粪肠球菌具有良好的抗菌效果［17］。而Ag-MBGs 对牙髓再生治疗中干细胞的影响尚需进一步研究。

3.2.2 抗生素洗脱纳米纤维 近年来，通过静电纺丝技术，牙科领域已成功建立出含抗生素的纳米纤维药物递送系统［17］。电纺纳米纤维作为低浓度抗生素缓释的载体能创造出更有利于组织再生的无菌环境。Bottino 等人在近期一项实验中构建出3D管状TAP 洗脱纳米纤维，并证实其能够很好的适应根管形态，实现良好的感染控制以及促根尖愈合［46］。

4 小结与展望

目前，临床上用于牙髓再生治疗的根管消毒糊剂主要是三联抗生素糊剂、二联抗生素糊剂和氢氧化钙糊剂。虽然高浓度的抗生素组合糊剂表现出较强的根管消毒能力，但同时也带来了干细胞细胞毒性影响，所以AAE 更推荐使用低浓度（1～5 mg/mL）抗生素作为牙髓再生根管内封药。但也有研究发现即使是AAE 推荐的低浓度TAP 依然具有细胞毒性［16］，所以仍需更多研究确定其结论的准确性。氢氧化钙糊剂对某些细菌的抗菌效果虽然不如抗生素糊剂，但其对干细胞的毒性较低，能促进牙本质中重要的生物活性生长因子释放，增强干细胞存活和增殖能力，所以近年来也被提倡应用。

然而，因为目前牙髓再生治疗中，根管消毒药物浓度对根尖乳头干细胞的毒性影响的体外研究一直局限于生理条件下，没有考虑到细胞在接触抗菌药物之前可能已经处于被细菌副产物刺激的激活状态。细菌的副产物，如脂多糖、脂磷壁酸，能够激活残余细胞导致炎症介质产生，这激活的免疫反应又会对根尖乳头干细胞的药物毒性反应产生影响。如2019年Sipert 等［47］研究就发现，改良的环丙沙星、甲硝唑、氢氧化钙混合物对人类根尖乳头干细胞没有表现出细胞毒性，但在粪肠链球菌的副产物—脂磷壁酸预处理后却表现出了细胞毒性。因此，在今后的牙科材料细胞毒性测试研究中，我们有必要强调考虑细胞微环境的重要性。

另一方面，为了避免传统根管消毒药物对牙髓再生带来的不利影响，大量新型根管抗菌策略相继出现。它们虽然表现出良好的生物相容性根管消毒能力，但仍缺乏精心设计的体外和体内研究，尤其是随机临床试验。所以在寻找牙髓再生治疗成功的道路上，我们依然是任重而道远。