Wnt信号通路在急性心肌梗死中的研究进展

杨寿娟 张海涛 崔明丽 王建 李洋 程艳丽

1滨州医学院附属医院心内科，滨州 256603；2滨州医学院附属医院神经外科，滨州 256603

急性心肌梗死（AMI）是常见的急性心血管事件之一，通常是动脉粥样硬化斑块不稳定发展的结果，即纤维帽破裂并将斑块的内容物释放到血液循环中［1］。然而，心肌梗死也可能是斑块侵蚀所致的远端栓塞或冠状动脉痉挛的结果［2］。由于血液流动中断，受缺血影响的心脏区域缺乏氧气和营养物质，导致该区域的心肌细胞坏死。

尽管在心脏中发现了干细胞，但梗死区域的修复并不会引起坏死的心肌明显再生［3］。最初的反应包括多形核中性粒细胞和巨噬细胞的炎症反应，这些细胞的功能是清除梗死区域的坏死碎片，这是修复梗死区域重要的第一步。炎症阶段之后是肉芽组织的形成，肉芽组织通常富含肌成纤维细胞和新形成的血管，嵌在组织疏松的细胞外基质中。肉芽组织中的肌成纤维细胞有不同来源，如原位成纤维细胞、循环成纤维细胞或内皮上皮间质转型（EMT）的心外膜细胞。由于其独特的收缩和基质合成特性，肌成纤维细胞在替代丢失的心肌细胞过程中发挥着重要的作用［4］。肉芽组织的肌成纤维细胞减少，细胞外基质的数量和交联增加，逐渐发展为瘢痕组织［5］。

Wnt 信号通路（Wingless Integrated signaling pathway）是由多种信号分子介导的信号转导途径的复杂集合，参与调控细胞的生长、增殖、分化、癌变、凋亡、应激等多种病理过程，是调控心脏和血管发育的重要信号通路。Wnt 通路经合成Wnt 蛋白影响下游的信号分子产生级联反应，最终调控靶基因的表达。Wnt 信号传导不仅具有大量配体、受体和协同受体的特征，而且可以在许多不同的水平上进行调控。Wnt 信号通路可分为经典通路和非经典通路。在经典通路中，Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号组成成分包括Wnt 配体、卷曲蛋白（FZD）家族受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）、LRP6、β-catenin 破坏复合物［包括轴蛋白（Axin）复合物、大肠腺瘤性息肉病基因产物（APC）、酪蛋白激酶（CK）1α 和糖原合酶激酶3（GSK3）］、钙粘蛋白相关蛋白（如β-catenin）、T 细胞因子（TCF）和淋巴增强因子（LEF）等。当存在Wnt信号时，Wnt配体与LRP-5/6受体和FZD受体的结合触发了β-catenin 依赖性信号通路，激活Dishevelled（DVL）蛋白，导致Axin、CK1α和APC组成的复合物募集到受体，通过基因转导以及TCF/LEF 转录因子诱导Wnt 最终作用的目标基因转录，诱导后续细胞反应的发生。非经典通路可以分为平面细胞极性通路（PCP）和Wnt/Ca2+信号途径。其组成是Wnt 配体以及FZD 家族受体、蛋白质酪氨酸激酶等信号物质。通过这些信号物质的层层传递，最终触发PCP 信号通路。在体内还通过受体FZD 及配体的结合激活整个Wnt/Ca2+信号通路［5］。从以下几个方面阐述Wnt信号通路在AMI发展过程中发挥的重要作用。

Wnt表达和分泌的调节作用

Wnt 信号在心脏发育过程中特别活跃，相比之下，健康成人心脏中的Wnt 信号通路是静止的，而心肌梗死后这条信号通路会被激活，因此可以通过干预该途径，进而促进心肌梗死后梗死区的愈合［6］。这种变化发生在心脏的病理重塑过程中，许多胎儿基因包括Wnt信号的成分被重新激活。在心肌梗死小鼠模型中，通过冠状动脉的手术结扎模拟了人类心肌梗死的潜在病理，调控Wnt 通路多个基因的表达已被报道，这包括Wnt2、-4、10-b 和-11 的表达上调和Wnt7b 的下调；此外，发现FZD1、-2、-5、-10 的表达增加，FZD8 的表达降低［7-8］。Mizutan M 等［9］使用原位杂交技术监测新生小鼠低温损伤模型中19 个Wnts 的表达，研究发现，损伤心外膜层的Wnt2b 和Wnt5a 以及Wnt9a 表达上调的程度较低，Wnt3a、-4、-5b、-6、-8a、-9b 和-10b 在损伤心肌中表达上调，而Wnt8b、-10a、-11 和-16 在损伤心肌和未损伤心肌中表达相似。这些结果证明了Wnt信号在损伤心肌中的调节作用，也强调了年龄（新生儿与成人）和损伤模型（低温损伤与冠状动脉结扎）对Wnt 基因表达模式的潜在影响［10］。

既往研究探讨了调控Wnt表达或分泌对梗死愈合的影响［11］。对心肌细胞特异性过表达Wnt10b 的小鼠模型进行冠状动脉结扎和冷冻损伤，观察到梗死区新生血管的增加，瘢痕变小，肌成纤维细胞减少，心室功能改善［12］。在小鼠心肌梗死模型中也报道了类似的有益结果，该模型中Wnt11 通过腺相关病毒介导的过表达而过表达，梗死心脏的炎症反应显著减少［8］。巨噬细胞特异性缺失Wnt 配体转运蛋白Wntless（WLS）（csfm-icre；Wlsfl/fl小鼠）也可导致炎症反应减弱和新生血管增加。WLS 缺陷巨噬细胞显示出M2表型，可刺激修复和生成血管［13］。通过对小鼠心肌梗死模型静脉注射膜结合 O- 酰基转移酶（PORCN）抑制剂GNF-6231 来干扰Wnt 蛋白的脂化，还可以减少梗死面积，抑制不良重构，并减少心功能下降。在心肌梗死诱导后1 周，PORCN 抑制剂Wnt-974 被口服灌胃给梗死小鼠。研究人员观察到心肌的促再生反应和胶原蛋白Ⅵ依赖的抗纤维化治疗效果，认为PORCN 抑制可能是一种有前途的治疗策略，以阻断心肌梗死患者的病理重塑［14］。另一方面，在梗死区域的边界直接注射重组Wnt3a 蛋白，已证明对梗死愈合有不利影响，因为这种治疗被发现可以抑制心脏侧群细胞的增殖［11］。从这些研究中可以得出结论，对Wnt 的处理和分泌进行更全面的干预会导致更好的梗死愈合，但需要更多的研究来确定单个Wnt基因对伤口愈合过程的积极和消极作用。

分泌卷曲相关蛋白（sFRPs）水平的调节

sFRPs 被认为是主要作为Wnt 信号的负调节因子。Barandon 等［15］证实了心肌梗死后sFRP1 的表达上调，在过表达sFRP1 的牛同源物FrzA 转基因小鼠中，证明了FrzA 对心肌梗死后的梗死面积和心功能存在有益作用，有益作用可归因于心肌细胞凋亡、细胞浸润和改善瘢痕中的毛细血管密度。将过表达sFRP1 的小鼠骨髓细胞移植到野生型白受体中，随后进行心肌梗死，也得到了类似的结果［7］。sFRP1 能够通过促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子表达的平衡来减少缺血后中性粒细胞浸润，从而减少瘢痕形成、降低心脏破裂发生率和维持心脏功能［16］。据报道，在中国汉族人群中，sFRP1 基因变异与心肌梗死风险增加相关［17］。在缺血/再灌注损伤小鼠模型中，也描述了sFRP5 的抗炎和抗凋亡作用，支持sFRPs对梗死愈合的有益作用［18］。

sFRP2 被证明是干细胞分泌的一种旁分泌因子，可激活心肌细胞中的抗凋亡基因表达谱［19］。据报道，在大鼠梗死心肌中直接注射重组sFRP2 具有抗纤维化和改善心功能的作用［20］。研究还发现，sFRP2 有助于间充质干细胞（MSCs）的植入，而在梗死小鼠的边界区注射过表达sFRP2 的MSCs 可以促进伤口愈合和改善心脏功能［21］。另一方面，与野生型相比，缺乏sFRP2 基因的小鼠在心肌梗死后也显示出纤维化减少和心功能改善［22］。这些不同研究的矛盾结果可以用sFRPs 的多种作用模式来解释，一些关于sFRPs 的研究也给出了相互矛盾的结果，基于许多研究，人们提出了四种sFRPs 调节Wnt 信号的机制，其中两种是抑制的，两种是促进的：（1）通过清除Wnt 蛋白，抑制信号，因为Wnt 无法与受体相互作用；（2）形成同源或异质sFRP 复合物，有利于Wnt 信号；（3）与FZD 的半胱氨酸富集区（CRD）直接相互作用，抑制Wnt 信号；（4）将Wnt 与网络相关基序结合，将Wnt呈现给FZD的CRD，刺激Wnt信号［23］。

对受体复合体的干预

Wnt受体复合物是由与受体LRP5/6或受体酪氨酸激酶样孤核受体2（ROR2）密切相关的FZD 蛋白家族成员组成的。利用永久性冠状动脉结扎诱导的心肌梗死大鼠模型，描述了Wnt/FZD 信号系统成员FZD2的表达上调，在心肌梗死后7 d 达到峰值。FZD2 的最高表达最初定位于梗死边界区，并向梗死中心扩展，伴有肌成纤维细胞浸润［24］。通过无偏性G 蛋白偶联受体反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）筛选，证实了FZD2 和-4 在心脏成纤维细胞中的高水平表达［25］。在大鼠心肌梗死模型中观察到信号转导分子DVL1 类似的表达动力学，支持了伤口愈合过程中激活Wnt信号的概念［26］。后有研究表明，心肌梗死后，更多FZD家族成员的表达受到调控：FZD1、-2、-5 和-10 表达上调，而FZD8在心肌梗死后7 d表达下调［15］。

目前，在FZD 受体水平上对Wnt 信号传导的药物干预选择非常有限，研究表明Wnt3a和Wnt5a肽段对Wnt信号通路有拮抗作用；在永久性冠状动脉闭塞小鼠模型中测试了皮下输注UM206（Wnt5a的13个氨基酸肽）对梗死愈合的影响。在心肌梗死诱导后直接开始，通过渗透性微型泵给药，并在心肌梗死后5 周评估其效果；UM206 可减少左心室扩张，改善心脏功能，防止心力衰竭的进展；组织学分析显示，梗死面积更小、更厚，肌成纤维细胞数量增加［27］。在UM206 处理的心脏缺血/再灌注损伤的猪中也观察到梗死扩展的衰减，并随访5 周；然而，在这项研究中，梗死区域的肌成纤维细胞数量减少，正如在小鼠中观察到的；此外，UM206治疗组的心功能并不比对照组好［28］。在这两项研究中观察到的梗死扩展衰减表明，Wnt 通路可能是改善梗死愈合和抑制心肌梗死后重构的一个希望靶点。

近几年的研究中，研究了LRP5/6 共受体对梗死愈合的影响［29］。这些辅助受体特异性参与了Wnt/β-catenin 信号转导。在猪缺血再灌注模型中，发现LRP5仅在高胆固醇饮食喂养的动物中表达增加，而在正常胆固醇饮食组中没有增加［30］。β-catenin 向细胞核的易位，以及Wnt 靶基因骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2 的表达增加，证实了该组Wnt/β-catenin信号通路的激活，同时发现LRP5的缺失对小鼠的梗死愈合有不良影响；此外，与扩张型心肌病相比，缺血性心肌病移植的人类心脏表达更高水平的LRP5 和β-catenin［31］。这些结果可以通过携带心肌细胞特异性LRP5 和6 缺失的小鼠来证实［32］。迄今为止，没有关于共受体ROR2在梗死愈合中的作用研究发表。

在最近的研究中，LRP5/6 抑制剂家族血清分泌型蛋白（DKK）成员在心肌梗死中的作用已被阐明；与非ST 段抬高心肌梗死患者相比，ST 段抬高心肌梗死患者血浆DKK1 水平更高，可作为主要不良心血管事件的独立预测因子［33］。在小鼠梗死区边缘注射纯化的DKK1 蛋白可加重缺血损伤，并在心肌梗死后4 周增加纤维化标志物的表达，然而这种治疗并不影响心功能［32］。研究发现，DKK1 和DKK2 对血管生成有相反的作用，而在边缘区注射DKK2 蛋白可增强梗死区域的新生血管形成，同时改善心脏功能［34］。在培养的心脏成纤维细胞中，DKK2 以Wnt/β-catenin 依赖的方式减少肌成纤维细胞的增殖和分化，这种效应可以被微小RNA-154 的过表达所拮抗［35］。研究发现，DKK3 基因的整体缺失可促进细胞凋亡、炎症和重构，心肌细胞特异性过表达DKK3［α-肌球蛋白重链（α-MHC）启动子］则产生相反的作用［36］。在一项基于适配体的心血管疾病候选生物标志物的研究中，DKK4 在肥厚性心肌病患者计划的室间隔消融（一种引起心脏缺血的手术）后10 min 和60 min 上调，在发生自发性心肌梗死的心血管疾病患者Wnt 信号通路中，可证实循环中的DKK4 水平升高［30］。虽然这些研究并没有显示DKK 家族的不同成员在梗死愈合中的统一作用，但它们清楚地强调了Wnt/β-catenin 信号在与心脏重塑和梗死愈合相关过程中的重要性。

β-catenin破坏复合体

在静息状态下，β-catenin 不断被β-catenin 破坏复合物降解，保持其细胞内较低水平。这涉及到CK1和GSK3随后的两个磷酸化步骤，分别为该蛋白准备泛素化和降解。利用遗传模型研究了GSK3 的两种亚型（GSK3α 和-β）在心肌梗死后重塑中的作用。由于完全敲除GSK3β 是胚胎致命的，这些研究使用了诱导型心肌细胞特异性GSK3β 缺失［α-MHC 启动子控制下的Cre 重组酶（mer-Cre-mer）］［37］。尽管梗死面积相似，在心肌梗死后5 d基因缺失导致心肌梗死后8 周时与对照组相比，GSK-3α 的心脏特异性敲除小鼠的左室扩张减少，左室功能保存更好。诱导远端心肌肥厚可能支持其对心功能的有益作用［38］。与GSK3β 相比，GSK3α基因的整体缺失并不影响小鼠的发育或寿命［37］。然而，当这些小鼠发生心肌梗死时，我们观察到梗死引起的心脏破裂导致死亡率增加，左室扩张增强和心功能减弱。此外，由于梗死边界区细胞凋亡增加，梗死面积增加［39］。值得注意的是，心肌细胞特异性缺失GSK3α 对梗死愈合有相反的作用，它能更好地保护心功能，并在边缘区有更多存活的心肌细胞［38］。后者可能与心肌细胞凋亡减少和心肌细胞增殖率升高有关［40］。然而，心肌细胞特异性缺失GSK3α 和GSK3β［α -MHC 启动子控制下的 Cre 重组酶（mer-Cre-mer）］，导致左心室自发性扩张和心功能下降［41］。由于这两个GSK3 同源物非常相似，且没有亚型特异性药物，这一观察结果可能会质疑GSK3抑制剂在AMI治疗中的有效性［37］。

目前暂无研究表明通过基因干预来解决CK1在梗死愈合中的作用。然而，另一种替代和转化上有趣的方法是使用食品和药物管理局批准的化合物吡啶。该化合物被登记为一种抗蠕虫药物，但它已被证明通过激活半抑制浓度约为10 nm的CK1α来抑制Wnt信号通路［42］。心肌梗死后30 d，单次心肌内注射吡啶可增加分化心肌细胞的增殖，改善不良心脏重构，并限制左室扩张。然而，由于心内给药吡啶的毒性，死亡率增加，且没有发现心功能的显著改善［43］。在另一项研究中，吡啶被证明可以降低心脏成纤维细胞的存活率，特别是在低糖条件下；梗死后第1 天至第14 天口服磷酸吡啶悬液可减少心肌梗死后第4天和第14天梗死心脏纤维化和瘢痕形成，且射血分数优于小鼠；研究还表明，口服将是该药物的优先给药途径［44］。

β-Catenin介导的基因转录

在Wnt/β-catenin 信号通路中，β-catenin 的核积累和参与增殖和信号蛋白存活的基因转录调节是Wnt/β-catenin信号通路的最后步骤。Wnt/β-catenin报告基因小鼠的可用性为观察梗死区β-catenin 介导的Wnt 信号通路激活提供了机会。通过使用由Axin2启动子驱动的报告基因β-半乳糖苷酶基因（LacZ）小鼠，发现边界区的LacZ+细胞数量在心肌梗死后第7 d至第21 d之间显著增加。共染色结果显示，LacZ+细胞共表达造血干细胞抗原（造血干细胞）、血小板内皮细胞粘附分子（CD31）（内皮细胞）、白细胞共同抗原（白细胞）、血管性血友病因子（内皮细胞）和a-平滑肌肌动蛋白（肌成纤维细胞），表明Wnt 信号在多种细胞类型中被激活［45］。在一个LacZ 表达由TCF/LEF 反应启动子（TOPGAL小鼠系）驱动的模型中，其梗死的边界区和心外膜侧可观察到类似的LacZ 表达，心肌梗死后诱导内皮到间充质转化（EMT），并导致心肌梗死后心脏纤维化［46］。心脏纤维化是心肌梗塞后的修复过程，引起心脏重塑，最终导致心力衰竭。心肌梗死后血浆中Wnt 信号拮抗剂sFRP3 显著下降，AMI 后血浆中sFRP3 的降低通过增加转录因子叉头框蛋白M1（FOXM1）促进二尖瓣瓣膜内皮细胞的EMT。心肌梗死后，恢复sFRP3 水平或抑制FOXM1 可能提供了一种调节二尖瓣中EMT 以预防缺血性二尖瓣反流和心力衰竭的新策略［47］。最近，在TCF/LEF 敏感启动子的大鼠模型中，使用了由铁结合人铁蛋白重链和绿色荧光蛋白（GFP）组成的MRI探针，该结构通过9 型腺相关病毒载体局部注射传递到梗死心脏［48］。心肌梗死后4 周，在转导心脏梗死的边界区可检测到铁的积累。组织学分析证实了铁和GFP 信号的共定位。使用化合物SEN195 抑制Wnt/β-catenin 信号，完全消除铁信号。联合研究为心肌梗死后第1 周梗死边缘的Wnt/β-catenin 信号激活提供了证据，涉及多种细胞类型［48］。

锌指蛋白667（ZNF667）是一种广泛表达的N端含有KRAB结构域、C端含有多个C2H2型锌指结构的KRAB/C2H2-锌指转录因子型，可预防缺氧缺血性心肌损伤。研究报道了AMI 小鼠心脏中CD31 阳性内皮细胞中ZNF667 的表达上调，缺氧激发（1%氧气）以时间依赖性方式促进ZNF667在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中的mRNA 和蛋白质表达；此外，ZNF667 促进了缺氧诱导的HUVECs 侵袭和血管形成，ZNF667通过血管抑制素1的转录抑制和Wnt信号通路的调节促进心肌缺血驱动的血管生成。促血管生成被认为是治疗AMI的一种希望策略［49］。

在心肌细胞和心脏成纤维细胞中，β-catenin 组成活性形式的腺病毒基因转移诱导心肌细胞增殖，而在前一种细胞类型中观察到肥大和双核。在成纤维细胞中，观察到肌成纤维细胞的分化增强。在梗死大鼠心脏的边界区注射腺病毒，由于心肌成纤维细胞和心肌细胞的凋亡与细胞周期激活减少，导致梗死面积减小［50］。研究表明，在心脏缺血再灌注损伤过程中，甲基转移酶样蛋白14（Mettl14）通过甲基化Wnt1 mRNA，以N6-甲基腺苷依赖的方式上调Wnt1蛋白表达，激活Wnt/β-catenin 信号通路，从而减轻心肌缺血/再灌注时心肌细胞损伤和心功能障碍，因此Mettl14 有望成为缺血性心脏病的治疗靶点［51］。然而，心肌细胞特异性β-catenin 缺失（aMHC-Cre PR1 模型）也被报道对存活和左心室功能产生有益的影响，此外小分子Wnt 信号抑制剂CDMG1，β-catenin 水平降低的梗死心脏显示心肌细胞产生增加和纤维化减少，CDMG1 治疗后左心室射血分数明显增加［52］。小分子Wnt信号调节剂ICG-001对β-catenin介导的转录进行药理学抑制，导致雌性大鼠心肌梗死10 d后射血分数提高［53］。基于这些研究的综合结果，在心肌梗死后是否应该刺激或抑制β-catenin 信号有待进一步深入研究。

AMI 引起的缺血性坏死通常是不可逆的，而心肌细胞自身再生能力有限。干细胞作为一种未分化的细胞，能够分化成具有特殊功能的各类成熟细胞［54］。目前，在MSCs治疗AMI 研究比较多。骨髓间充质干细胞移植可用于治疗AMI，且通过激活Wnt/β-catenin通路实现［55］。

综上所述，Wnt 信号机制在心肌增殖、分化、修复、重构等病理生理过程中均起着重要作用，Wnt 信号经典通路与AMI 关系紧密，明确Wnt 通路的信号网络及作用机制，抓好通路的每一个重要节点，将为AMI 的精准治疗提供更多新思路和可能性。

作者贡献声明杨寿娟：起草文章，对文章的知识性内容作批评性审阅；张海涛、崔明丽：采集数据；王建、李洋：分析/解释数据；程艳丽：指导，支持性贡献