发酵对蛋白质组成、结构与功能特性及风味影响的研究进展

王晓雯,王灵娟,王哲,秦晓娟,张新笑,徐为民,王道营*,邹烨*

1(江苏大学 食品与生物工程学院,江苏 镇江,212013)2(江苏省农业科学院农产品加工所,江苏 南京,210014)3(南京钦润生物科技有限公司,江苏 南京,211103)

发酵技术在食品工业有着广泛的应用,微生物的发酵作用可使食品原料发生生物化学变化。细菌、酵母和霉菌等微生物利用部分底物生长和繁殖,并用代谢产物来丰富底物,来自微生物的酶,特别是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶,水解蛋白质、多糖和脂质后产生防止食物变质和改善食品品质的化合物,创造高附加值的产品[1]。其中蛋白质作为一种非常复杂的生物大分子结构,是食品中六大营养物质之一,为人体生命活动提供必要的能量,促进生长发育的同时增强人体免疫力,所以研究发酵过程对蛋白质结构、功能和营养等方面的影响具有重要意义,为创造高营养价值的发酵食品提供理论指导。目前,国内外学者在发酵对食品本身的品质、风味和营养价值等方面影响的报道较多[2-4]。但有关发酵对食品中蛋白质各方面影响的研究报道较少,本文就发酵对蛋白质组成、结构与功能特性及风味影响进行了综述。

1 发酵对蛋白质组成及结构的影响

蛋白质是一种具有复杂构象的物质,其空间结构由氨基酸脱水缩合成肽链后经盘曲折叠而形成。发酵过程促进大分子质量蛋白质水解,pH、温度及发酵菌种等条件通过对蛋白酶及肽酶的影响改变着食品中蛋白质的组成和结构,又蛋白质的特定结构决定着蛋白质的功能特性,食品的质构特性及风味口感发生改变,提高了蛋白质的利用率,增加了食品的营养价值。

1.1 对蛋白质分子质量的影响

十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)通常用于蛋白质分子质量的检测,该方法具有微量快速、重复性好、操作简单等优点。食品在发酵前后,蛋白质与SDS结合根据其电泳迁移率不同得出蛋白质分子质量的变化,由于发酵过程中蛋白酶的作用导致蛋白质被逐步降解,在电泳图谱中,大分子质量条带随发酵时间的延长逐渐消失。

WU等[5]研究了豆浆发酵(37 ℃,24 h)和贮存(4 ℃,1～21 d)过程中蛋白质分子质量分布变化,结果表明发酵导致高聚集蛋白(>1 000 kDa)的断裂和小肽的产生。OLUKOMAIYA等[6]通过SDS-PAGE图谱发现,发酵后菜籽粕样品中大尺寸蛋白质(37～60 kDa)的条带强度降低,且产生更多的小分子蛋白质或肽(<35 kDa)。WANG等[7]也在微生物发酵菜籽粕的研究中发现,发酵后菜籽粕蛋白被降解为小分子肽。GE等[8]在植物乳杆菌对发酵香肠蛋白质影响的研究中发现,香肠发酵过程中,130～250 kDa、100～130 kDa和25～35 kDa范围内的肌浆蛋白条带发生了显著变化(P<0.05),高分子质量蛋白质在发酵过程中被降解。

1.2 对氨基酸含量的影响

氨基酸是蛋白质的基本组成单位,其在食品加工过程中的改变影响着食品的风味及营养价值。其中膳食蛋白质中必需氨基酸含量及占比越接近人体蛋白质组成时,越易于人体的消化吸收,蛋白利用率则越高。游离氨基酸作为一种呈味物质,其含量和种类常作为食品营养价值和口感、滋味评价的重要指标[9]。

LIU等[10]在植物乳杆菌发酵核桃乳的过程中使用氨基酸分析仪对游离氨基酸含量进行检测,随着发酵程度的增加,苯丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的含量呈上升趋势,游离氨基酸总量先升高后降低,与未发酵的核桃乳相比,发酵结束的核桃乳中异亮氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甘氨酸和组氨酸的含量分别降低了93.31%、90%、85.71%、55.79%和45.02%。游离氨基酸含量降低可能是发酵后期的酶促转化等复杂反应导致产物降解生成挥发性酸、胺和其他含氮物质的结果。CHEN等[11]在不同菌种发酵对香菇鲜味的影响研究中发现,25 ℃发酵过程中游离氨基酸呈上升趋势,微生物代谢期间的消耗、细菌的自溶现象以及一些酶促转化反应都可能是游离氨基酸含量变化的原因。DEUS等[12]研究了可可豆发酵过程中氨基酸的变化,结果表明,发酵期间低pH值激活内源性蛋白水解酶、天冬氨酸内切蛋白酶和羧肽酶,其将贮藏蛋白(主要是豌豆球蛋白)水解成游离氨基酸和肽,提高了游离必需氨基酸和疏水性氨基酸的含量。

食品在发酵过程中,由于微生物的水解作用,大分子的蛋白质降解为多肽及小肽,小肽继续降解成为游离氨基酸,且菌种类型不同则蛋白质的水解指数也有所不同,影响着游离氨基酸的含量。随着发酵时间的延长,游离氨基酸总量显著增加,但不同氨基酸变化趋势有所不同,在发酵后期可能由于进一步降解而导致游离氨基酸含量有下降的趋势,最终影响着发酵食品的感官风味。

1.3 对蛋白质二级结构的影响

蛋白质二级结构是多肽链中邻近的氨基酸残基由于氢键相互作用而形成的空间结构,多肽链的折叠方式包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲。蛋白质二级结构的测定方法主要是傅立叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)和圆二色谱分析法。红外光谱可以反映肽链的结构变化,二级结构清楚地反映在酰胺I和酰胺II波段,特别是前者[13]。酰胺I区域(1 600～1 700 cm-1)通过检测氨基酸羧基的振动来测量蛋白质的二级结构,光谱的这一区域包括主要二级结构的波段:α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)和β-折叠(1 630～1 638 cm-1)。圆二色性利用远紫外区域的偏振光偏振角来测定蛋白质的二级结构,利用近紫外区域的偏振光偏振角来测定蛋白质三级结构的变化[14]。

ALROSAN等[15]在发酵扁豆蛋白的研究中利用FTIR测得未发酵扁豆-酪蛋白复合物二级蛋白结构组成:α-螺旋(9.90%)、β-折叠(30.90%)、β-转角(43.87%)、无规则卷曲(15.32%)。发酵后α-螺旋与无规则卷曲组分的比例变化显著,β-折叠和β-转角无显著差异。其中α-螺旋的百分比从9.90%显著降低至6.58%。YANG等[16]在植物乳杆菌发酵大豆分离蛋白的研究中发现,发酵使得α-螺旋和无规则卷曲含量显著降低,而β-折叠和β-转角含量显著增加,其中α-螺旋结构受体系中氢键稳定性的控制,若静电斥力降低导致氢键不稳定,则α-螺旋结构的含量降低。蓝天婵等[17]研究了产黄青霉发酵鸭肉制品的结构变化,拉曼光谱的结果表明,α-螺旋结构的含量减少,β-折叠结构的含量相对增加,β-转角和无规卷曲无明显变化。LIU等[18]在鹰嘴豆蛋白发酵过程中发现,发酵后α-螺旋含量显著增加,β-折叠含量显著降低。

发酵对蛋白质二级结构的影响相较于加热和加压等其他食品加工处理方式具有更积极的影响,通常会刺激微生物活动产生有益的效果,通过提高蛋白质消化率而增加食物营养价值[14]。发酵过程使蛋白质二级结构重组,大多数情况下,发酵过程会使得α-螺旋结构的含量降低,β-折叠和无规则卷曲的含量增加[19]。此外,β-折叠的增加与蛋白质消化率呈显著负相关,还有研究表明蛋白疏水性随β-折叠和无规则卷曲成分的增加而增加。在微生物发酵过程中,蛋白质的水解、降解和重组可能或多或少的发生,这取决于温度、pH值以及酶活性增加等综合影响。因此,发酵诱导蛋白结构变化并提高其质量主要是由于食品中可利用的微生物酶和内源酶的激活[20]。

1.4 对蛋白质疏水性及二硫键的影响

蛋白质中包含疏水和亲水的两种氨基酸,由于二硫键的锁定作用,肽链盘曲折叠时疏水基团被包裹在分子内部,二硫键限制着蛋白质分子结构的伸展,使蛋白质具有紧密的三维结构,决定着蛋白质的致密性、稳定性和功能特性[21]。发酵改变蛋白质分子的结构,因此巯基和二硫键的相对含量发生不同程度的改变。

常荣等[22]在研究发酵对酸肉蛋白质结构的影响中发现,发酵诱导蛋白变性利于分子结构展开,包藏在内部的疏水基团暴露,蛋白质分子间发生疏水聚集且表面疏水性降低,同时巯基氧化为二硫键。陈晓倩等[23]也在研究中发现,随发酵时间的延长,巯基氧化而导致含量减少,二硫键含量有增多的趋势。刘长虹等[24]用比色法测定了发酵面团中蛋白质的二硫键变化,面筋蛋白中二硫键含量逐渐降低而趋于稳定,主要是由于发酵过程中产生的蛋白酶等减弱了大分子间的键连作用,可能导致—S—S—还原为游离的—SH,使二硫键含量减少。

1.5 对蛋白质亚基的影响

发酵过程中蛋白质亚基发生改变,影响食品中蛋白组分,决定着其加工及营养特性。YOUSIF等[25]研究了自然发酵对大米蛋白组分的影响,结果表明在37 ℃、36 h的发酵条件下,g1-谷蛋白亚基和g2-谷蛋白亚基随着发酵时间的延长而增加,未发酵大米的主要蛋白质组分g3-谷蛋白亚基在发酵过程中显著降低。此外球蛋白+白蛋白组分显著增加了2.7倍,在36 h内成为大米中的主要蛋白质。LIU等[26]在乳酸菌发酵豆乳蛋白的研究中发现,SDS图谱中含有主要的大豆蛋白质有7S β-伴大豆球蛋白(7S α′亚基、7S α亚基和7S β亚基)和11S大豆球蛋白(11S酸性亚基和11S碱性亚基)。在发酵过程中,7S和11S碱性亚基的降解率较高,而11S酸性亚基的降解率较低。EMKANI等[1]也发现豆类蛋白发酵过程中来自副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、戊聚糖乳杆菌等不同乳酸菌的酶在不同程度上水解分离蛋白中的大豆蛋白组分,在植物乳杆菌发酵豆浆的研究中观察到7S β-伴球蛋白的α和β亚基几乎都被菌株降解。此外,鱼肉制品在发酵过程中,蛋白组分也发生改变。ZHAO等[27]研究了发酵对鳐鱼蛋白的影响,结果表明随着发酵的进行,碱溶蛋白和非蛋白氮含量增加,肌浆蛋白和肌原纤维蛋白含量逐渐减少,这些水溶性和盐溶性蛋白质含量的减少,主要是由于内源性蛋白酶和微生物蛋白酶使蛋白降解,另一方面是随着pH值的降低,蛋白之间相互作用减弱导致蛋白聚集。此外,一些内肽酶可以切割亲水性残基,如谷氨酸、组氨酸和赖氨酸等,而保留大多数疏水性残基,因此疏水相互作用增强,形成聚集使碱溶蛋白含量增加。

1.6 对蛋白质粒径的影响

通常情况下在食品发酵的过程中由于蛋白质降解而导致粒径变小,然而受pH、温度等因素的影响,蛋白质粒径也会有变大的趋势。张莉丽等[28]研究了发酵对可溶性大豆蛋白粒径分布的影响,根据Zetasizer Nano粒度分布仪的结果,发酵使得蛋白双峰粒径分布从10～100 nm和100～1 000 nm处移至1～10 nm和10～100 nm处,随发酵时间的延长逐渐从高粒径区域向低粒径方向移动。孙为正[29]的研究也表明发酵使得蛋白降解为小分子物质,粒径分布趋向于低粒径方向。YANG等[30]在乳酸菌发酵大豆分离蛋白而形成凝胶的研究中发现,乳酸菌诱导发酵的过程中pH值下降,接近豆浆蛋白的等电点,因此大多数蛋白质产生酸沉淀,导致蛋白平均粒径较大,同时发酵后大豆蛋白的溶解度、表面疏水性也显著降低。

1.7 对蛋白质微观结构的影响

食品在加工处理的过程中会改变蛋白质的微观结构,从而导致蛋白质功能特性的变化,影响蛋白质的溶解度、消化率、乳化性和起泡性等[31]。蓝天婵等[17]在产黄青霉发酵鸭肉制品的研究中,通过透射电镜和扫描电镜观察到发酵肉没有完整的肌原纤维,呈现无规则排列的颗粒状,蛋白质网络被破坏呈疏松状态。张莉丽等[28]通过扫描电镜观察发酵前后大豆蛋白结构也得出相似结论,发酵前大豆蛋白呈现表面光滑完整的片状结构,而发酵后蛋白颗粒表面的微观结构逐渐由规则变得不规则,结构松散且产生蛋白残片,颗粒内部存在大量空隙、蜂窝状孔洞,该结果同时印证了发酵使蛋白粒径变小的规律。

2 发酵对蛋白质功能特性的影响

蛋白质复杂多变的空间结构与其功能联系紧密,蛋白质的功能特性改变受其结构特性的影响。发酵过程中使食品中蛋白质的空间构象改变,进而功能特性也在一定程度上发生变化。蛋白质功能特性不仅决定着食品的感官特性和营养特性,而且影响着食品的物理加工特性[32]。

2.1 对蛋白质溶解度的影响

在食品原料加工的过程中,蛋白中的溶解度受pH值、温度、离子强度、处理时间及菌种类别等多种因素的影响,在发酵过程中蛋白质溶解度会发生不同程度的变化。将样品溶解后离心处理取上清液,利用凯氏定氮法计算蛋白含量,上清液蛋白含量占总蛋白含量的百分比反应着蛋白质溶解度的大小。

SCHLEGEL等[33]在发酵羽扇豆分离蛋白功能特性的研究中发现所有样品在中性条件(pH 7)下的蛋白质溶解度高于酸性条件(pH 4)下的溶解度,而且通常情况下蛋白质溶解度在等电点(pH 4.5)处最小。经过发酵后,在pH 4下的蛋白质溶解度没有显著变化,而在pH 7下的溶解度从63.59%显著降低到42.35%。主要是由于乳酸杆菌在发酵过程中产生有机酸,这可能诱导了蛋白质的不可逆凝固,从而降低了溶解度。此外,停止发酵的热处理(90 ℃,20 min)促进部分水解羽扇豆蛋白的聚集和交联而导致溶解度下降。SCHLEGEL等[34]在研究中还发现发酵过程中蛋白水解酶改变了蛋白质结构,导致蛋白质的疏水部分暴露,有利于蛋白质-蛋白质相互作用,造成聚集体的形成从而蛋白质溶解度的下降。KUMITCH等[35]研究了发酵时间对米曲霉和黑曲霉发酵豌豆蛋白粉理化和功能特性的影响,结果表明,发酵时间、真菌接种物和pH对蛋白质溶解度均具有显著影响。ARTEAGA等[36]研究了发酵对豌豆分离蛋白功能特性的影响,结果表明发酵24 h和48 h后,所有样品的蛋白质溶解度在pH为5.0时均显著提高,而在pH为3.0、7.0和8.0时则显著降低,发酵后蛋白质溶解度下降可能与蛋白分解使疏水基团暴露而蛋白质分子表面疏水性改变有关,此外微生物生长导致生物量增加也会使溶解度降低。

2.2 对蛋白质起泡性的影响

蛋白质的起泡性质通常用发泡能力(foaming capacity,FC)和发泡稳定性(foaming stability,FS)来表示。pH、发酵时间、溶解度、表面活性等因素都会影响蛋白质的起泡性。KUMITCH等[35]在发酵时间对米曲霉和黑曲霉发酵豌豆蛋白粉功能特性影响的研究中发现,随发酵的进行,样品的FC和FS都有减少的趋势,此外pH为7.0时FC最大,pH为5.0时FC最小。刘慧菊等[37]在研究不同微生物液态发酵对蚕豆蛋白功能特性的影响中发现,发酵后蛋白起泡性逐渐增强,经黑曲霉发酵后起泡性增加最大,且泡沫稳定性最好,其次是枯草芽孢杆菌,最后是植物乳杆菌。KHALID等[38]研究发现,受等电点的影响,芝麻蛋白在pH 5时FC的值最低,超过pH 5则FC显著增加,且在pH 9和pH 10时最大。FC增加可能是由于蛋白质上增加的净电荷,削弱了疏水相互作用,使蛋白质更易扩散到空气—水界面以包封空气颗粒而增加泡沫形成。XIAO等[39]在研究中发现与未发酵的红豆粉相比,发酵红豆粉的FC无显著差异,而FS高于未发酵的样品。FS增加可能归因于发酵过程中蛋白质结构的变化,表面活性增强的同时分子间的相互作用增强,进而形成稳定的黏弹性膜。此外,溶解度是影响发泡性质的重要因素,发酵过程中溶解度的降低影响蛋白质向空气—水界面迁移,进而导致蛋白质FC的降低。

2.3 对蛋白质乳化性的影响

蛋白质乳化性是指蛋白质使油品与水形成稳定乳状液的能力,通常用乳化活性(emulsion activity,EA)、乳化稳定性(emulsifying stability,ES)和乳化容量(emulsifying capacity,EC)三个指标来测定。EA、ES测定可采用文献[40]的方法,即将样品与冷蒸馏水(4 ℃)和葵花籽油混合制成乳剂后离心处理,根据乳化层占比计算。根据一定量蛋白质在形成水包油乳化体系时的电导率变化可测得EC。此外EA、ES还可以采用分光光度法来测定。

XIAO等[41]在固态发酵鹰嘴豆的过程中发现,发酵过程中的酶水解通常会产生低分子质量的肽,这些肽容易迁移到油水界面,从而提高EA,真菌发酵过程中分子构型的改变,暴露了蛋白质上的内部亲水或亲脂基团,也可能是乳化性能增强的原因。然而GARCA ARTEAGA等[36]在研究发酵豌豆分离蛋白(pea protein isolate,PPI)的EC变化时发现,PPI的发酵显著降低了豌豆蛋白的乳化能力,未发酵PPI的乳化能力为(548±33) mL/g,用植物乳杆菌发酵24 h和48 h后,分别为(370±62) mL/g和(385±24) mL/g。用过氧化氢酵母、戊糖乳杆菌等其他菌发酵后,乳化能力更低。又蛋白质溶解度(pH 7.0)与乳化能力呈显著正相关(P<0.05),说明低乳化能力可能与蛋白质的团聚和副产物的相互作用有关。这些团聚体可以阻止蛋白质与油分子之间的疏水相互作用,降低蛋白质的两亲性。发酵对蛋白质乳化能力的影响受发酵菌种、发酵时间、pH、溶解度等多种因素的影响,使乳化性能发生不同程度的改变。

2.4 对蛋白质黏度的影响

蛋白质水溶液的黏度是影响食品口感和营养价值的重要因素之一,一定程度的黏度可以稳定食品中的被分散成分。蛋白质黏度的影响因素主要是蛋白质分子的内在特征(如大小、体积和不对称性等)、蛋白质—蛋白质间的相互作用以及蛋白质—溶剂间的相互作用。发酵过程会引起溶液pH发生改变,致使蛋白质分子表面电荷变化,从而导致蛋白质与水、离子相之间的相互作用发生改变,宏观上表现为蛋白质黏度改变[42]。

ALLAHDAD等[43]在一种富含豌豆蛋白和大米蛋白的新型发酵益生菌饮料的研究中发现,发酵使饮料样品的黏度从83.7 mPa·s降低至39.1 mPa·s,发酵使黏度降低可归因于细菌酶的降解作用,降低了蛋白质和肽的分子大小,改变了样品的水溶性。PARK等[44]使用快速黏度分析仪测得自然发酵的过程中精米粒样品的黏度降低,TIAN等[45]也得出了同样的结论。

2.5 对蛋白质体外消化率(in vitro protein digestibility,IVPD)的影响

IVPD的测定可将样品暴露于胃蛋白酶(2 h,pH 1.9,37 ℃)和胰蛋白酶(2 h,pH 8.0,37 ℃)中消化,然后将消化的内容物离心并弃去上清液,采用凯氏定氮法测定残固物中蛋白质含量,以消化前后蛋白质含量差异的百分比作为IVPD%[46]。该方法与大鼠饲养试验(体内条件)中获得的蛋白质消化率值具有高度相关性,因此它可以很好地模拟体内蛋白质消化率[41]。MANUS等[47]在富含植物蛋白的乳酸菌发酵饮料IVPD的研究中得出,发酵处理显著提高了IVPD,发酵饮料的消化率为72.7%,未发酵对照饮料的消化率为61.4%。HU等[48]研究了植物乳杆菌与酵母共同发酵对饼干中小麦蛋白质消化率的影响,结果表明,发酵过程中蛋白质发生水解且蛋白质消化率显著提高。TEREFE等[49]在发酵玉米粉的研究中也得出相同的蛋白质消化率变化规律。

现代营养学者认为,蛋白质分解后以氨基酸的形式被机体吸收和利用,氨基酸的不足和过剩都影响蛋白质的营养价值,其中必需氨基酸摄入不足会导致免疫系统功能下降[37]。微生物的发酵作用使蛋白质大量降解为小分子多肽、游离氨基酸等,必需氨基酸的含量也相应提高,因此体外消化率在一定程度上提升,增加了蛋白质的生物利用度。此外发酵可以有效降解或消除原料中存在的单宁、植酸等抗营养因子,尤其是植物性蛋白质,其质量取决于消化率、氨基酸含量和非营养性化合物的残基,如酚类化合物、抗营养化合物、抗氧化剂和皂苷。发酵过程中产生的各种酶可以切断蛋白质和非营养性化合物之间的键,解决植物性蛋白质不易消化的弊端,提高其营养价值[50]。

3 发酵对蛋白类风味物质的影响

风味是评价食品品质的主要指标之一,也是影响消费者偏好的重要因素。蛋白质水解、脂类氧化降解和美拉德反应等都会导致风味物质形成,发酵过程中蛋白质水解产生各种游离氨基酸进而改善食品风味。ZHANG等[51]在雪菜发酵的研究中发现氨基酸代谢及碳水化合物代谢是风味产生的主要途径,乳酸杆菌、噬盐菌等发挥着主要作用,对雪菜的风味有着积极的作用。CAI等[52]在发酵对腌鸭腿风味影响的研究中发现,微生物发酵加速了鸭肉中蛋白质的降解,酿酒酵母促进了谷氨酸的产生,提升腌鸭腿肉的鲜味,植物乳杆菌通过释放丙氨酸显著改善了腌鸭腿肉的甜味。FENG等[53]研究了发酵对鱼肉制品风味的影响,结果表明发酵过程可以促进风味物质的产生,蛋白质降解产生的游离氨基酸作为挥发物的主要前体之一,被脱羧、脱氨或进一步代谢产生小分子风味物质,如醛和酮,对发酵产品的口感和风味都有影响。

4 结语

发酵技术在食品加工的过程中发挥着巨大的作用,不仅可以改善风味及感官品质,去除食品中的抗营养因子,提高营养价值,而且还可以提高保质期,起到防腐的作用。此外,发酵食品生产成本低且加工工艺简单。一直以来,发酵食品广受消费者青睐,但是发酵工艺仍存在许多待解决的问题。首先,发酵食品在加工、运输及贮藏的过程中易受微生物污染而导致腐败变质,且产生不良风味,因此应该更加关注发酵食品安全性问题,防止生产菌种在其生长繁殖过程中产生有毒代谢产物,进而对人体产生潜在危害。其次,大多数传统发酵食品的工业化程度低,提高商品性、方便性、安全性及现代化对于发酵工业的进一步发展具有重要意义,争取做到应用新技术提高生产效率的同时又不丧失传统发酵食品的独特风味。本文总结了发酵对食品中蛋白质结构和功能特性等多方面的影响,有助于进一步了解发酵对食品的影响机理,由此逐步提升发酵食品的感官性能及营养价值,完善发酵工艺在食品加工中的应用。