单细胞测序技术在慢性阻塞性肺疾病研究中的应用进展

杨泽华，丁毅鹏

（海南省人民医院（海南医学院附属海南医院）呼吸与危重症医学科，海南 海口570100）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）简称慢阻肺病，是一种异质性肺部疾病［1］。据最新WHO 数据显示，COPD 是全球第三大死因。并且由于我国人口老龄化、空气污染和吸烟率的上升等原因，预计未来COPD 的患病率、死亡率和社会负担仍会增加［2］。在COPD 的研究中，常用到基因测序。传统的测序方法获得的是细胞群体的总平均反应，无法反映每个细胞之间的差异性，不能完全揭示疾病的发病机制等。单细胞测序（single cell sequencing，SCS）技术可以在单细胞水平上对基因组和转录组等进行测序，揭示基因结构和表达以及发现细胞间的异质性和稀有细胞等。目前迫切需要这项技术来帮助研究COPD 的发病机制以及发现可靠的早期诊断方法和治疗方法等，从而减轻疾病负担。本文将介绍单细胞测序技术及相关进展，并对其在COPD 研究中的应用进行综述。

1 SCS 技术概述

1977 年，Sanger 等［3］发明了第一代基因测序技术，基因测序成为探索细胞遗传物质变化和疾病发展的强有利工具。2009 年Tang［4］首次通过单细胞RNA 测序方式实现了单个细胞内5 000 多个mRNA 表达信息的平行检测，开启了单细胞技术的测序时代。

SCS 技术的流程主要包括单细胞制备、文库构建、高通量测序和数据处理分析［5］。

单细胞制备的质量极大影响测序分析结果，传统分选方法有梯度稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选、激光显微切割等，不仅效率低，而且容易损伤细胞。目前更多使用高通量的细胞捕获方法，如微流控芯片捕获等［6］。

SCS 主要包括：基因组，主要用于检测单核苷酸突变、拷贝数变异及染色体结构变异；单细胞转录组，可以直观地反映出细胞间基因表达差异；表观遗传组［7］，可从单细胞水平获得甲基化水平数据，补充DNA 变异和RNA 表达之外的数据；蛋白质组，可以解构细胞群体并推断蛋白质丰度关系；空间转录组，可以描绘、分析细胞的空间位置及其在空间中的基因表达谱。多组学［8］可以全面综合分析细胞，得到更多更全面的遗传信息。

数据处理分析：先把数据进行预处理和标准化，然后进行主成分分析降维，再进行t 分布随机邻接嵌入或统一流形逼近与投影降维［9］，实现可视化；根据细胞的特征将大量的细胞分成不同的亚群。对差异基因进行富集分析，可以了解每种细胞类型的生物学功能，揭示和理解生物学过程中的关键分子机制；利用拟时序分析，推断细胞间的发展过程，可以发现罕见的细胞类型和隐性状态。基于配体-受体数据库和单细胞基因数据，可以分析细胞间的信息交流等［10］。

2 SCS 技术在呼吸系统疾病中的研究进展

SCS 技术正迅速成为各种研究中不可替代的方法，已经应用在许多呼吸系统疾病的研究当中。

呼吸系统疾病中肺纤维化的发病率在逐渐增加，目前的诊断和治疗方法欠佳。Reyfman 等［11］通过正常和纤维化肺组织的单细胞RNA 测序，在纤维化患者中发现了一个独特的、新的促纤维化肺泡巨噬细胞群体。通过制作分析肺纤维化的单细胞图谱，揭示了单个细胞群中纤维化基因表达的共同和不同模式并证明了肺纤维化患者肺泡巨噬细胞和上皮细胞的异质性。单细胞RNA 测序可以在早期疾病患者的肺样本上进行，这样我们可以识别早期肺纤维化患者并进行有效干预。

肺癌是癌症死亡的主要原因之一，其内部存在明显异质性，这种异质性有很重要的研究意义。而SCS 技术在发现细胞间异质性方面有很大的优势。Maynard 等［12］在靶向治疗前和治疗中，使用从30 名患者获得的49 份临床活检进行转移性肺癌的单细胞RNA 测序，描绘的细胞图谱揭示了复杂和动态的肿瘤生态系统，为肺癌的精准化治疗提供依据。

3 SCS 技术在COPD 中的研究进展

3.1 COPD 的概述

COPD 以持续气流受限为主要临床特征，以异常的气道炎症为病理特征［13］。其危险因素较多，首要因素是主动吸烟或被动接触二手烟导致的烟草暴露［14］；还有职业接触、空气污染、生物质燃料［15］、儿童期哮喘和既往肺部感染史以及α1-抗胰蛋白酶遗传性缺乏等因素。

COPD 的发病机制复杂，过去研究发现与炎症机制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡机制、氧化应激机制和自主神经系统功能紊乱等有关［16］。近些年研究发现，线粒体DNA 损伤［17］、异常自噬［18］和细胞焦亡［19］与COPD 的发病机制有关。研究分析COPD 的发病机制可以为COPD 的早期诊断、预防和治疗提供理论基础。

COPD 患者常在症状明显后才就诊，而此时疾病一般都发展到了中晚期，临床干预效果差。并且目前COPD 的诊断金标准肺功能检查［2］，需要患者的肺功能降低到一定程度才能做出诊断。同时因为肺功能检查设备成本较高，操作较复杂，需要相对严格和复杂的质量控制和数据解读，导致我国肺功能检查率低。2018 年，COPD 患者中接受过肺功能检查的仅占总患病人数的12%［20］。这给COPD 的预防和治疗带来了很大的困难。

3.2 COPD 的研究进展

目前缺乏可靠的早期诊断方法，不能及时对早期COPD 进行有效的干预。如果能筛查诊断出早期COPD 患者，并对其进行有效的干预和治疗，可以更好地减缓疾病进展，减轻疾病负担。当前的治疗方法无法阻止疾病的进展，我们需要去发现新的治疗靶点，寻找更有效的治疗方法。

COPD 是基因与环境相互作用导致的多基因疾病。NHLBI 资助的慢COPD 遗传流行病学研究（COPDGene）是有史以来调查COPD 发展中涉及的遗传因素的最大规模的研究之一，它对理解COPD 遗传基础至关重要。迄今为止，已有超过20个基因位点确定与COPD 影响状态相关，另外一些基因位点显示与COPD 相关表型如肺气肿、慢性支气管炎和低氧血症相关［21］。

烟雾暴露等环境因素不能完全解释COPD 的易感性。基于家族和人群的研究表明，COPD 风险的很大一部分与遗传变异有关［22］，如HHIP 和FAM13A［23］。识别与COPD 相关的遗传因素可能有助于解释疾病的异质性，评估个体易感性及预后，并确定新的个性化治疗方法。单核苷酸变异对许多人类疾病和性状都有影响，Ding 等［24］通过病例对照研究首次揭示了TLR9 和TLR2 多态性对中国人COPD 的发展具有保护作用。这些研究强烈表明遗传因素是COPD 易感性的重要及实质性因素。

Sakornsakolpat 等［25］对来自英国生物库的35 735 例病例和222 076 例对照进行了全基因组关联分析，鉴定了82 个具有全基因组显著性的基因座。其中对表型的最大贡献不是来自具有大效应的罕见变异，而是来自许多具有小效应的常见变异的组合效应。这种常见疾病-常见变异模型为全基因组关联分析提供了强有力的支持。COPD 中鉴定的几十到几百个基因座中，只有一小部分相关基因座被研究了功能效应，如FGF7 基因在影响COPD 风险中的作用［26］和FAM13A 可能通过促进β-catenin降解而影响COPD 的易感性［27］。此类研究通常能对COPD 的发病机制有新的发现。

有研究发现外泌体与COPD 的发生发展有着密切的关系，其中，环状RNA（circRNAs）在外泌体中具有富集性和稳定性［28］，有望成为COPD 的生物标志物或提供新的治疗靶点。Liu［29］采集3 例COPD 患者和3 例非COPD 患者的新鲜外周血，检测其mRNA、miRNA、lncRNA 和CircRNA 的表达，鉴定分析其差异表达，揭示了RNA 在COPD 中的参与和潜在的调控作用，这将有助于COPD 的病理学研究和COPD 治疗靶点的探索。其构建的lncRNA-mRNA 共表达网络和CircRNA-miRNAmRNA（ceRNA）相互作用网络有望为未来的COPD 研究提供有价值的信息。

3.3 SCS 技术在COPD 研究中的应用

COPD 是一种复杂的多基因疾病，受遗传和环境因素相互的影响。SCS 技术在COPD 中的应用是一个新兴的研究领域，目前国内外的研究正在积极探索该技术在COPD 发病机制、病理、生理过程以及诊断和治疗方面的应用。它是一种能够在单细胞水平上对基因组和转录组等多组学进行测序分析的技术，可以帮助我们深入了解细胞类型、细胞功能和细胞间的相互作用等方面的细胞生物学问题，目前仍然需要进一步的研究来验证和扩展这些发现，并将其应用于临床实践中。

SCS 可以帮助鉴定分析COPD 患者肺组织中的不同细胞类型，如上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞及间质细胞等，并进一步研究分析它们在COPD 理过程中的功能和相互作用。国内研究报道中，彭玲等［30］利用GEO 公共数据库中18 例COPD 患者及28例健康对照组共219 257 个肺组织单细胞RNA 测序结果，分析高内皮细胞小静脉（HEV）内皮细胞与T 淋巴细胞、B 淋巴细胞以及树突状细胞的关系，发现HEV 内皮细胞在COPD 中升高，并具有免疫调节的作用，有望成为COPD 治疗的潜在靶标。越来越多的SCS 数据产生并整合到一个可公开访问的数据库中。这极大地促进了COPD 的相关研究，对探索COPD 发病机制及发现新的治疗方法有很大的帮助。

SCS 可以帮助分析COPD 患者肺组织中炎症反应和免疫细胞的变化。通过比较不同细胞类型中炎症相关基因的表达水平，可以了解COPD 炎症反应的机制和调控网络。国外研究报道中，Sauler等［31］描绘了晚期COPD 受试者或对照肺的移植肺组织的单细胞RNA 测序谱并使用转录组网络分析，确定了COPD 中不同上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞群中以前未认识到的基因表达和细胞相互作用的变化，强调了COPD 中细胞损伤和炎症的复杂性和多样性。未来的研究的特定转录失调的结果将提供对导致疾病的机制的见解。

在COPD 发展过程中，香烟烟雾是主要危险因素，它对小气道上皮细胞有诱导作用，而上皮细胞损伤是COPD 重要的病理特征。SCS 可以揭示COPD 发展过程中上皮细胞损伤的机制，以及相关细胞类型的功能和相互作用。Wohnhaas 等［32］利用单细胞RNA 测序揭示了以前未认识到的小气道上皮内的转录异质性和对急性和慢性香烟烟雾暴露的细胞类型特异性影响。了解小气道上皮细胞图谱和细胞（亚）类型在烟雾暴露反应中的特异性作用可能有助于开发COPD 的细胞特异性治疗方法。

通过单细胞转录组测序，可以比较COPD 患者和健康人群中各个细胞类型的基因表达差异。这有助于了解COPD 发生和发展过程中细胞内基因表达的变化，从而揭示COPD 的潜在机制。Pei等［33］对COPD 患者和健康对照者的血浆外泌体进行测序，并对外周血单核细胞（PBMCs）进行单细胞RNA 测序，然后构建了竞争性内源性RNA（ceRNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络来描述COPD 中PBMCs 和外泌体之间的相互作用。此外还生成了COPD 患者PBMCs 的外泌体RNA 图谱和单细胞转录组图谱，描述了免疫功能受损和COPD 发展之间的可能联系，确定了外泌体在介导局部和全身免疫反应中的可能作用，有助于最终阐明COPD 发展的基础机制。而Huang 等［34］对来自COPD 和具有不同吸烟史的供体的年龄分层，对照肺组织的细胞进行了单细胞RNA 测序分析，为COPD 的发病机制提供了一个观点，并证明了靶向单核细胞在COPD 诊断和治疗中的潜力。这两项研究促进了对COPD 发病机制的理解，并发现了COPD 中诊断和治疗的潜在靶点。

一些研究发现，COPD 患者的肺组织中存在与铁死亡相关的基因表达异常。这些异常可能导致铁在细胞内的积累，从而引发细胞损伤和炎症反应。此外，COPD 患者肺组织中存在与铁死亡相关的细胞亚群，如巨噬细胞和上皮细胞。Fan 等［35］综合分析来自COPD 巨噬细胞的单细胞RNA 测序数据，揭示了巨噬细胞铁死亡在COPD 中的重要作用，新的生物标志物（SOCS1 和HSPB1）可能通过调节巨噬细胞铁死亡参与COPD 的发病机制。这表明SOCS1 和HSPB1 可以作为COPD 新的治疗靶点。

近几年，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）对全球医疗保健系统构成严重威胁。有研究发现COPD 患者感染SARS-CoV-2 的风险及感染后死亡率比健康人高。Johansen 等［36］对健康人和COPD 患者接种新型冠状病毒疫苗7 天后分化的原代支气管上皮细胞（pBECs）进行了单细胞RNA 测序分析，并将变化与病毒滴度、促炎反应和干扰素产生相关联，发现COPD 的pBECs 更容易受到SARS-CoV-2 感染。我国COPD 患者多，这项研究发现具有重要的临床指导意义，对COPD 患者防治SARS-CoV-2 有积极的影响。

干细胞治疗是一种新兴的治疗方法，被广泛研究应用于COPD 的治疗中，而SCS 可以帮助鉴定COPD 肺组织中的干细胞类型和状态。COPD 的特征是不可逆的肺组织损伤，许多研究发现了肺损伤后远端气道干/祖细胞（DASCs）的潜在再生功能。Wang 等［37］把小鼠和人类DASCs 扩增、分析，并移植到受伤的小鼠肺中，然后进行单细胞分析以揭示移植细胞的分化途径。最后，将人DASCs 移植到COPD 小鼠体内，发现分离的小鼠和人DASCs 可以无限扩增，并能够在体外进一步分化为成熟的肺泡结构。单细胞分析发现移植细胞表达典型的Ⅰ型肺泡细胞标志物以及特异性分泌蛋白。这些发现表明，DASCs 肺内移植可以重建功能性肺结构，表明DASCs 移植在治疗COPD 中的潜在治疗作用。DASCs 在COPD 过程中发挥多种作用，结合SCS揭示其具体机制，也许可以逆转COPD 的不可逆损伤，并为开发新的干细胞治疗策略提供理论依据。

这些研究提供了关于细胞类型、细胞功能和细胞间的相互作用等方面的重要信息，有望进一步理解COPD 的发病机制，以及发掘新的诊断及治疗方法。

4 讨论

在过去十年中，SCS 已被证明是生命科学领域的变革技术之一。目前应用在COPD 研究中，如确定以前未鉴定的细胞亚群、发现COPD 新的生物标志物、发现新的治疗靶点和通过机器学习算法预测慢阻肺疾病患者相关诊断基因标志物［38］等。但是，目前SCS 技术仍存在较多问题有待改善，如成本问题、单细胞分离获取的质量问题、基因捕获的效率和质量问题、细胞物理位置的缺失、扩增偏倚问题和实验批次效应［39］等。

由于目前COPD 缺乏可靠的早期诊断方法，无法及时进行早期干预，并且临床治疗无法阻止疾病的进展，导致其发病率、患病率和死亡率高，造成严重的疾病负担。所以急需找寻可靠的早期诊断方法和有效的治疗方法来减解决这一问题。而SCS技术在COPD 发病机制的研究中有很大的作用，有望实现COPD 的早期诊断、个体化治疗和预后预测，提高患者生命质量，减轻社会负担。

作者贡献度说明：

杨泽华：选题，论文结构设计，文献收集，撰稿，修稿；丁毅鹏：主要对选题、文章的知识性内容作批评性审阅。

所有作者声明不存在利益冲突关系。