PAX8基因与上皮性卵巢癌的相关性

刘健 赵晶 王蓉 陈雪 马晓梅

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是众所周知的最致命的妇科恶性肿瘤[1],是一组涉及卵巢的异源性肿瘤。其中上皮性肿瘤(约90%)可分为四种主要组织型:浆液性、粘液性、子宫内膜样和透明细胞型,其中高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中发生率和致死率最高的亚型,与BRCA1或 BRCA2和p53基因突变有关,占卵巢癌死亡总数的70%,其高死亡率主要因为在早期阶段,HGSOC是无症状的,并且不存在特定的生物标志物,因此大多数病例在晚期才被发现,且发现时通常已伴有远处转移(FIGO Ⅲ～Ⅳ期)[2]。该疾病主要治疗方式包括手术减瘤、序贯紫杉烷类药物和铂类方案化疗,治疗初期药物治疗往往效果明显,但很快就会发生化疗耐药,甚至疾病复发。因此,对于该类患者的诊疗,了解EOC的致瘤和转移过程是至关重要的,最新的组织学、分子生物学和动物模型证据表明,大多数HGSOC起源于输卵管上皮[3]。研究发现,几乎所有HGSOC中都存在输卵管上皮(fallopian tube epithelium,FTE)谱系特异性标记配对盒基因8(paired box 8,PAX8),至于EOC的其他组织类型,PAX8基因在卵巢透明细胞癌和卵巢子宫内膜样肿瘤中高表达,在卵巢黏液性肿瘤中低表达[4]。近年来,PAX8基因在卵巢癌中的致瘤作用已得到充分重视[5-6],所以将PAX8基因作为EOC的诊断标志物,甚至作为HGSOC潜在治疗靶点的研究越来越受到研究者的关注。本文就PAX8基因在EOC中的致瘤作用及临床潜在应用等方面的研究进展展开综述。

1 PAX配对盒基因家族概述

PAX配对盒基因家族是一类在胚胎模式形成和器官发育中高度保守的转录基因家族。PAX基因最初发现于果蝇,随后发现广泛存在于许多不同的物种中[7]。它们在果蝇的胚胎发育中影响幼虫的分割并促进眼睛和大脑发育[8]。这些基因编码的转录因子包括四个功能域:具有DNA结合活性的N端配对域、保守的八肽基序、同源域(可作为第二个独立的DNA结合区)和C端的反式激活域[9]。在哺乳动物中,PAX基因家族根据是否具有配对域末端的八肽基序、同源域以及所具有的同源域是否完整,可分为4个亚家族[10]。分别为:亚家族Ⅰ(PAX1和PAX9)由配对结构域和八肽组成,亚家族Ⅱ(PAX2,PAX5和PAX8)除配对结构域和八肽外还有部分同源结构域,亚家族Ⅲ(PAX3和PAX7)由配对结构域、完全同源结构域和八肽组成,亚家族Ⅳ(PAX4和PAX6)由配对结构域和完全同源结构域组成。PAX基因家族编码的蛋白质为一组在胚胎发育和器官分化中极其重要的转录调控因子,主要用于调节细胞增殖,促进更新,诱导前体细胞定向转移和引导特定细胞系分化[11]。

2 PAX8基因在组织生长发育过程中的功能

PAX8基因位于人染色体2q12-q14上,是一种谱系特异性转录因子相关基因[12]。研究表明,甲状腺发育不良的PAX8基因缺失小鼠会发生严重发育不良,断奶后不久将会死亡[13]。在发育过程中,小鼠的PAX8基因表达主要存在于肾脏、甲状腺和苗勒管的正常上皮细胞中,其中苗勒管是雌性生殖系统的起源[14]。早期甲状腺激素替代疗法让雌性PAX8基因缺失小鼠得以存活,但它们无法生育,因为会伴随苗勒管衍生组织的异常,例如子宫闭锁、阴道口闭锁和输卵管积水导致的输卵管损伤[15]。PAX8基因在雄性生殖系统的发育中也起着关键作用,并在胚胎期中肾管中表达[16]。用甲状腺激素治疗雄性PAX8基因缺失小鼠,可以治疗先天性甲状腺功能减退症,但这些小鼠由于没有附睾、输出导管和精子而不能生育[17]。因此,PAX8基因在组织发育过程中起着重要作用,并可以指导两性生殖器官的正常形成。同时,胚胎发育和癌症进展之间的许多相似之处越来越得到研究者认可,因为这两个过程都需要许多细胞类型之间的相互作用和协调,许多转录因子和转录因子家族参与胚胎分化和癌症转化和进展的调节。

3 PAX8基因与上皮性卵巢癌的相关性

在正常成年组织中,PAX8基因表达于肾脏、甲状腺和输卵管上皮等,而不是卵巢上皮细胞。同时有研究发现PAX8基因也在HGSOC中高表达[18]。最新的证据证明FTE是主要的卵巢癌祖细胞部位,从健康FTE中敲除PAX8基因,几乎没有功能影响,并且没有显着改变基因的表达。然而,将HGSOC中PAX8基因敲除会降低肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,同时诱导细胞死亡,减慢肿瘤进展[12]。有研究指出PAX8基因是输卵管分泌细胞谱系的标志物,其表达保留在96%的浆液性卵巢癌、89%的子宫内膜样癌和100%的透明细胞癌中,并影响肿瘤细胞增殖、形态和存活,癌症基因组图谱(TGCA)项目表明PAX8是卵巢癌细胞增殖所必需的存活基因[5]。证明卵巢肿瘤细胞依赖PAX8基因的表达,而正常的FTE不受PAX8基因变化的影响,上皮性卵巢癌细胞的发生和PAX8基因的表达具有明显的相关性。

4 PAX8基因在上皮性卵巢肿瘤发展中的作用

4.1 PAX8基因与肿瘤的关系 研究表明,PAX8基因与卵巢恶性肿瘤的发生之间有着重要的联系[6]。PAX8基因能直接结合并增加抑癌基因P53的转录,激活定位于HGSOC细胞质中的抑癌基因P21的表达,诱导卵巢癌细胞非典型的促增殖作用。Nik等[19]利用基因工程小鼠模型成功模拟了从输卵管分泌上皮细胞到高级别浆液性卵巢癌的转化。此外,基因谱研究也发现HGSOC的基因表达谱与输卵管的关系比与卵巢表面上皮的关系更密切[20]。PAX8基因通过与视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,RB)中细胞增殖因子E2F1直接结合,在调节细胞周期中起着核心作用,包括PAX8基因在内的几种PAX蛋白(组织特异性发育调节因子)与RB蛋白相互作用,从而直接或间接调节细胞周期。

PAX8基因在肾细胞癌、膀胱癌、卵巢癌和甲状腺癌细胞系中经常表达,并且癌细胞系中PAX8基因的沉默导致E2F1及其靶基因表达的显着降低,以及 RB蛋白的蛋白酶体依赖性不稳定,而RB1 mRNA水平不受影响。Li等[21]研究提出PAX8基因转录直接调节E2F1启动子,并且RB耗竭后E2F1转录增强。RB被募集在PAX8 基因结合位点,并参与癌细胞中 PAX8基因介导的E2F1转录。在癌症中,通过转录激活E2F1表达和RB-E2F1通路上调来控制细胞生长需要频繁和持续的PAX8基因表达。Xiong等[5]认为,在正常的EOC细胞中增加PAX8基因表达,会上调叉头盒基因(forkhead box M1,FOXM1)信号通路,增加细胞增殖、迁移和上皮间质转变,与此相应,在3种人类卵巢癌细胞系中敲除PAX8基因后,FOXM1基因表达减少,癌细胞增殖减少,凋亡增加。但我们对PAX8基因的认识仍在逐渐深入,研究表明,PAX8基因控制着参与调节肿瘤-基质相互作用、细胞粘附、增殖、存活和转移的转录程序[22]。PAX8基因作为转录因子发挥作用驱动特定目标基因的激活,并与调节细胞命运和身份的不同因素相关联。

4.2 PAX8基因调节肿瘤细胞与细胞外间质的相互作用 Soriano等[22]利用体外迁移实验和黏附分析发现上调PAX8基因表达可通过整合素异二聚体αvβ3增加细胞间粘附连接,在卵巢癌肿瘤细胞粘附细胞外间质(extracellular matrix,ECM)过程中发挥调节作用,并驱动肿瘤进展和侵袭。据报道,整合素β3仅与另外两个α整合素亚基结合:整合素αiib和整合素αv。αiibβ3二聚体存在于巨核细胞系细胞中,在血小板聚集时发挥作用;αvβ3二聚体存在于增殖的内皮细胞和一些癌细胞中[23]。有证据表明异二聚体αvβ3在肿瘤生长和侵袭的多种机制中发挥作用,包括与ECM、基质金属蛋白酶、血小板衍生生长因子、转化生长因子β(TGFβ)、血管内皮生长因子受体相互作用,以及防止细胞凋亡[24]。其中TGFβ是一种由肿瘤细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子,参与导致实体瘤的ECM重塑。具体而言,TGFβ介导成纤维细胞向癌症相关成纤维细胞的转变,以促进该类细胞转移,ECM蛋白(如纤连蛋白和胶原蛋白)都通过增加组织刚度和增强成纤维细胞的浸润最终影响免疫细胞浸润而与疾病侵袭性相关,胶原蛋白和纤连蛋白的沉积与不良的临床预后和生存率呈直接相关关系[25]。

纤连蛋白是一种ECM糖蛋白,除了伤口愈合、胚胎发育和致癌转化等过程外,还在细胞分化、迁移、侵袭和增殖中起着至关重要的作用。在卵巢癌中,纤连蛋白在细胞迁移、侵袭、转移中发挥作用,并作为预后生物标志物[26]。与纤连蛋白类似,胶原蛋白通过控制基质刚度在ECM重塑中发挥作用,并在卵巢癌细胞中提供转移前生态位[27]。这些研究证明PAX8基因作为HGSOC免疫标记物的可能,同时PAX8基因- ECM的相关性突出了PAX8基因对肿瘤细胞的潜在治疗价值,即未来研究者有望开发有效的肿瘤转移阻断信号。Hardy等[28]发现PAX8基因是人类卵巢癌模型(OVCAR8RFP)以及源自卵巢表面上皮和输卵管上皮的浆液性肿瘤模型中作为迁移和腹膜定植的统一驱动因素,但目前仍需对其他HGSOC细胞系模型进行研究,以确认PAX8基因在上皮性卵巢癌迁移中的主要调节作用。

4.3 PAX8基因招募MECOM 基因驱动卵巢癌致癌功能 Bleu等[29]认为PAX8基因是卵巢癌细胞的主要组织因子,它参与了大量基因组位点的表达,其中PAX8基因在特定的基因组位点上特异性招募MDS1-EVI1复合基因集(MDS1-EVI1 complex locus,MECOM)。MECOM是一个转录单元,最初由2个主要的启动子(500 kb)组成,驱动MDS1和EVI1蛋白的表达[30]。在卵巢癌和急性髓性白血病中因发生剪接导致MDS1-EVI1融合蛋白的表达[31]。基因PAX8和MECOM剪接变异体,表达于同一蛋白复合体中,以调控特定的共同基因模块,支持体内肿瘤生长,细胞外间质生成和细胞粘附[29]。Bleu 等[29]发现PAX8和MECOM是同一转录复合物的一部分,并确定了PAX8-MECOM基因特征,该基因特征是预后不良的OC患者,PAX8基因在非HGSOC中的作用与HGSOC相似。另一项研究报告称,敲低PAX8基因表达可降低肿瘤细胞的粘附水平,减少肿瘤负荷[32]。此外,卵巢谱系特异性PAX8基因调节子参与决定苗勒管器官发生过程中细胞命运和表型的决定性事件,如果失调有助于卵巢癌发生[33]。这些研究说明PAX8基因驱动的细胞致癌功能涉及多种因子参与,这将为未来相关研究奠定一定理论基础。

4.4 肿瘤微环境中PAX8基因与脂肪间充质干细胞的作用 上皮性卵巢癌是一种独特的实性肿瘤,起源于腹腔,转移和再发于腹腔,并形成其特有的微环境[34]。肿瘤微环境(tumor micro-environment)由免疫细胞、间充质干细胞和肿瘤组织间的非细胞成分等组成,TME在卵巢癌的转移和耐药中有着重要影响[35]。大网膜上的脂肪间充质干细胞(adipose‐derived mesenchymal stem cells,ADSCs)可以显著提高卵巢癌的生长速度和侵袭能力,提示卵巢癌的进一步发展[36]。Chu等[37]发现ADSC明显上调卵巢癌细胞PAX8基因表达,参与激活河马(Hippo)信号通路,该通路核心包含一个激酶级联,哺乳动物ste20样激酶1/2(Mammalian Ste20-like kinases 1/2,MST1/2)和大型肿瘤抑制因子1/2(Large tumour suppressor 1/2,LATS1/2),以及下游效应器,即转录共激活因子YES相关蛋白(transcriptional co-activator Yes-associated protein,YAP)和具有PDZ结合基序的转录共激活剂(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)。TAZ参与调节多种肿瘤细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭以及上皮间质的转化和干细胞化。PAX8基因上调促进TAZ在卵巢癌中的转录,间接影响肿瘤进展,并参与调节肿瘤微环境和原发肿瘤之间的相互作用[38]。

4.5 卵巢癌非编码体细胞突变集中在PAX8通路 在卵巢癌细胞突变中,约96%位于非蛋白质编码DNA区域,并提出部分非编码体细胞突变可能通过修改调节元件的功能驱动癌症发展,PAX8基因表达的转录因子结合发生在非启动子区域,包括增强子和超增强子区域[39]。Corona等[40]发现转录因子PAX8与超增强子在所有上皮性卵巢癌组织型中均被检测到,并且在HGSOC和子宫内膜样中最为活跃。这表明PAX8基因可能为HGSOC中非编码体细胞突变所致转录失调的主要参与者。

4.6 SOX17与PAX8协同控制肿瘤转录网络 Reddy等[41]开发了癌症核心转录因子特异性(CaCTS)算法,用来识别肿瘤驱动主转录因子(MTF),即一组与超级增强子(super enhancers,SE)相关的转录因子,其预测的结合基序在SE上富集,表现出肿瘤类型特异性表达。通过这种方法,发现PAX8基因、SOX17基因和MECOM形成了驱动高级别浆液性卵巢癌细胞系中肿瘤细胞存活的核心调节回路。其中,SOX17基因是一个新谱系生存转录因子,是SOXF家族的成员,该家族具有β-连环蛋白结合和反式激活结构域,它与上皮性卵巢癌中的PAX8基因有着共同表达模式,SOX17或 PAX8基因的破坏同样抑制肿瘤细胞的活性并且下调谱系相关转录物的谱系。肿瘤细胞通常依赖于一组相互关联的MTF来维持其恶性表型[42]。为了进一步探讨SOX17的致癌潜能,Lin等[43]从癌症基因组图谱(TCGA)中初步证实了其在HGSOC中的优先基因表达。在泛癌分析的基础上,HGSOC表现出SOX17mRNA的最高水平; 作为比较,PAX8基因表达在HGSOC中相对受限。

同样,SOX17基因和PAX8基因在苗勒氏管起源的子宫内膜癌组织也高表达,细胞模型显示SOX17与PAX8基因共定位于细胞核中,并且分别在SOX17或PAX8基因表达免疫沉淀物中检测到内源性PAX8或SOX17基因。临床样本的生化分析证明SOX17与PAX8基因都显示出苗勒管谱系特异性共表达,并共同调控广泛的下游基因,包括参与细胞周期和组织形态发生的基因。SOX17和PAX8基因表达对新开发的 CDK12/13共价抑制剂非常敏感,这些抑制剂有效地抑制体外肿瘤活性和体内异种移植物生长。因此,SOX17和 PAX8基因协同控制致瘤转录网络并呈现可靶向苗勒氏管谱系特异性转录装置。同样,Moreira等[44]也通过多项细胞试验发现在蛋白质水平上,敲除PAX8基因可导致 SOX17基因表达几乎完全消失,SOX17基因的敲低同样导致 PAX8基因表达水平大幅下降,同时PAX8-SOX17基因复合体与SERPINE1(也称为丝氨酸蛋白酶抑制剂1)表达关系密切,其中SERPINE1为Serpin家族E成员,是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路的有效抑制因子。据报道,其抗血管生成作用主要通过与玻连蛋白结合并阻断整合素αvβ3和uPAR结合位点介导,可阻断细胞粘附、迁移并抑制血管生成[45]。Moreira等[44]通过转录组学和蛋白质组学分析认为,在卵巢细胞中,激活 PAX8-SOX17基因信号传导时,SERPINE1作为肿瘤血管生成的重要抑制剂,处于明显下调状态。该研究者提出假设,在肿瘤发生过程中,通过PAX8-SOX17基因复合体激活抑制SERPINE1表达,在体内触发VEGF通路激活并促进肿瘤血管生成,所以在未来的研究中,抑制 PAX8-SOX17基因通路可能具有潜在价值,作为治疗卵巢癌的抗血管生成的新方向。

5 PAX8基因相关靶向药物试验

HGSOC仍然是影响全球女性的最致命的恶性肿瘤之一,因为大多数病例是在发生腹膜转移等不良结局后才得以诊断,导致预后不良,且目前在临床治疗中仍然缺乏该类疾病特异性的靶向药物。由于HGSOC细胞类型和组织类型的特异性、在健康成人细胞中的低表达以及HGSOC的发病及发展过程中对PAX8基因表达和活性的依赖性,其被认为是HGSOC中非常有前途的诊断和治疗靶点。多项研究都指出 PAX8蛋白是OC致病相关信号通路中的重要调节因子,它与正常细胞和肿瘤细胞中不同介质结合的证据表明,PAX8蛋白复合物可以特异性地靶向肿瘤细胞,使正常细胞和组织完全不受影响。硫链丝菌肽(Thiostrepton)是一种硫肽抗生素,可特异性结合70S原核核糖体抑制基因翻译[46]。Hardy等[28]发现PAX8基因可上调上皮性卵巢癌中的叉头盒基因FOXM1水平,其中FOXM1是一种致癌基因,在超过80%的HGSOC肿瘤样本中呈激活状态,它是浆液性肿瘤进展的关键驱动因素[47]。而硫链丝菌素可靶向影响配对盒基因PAX8基因和叉头盒基因FOXM1的表达,已有报道硫链丝菌素通过下调FOXM1基因表达抑制乳腺癌细胞迁移、转移和转化[48]。Hardy等[28]利用硫链丝菌素靶向PAX8基因和FOXM1基因降低其蛋白水平的原理,将胶束封装硫链丝菌肽试验性治疗有效减少了肿瘤负荷,这一发现突出了在HGSOC中利用药物特异性靶向PAX8基因的治疗潜力。Lin等[43]发现SOX17与PAX8基因在培养的细胞系和临床肿瘤标本中发生物理相互作用,这两种核蛋白结合到重叠的基因组区域,并调控一组共同的下游基因,包括那些参与细胞周期和组织形态发生的基因,此外,转录周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的小分子抑制剂可以有效降低SOX17和PAX8基因的表达。

ZSQ1722是一种新型的口服CDK12/13共价拮抗剂,在异种移植模型中表现出较强的抗肿瘤活性。此外,靶向PAX因子的另一种策略是抑制其结合活性。Grimley 等[49]在227种潜在的PAX2基因抑制剂中发现了一种称为EG1的小分子,可有效阻断PAX2-5-8 DNA结合活性并降低癌细胞的活力。同一研究小组使用无偏倚的、基于细胞的高通量筛选分离抑制PAX2-5-8基因复合体反式激活能力的化合物。这些抑制剂不会干扰 PAX2-5-8 DNA结合活性,但对PAX2-5-8基因复合体转录激活以及癌细胞增殖具有抑制作用[50]。鉴于EG1和抑制剂通过两种不同的机制发挥其作用,或许两种分子的结合可能会在未来增加治疗益处。

基于PAX8基因在HGSOC中的核心作用,Shi等[33]等发现HGSOC中的PAX8 基因调节子对组蛋白脱乙酰酶(HDAC)拮抗剂敏感,HDAC拮抗剂作为单一药物有效抑制卵巢肿瘤的生长和扩散,并与标准化疗联合发挥协同作用,这一发现或许能为PAX8基因相关性的卵巢癌提供治疗方面的思路。Liu[51]研究发现姜黄醇可能通过降低卵巢癌细胞中PAX8的表达抑制了卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移,该项动物实验中,姜黄醇抑制裸鼠移植卵巢癌的生长,与尼拉帕尼有协同作用,加了尼拉帕尼对卵巢癌的化疗敏感性。这些研究均揭示了卵巢癌中可操作的谱系存活转录复合物,可通过产生一系列化合物在药理学上靶向这种难以治疗的恶性肿瘤,从而为以后新型抗卵巢癌的药物的发现提供了一定基础。

6 PAX8基因对卵巢癌复发和生存期的影响

研究者认为浆液性卵巢癌患者的无进展生存期和总生存期与PAX8基因表达有关[52];子宫内膜癌和卵巢癌组织中PAX8基因的上调伴随着更高的死亡风险和疾病复发[53]。研究指出不同FIGO分期、不同病理分级的卵巢癌患者中PAX2基因、PAX8基因表达存在明显差异,且其阳性率随着FIGO分期、不同病理分级的增加而改变,提示PAX2基因、PAX8基因表达与疾病进展存在一定关联,可有效评估患者病情进展情况[54]。由此可以推测出PAX8基因与EOC的发生、疾病进展、复发及预后关系密切,故未来有理由相信PAX8基因作为EOC疾病预测因子为卵巢癌患者的临床管理带来益处。

7 展望

上皮性卵巢癌中,PAX8基因通过促进癌细胞的增殖、迁移和存活能力而提供生长优势,更是卵巢高级别浆液性肿瘤进展的关键驱动因素,在一定程度上PAX8基因的表达能够预测卵巢癌的进展和预后,以便指导临床对该疾病患者的管理。同时,PAX8基因在控制卵巢癌细胞状态和迁移方面的核心作用,也表明卵巢癌PAX8基因及其表达的蛋白可能成为一种高效的抗癌疗法,具有广阔的应用前景,靶向这些蛋白质有望减慢患者的肿瘤生长和进展,并显著提高生存率。PAX8基因具有组织特异性,因此与通过普遍表达干扰靶标的方法相比,这种治疗策略还可能具有更低的毒性水平,这或将成为未来EOC开发靶向疗法或精准医学的重要新机会。