细胞壁降解酶在球刺盘孢侵染过程中的作用

金梦军 杨成德 李统华 OSEI Richard 蔡锋锋 马婷

摘要

為明确球刺盘孢Colletotrichum coccodes产生的细胞壁降解酶（CWDEs）在其侵染马铃薯过程中的作用，本文对球刺盘孢离体和活体条件下产生的CWDEs种类及活性进行检测，并通过RTqPCR测定了球刺盘孢侵染过程中多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因的表达情况。通过定性测定发现，球刺盘孢能够产生果胶酶、纤维素酶和蛋白酶;定量测定发现，球刺盘孢可产生羧甲基纤维素酶（Cx）、β葡萄糖苷酶（βGlu）、PG和聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）。在活体条件下，球刺盘孢可在马铃薯茎秆内产生PG、PMG和多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE），且酶活分别于接种后48、72 h和144 h达到最大值，分别为26.50、77.61 U/mL和0.16 U/mg。分别将羧甲基纤维素钠和果胶诱导后的酶液接种至马铃薯茎秆可引起植物组织浸腐，与球刺盘孢引起的典型症状相似。除此之外，球刺盘孢的4个PGs基因均在其侵染后24 h和48 h显著共上调表达。综上所述，该研究结果表明，果胶酶在球刺盘孢致病过程中发挥重要作用。

关键词

球刺盘孢; 马铃薯; 细胞壁降解酶; 多聚半乳糖醛酸酶

中图分类号：

Q 939.9

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2023263

The role of cell walldegrading enzymes of Colletotrichum coccodes during its infection

JIN Mengjun， YANG Chengde*， LI Tonghua， OSEI Richard， CAI Fengfeng， MA Ting

（Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province， College of Plant

Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Abstract

To determine the function of cell walldegrading enzymes （CWDEs） secreted by Colletotrichum coccodes during infecting potato stems， the types and activities of CWDEs secreted by C.coccodes both in vivo and in vitro were investigated， the gene expression levels of four polygalacturonases （PG） of C.coccodes were also assessed using RTqPCR. The qualitative measurement results indicated that C.coccodes secretes pectinase， cellulase， and protease on detection plates in vitro， and the qualitative determination results demonstrated that it secretes carboxymethyl cellulase （Cx）， βglucosidase （βGlu）， polygalacturonase （PG）， and polymethylgalacturonase （PMG） on detection medium in vitro. In addition， C.coccodes produces PG， PMG and polygalacturonic acid transeliminase （PGTE） during its infection to potato stems in vivo， with peak activities of 26.50， 77.61 U/mL and 0.16 U/mg 48 h， 72 h and 144 h postinoculation， respectively. Inoculating crude enzymes induced by sodium carboxymethylcellulose and pectin onto potato stems could cause potato stem rotting similar to the typical symptoms caused by C.coccodes on potato stems. Moreover， four PGs of C.coccodes showed significantly upregulated coexpression 24 h and 48 h postinoculation. Collectively， these data demonstrated the important role of pectinase in the pathogenic process of C.coccodes.

Key words

Colletotrichum coccodes; Solanum tuberosum; cell walldegrading enzymes; polygalacturonase

馬铃薯是我国重要农作物之一，2021年，中国马铃薯总产量约占全球总产量的23%，居世界首位［1］。然而，随着种植面积增加，马铃薯晚疫病［2］、枯萎病［3］、疮痂病［4］和炭疽病［5］等病害发生越来越普遍。其中，由球刺盘孢Colletotrichum coccodes引起的炭疽病是马铃薯生产上的一种毁灭性病害，可在马铃薯整个生长期发生，侵染后在感病植株的根、块茎和茎秆上形成典型的黑色小颗粒，即分生孢子盘［6］，导致叶片干枯［7］，整株萎蔫、坏死，严重时发病率可达到30%～50%［8］。目前，炭疽病的发病面积和造成的经济损失还在持续上升。2019年，球刺盘孢引起的马铃薯炭疽病在中国河北和墨西哥被首次发现，造成严重损失［9］。因此，了解球刺盘孢的致病因子对有效防治马铃薯炭疽病具有重要意义。

寄主植物细胞壁包含纤维素、果胶、半纤维素等组分，其作为保护屏障，可抑制病原菌的侵入［10］。然而，病原菌分泌的细胞壁降解酶（cell wall degrading enzymes， CWDEs），如纤维素酶和果胶酶等能够打破这种屏障，促进病原菌侵入寄主植物体内［11］，加速病害的发展。如尖孢刺盘孢C.acutatum产生的CWDEs帮助其侵入植株，引起橡胶树炭疽病［12］。真菌可分泌不同种类的CWDEs［13］，而CWDEs 的多样性也反映了植物细胞壁结构的复杂性和病原菌生活方式的多样性［14］。有学者认为，病原菌的致病性与CWDEs的活性相关，CWDEs的活性越高，该菌株的致病性越强［15］。豆类壳球孢Macrophomina phaseolina不同菌株在侵染玉米、向日葵和西瓜种子的过程中产生的CWDEs活性不同，其致病性也存在差异［16］。从咖啡树上分离的33株盘长孢状刺盘孢 C.gloeosporioides均可以产生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶和果胶酶［多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）

、聚甲基半乳糖醛酸酶（polymethylgalacturonase，PMG）

和果胶裂解酶］，其中致病力较高的菌株 19和 124 可以分泌高活性的CWDEs［17］。尖孢刺盘孢引起的橡胶树炭疽病中，叶片上病斑大小与果胶裂解酶活性具有相关性，且在发病的叶片中检测到了 β葡萄糖苷酶和纤维素二糖酶［12］。因此，病原菌分泌的CWDEs 在其侵染寄主植物的过程中可能作为毒力因子发挥致病作用，尤其是纤维素酶和果胶酶［1819］。

致病菌在侵染寄主植物时首先分泌果胶酶降解植物细胞壁，被降解的细胞壁在为病原菌提供碳源的同时还能促进纤维素酶和半纤维素酶降解植物细胞壁中的其他组分，最终加速病原菌在寄主体内的扩展［20］。有研究表明，果胶酶的活性决定着病原菌的致病性，是导致植物发病的重要因素之一［21］。实生链核盘菌Monilinia fructicola在侵染蟠桃时会分泌PMG和PG，且引起褐腐等症状［22］。在马铃薯病害的研究中，多种病原菌在侵染过程中会产生水解酶，且果胶酶的活性随着培养基的不同而发生变化［23］。对33株盘长孢状刺盘孢分泌的果胶酶（PG和PMG）活性进行测定发现，其与病原菌的致病性相关［17］。除此之外，康振生等［24］采用免疫细胞化学法观察禾谷镰孢Fusarium graminearum侵染小麦穗组织时发现，病原菌产生的果胶酶可引起寄主细胞壁松弛。PGs属于糖苷水解酶28家族（GH28），能够催化果胶和半乳糖醛酸中1，4αD半乳糖醛酸键的水解，降解植物细胞壁中果胶成分，促进病原菌顺利侵入［25］。PGs在离体和活体条件下的活性与病原真菌的毒力大小相关［15］，如Alternaria patula［26］和小新壳梭孢Neofusicoccum parvum［27］的毒力常与PGs的活性呈正相关。将来自豆刺盘孢Colletotrichum lindemuthianum的PG在农杆菌内瞬时表达后，接种至烟草叶片时可引起过敏性坏死反应（hypersensitive response，HR）［28］。平头刺盘孢C.truncatum侵染大豆时，PG首先被“激活”，并协助 PMG 和果胶裂解酶降解大豆细胞壁成分［29］。以上研究表明，PG在病原真菌的致病过程中发挥重要作用。然而，根据之前相关报道，球刺盘孢的致病机制常与附着孢和侵入钉的形成［30］以及果胶酸裂解酶［31］相关，而关于其产生的其他细胞壁降解酶在其致病过程中是否发挥毒力作用研究较少。

因此，本研究以球刺盘孢为研究对象，通过定性和定量方法测定其在寄主体内和体外产生的主要果胶酶和纤维素酶的种类及其活性，并确定其是否在球刺盘孢致病过程中发挥作用，以期明确球刺盘孢分泌的CWDEs种类，及其与球刺盘孢致病性之间的相关性，通过RTqPCR确定PG基因在球刺盘孢侵染过程中的表达情况，为球刺盘孢果胶酶致病机制的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株与植物

马铃薯炭疽病病原菌：球刺盘孢Colletotrichum coccodes，由甘肃农业大学植物保护学院植物病原细菌及生物多样性实验室提供。供试植物：马铃薯， 品种‘大西洋。

1.1.2 供试试剂

50 mmol/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）、醋酸醋酸钠缓冲液（pH 5.0）和甘氨酸氢氧化钠缓冲液（GlyNaOH，pH 9.0）；1%的羧甲基纤维素钠（CMC）（pH 5.0）、水杨苷（pH 5.0）、果胶（pH 5.0）和多聚半乳糖醛酸（pH 5.0）；3 mmol/L CaCl2；1 mol/L NaCl；3，5二硝基水杨酸（Dinitrosalicylic acid，DNS）（棕色瓶保存）;均由实验室配制。

1.1.3 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：用于球刺盘孢的活化；

马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）：用于球刺盘孢孢子悬浮液制备。

细胞壁降解酶诱导培养基：2 g KNO3，0.5 g KCl，0.01 g FeSO4，1 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，10 g 碳源（柑橘果胶：用于果胶酶诱导;羧甲基纤维素钠：用于纤维素酶诱导），1 000 mL双蒸水。用于球刺盘孢分泌的细胞壁降解酶的定量测定。

葡萄糖酵母提取物蛋白胨培养基（glucose yeast extracts peptone medium，GYP）：1 g葡萄糖，0.1 g酵母提取物，0.5 g蛋白胨，16 g琼脂，2 g可溶性淀粉，1 000 mL蒸馏水。用于细胞壁降解酶的定性分析。

果胶琼脂培养基（pH 5.0）：5 g果胶，1 g酵母提取物，15 g琼脂，1 000 mL蒸馏水。用于果胶酶活性的定性分析。

1.2 试验方法

1.2.1 球刺盘孢细胞壁降解酶分泌活性的定性测定

球刺盘孢于PDA平板25℃黑暗培养7 d，打取5 mm菌饼转接至纤维素酶、蛋白酶和果胶酶检测培养基平板上培养7 d。以只接种5 mm PDA琼脂培养基的平板为对照。通过染色观察球刺盘孢分泌纤维素酶、蛋白酶和果胶酶的能力，每处理组接4皿。具体测定方法如下：

纤维素酶分泌活性定性测定：将5 mm球刺盘孢菌饼接种至含有0.5%羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethylcellulose，CMC）（pH 6.0）的GYP平板。25℃黑暗培养7 d后，将0.2%刚果红溶液平铺于平板表面染色30 min，ddH2O漂洗干净后，用1 mol/L NaCl脱色15 min。如接种球刺盘孢的培养基背景由红色变为黄色，说明其具有产纤维素酶的能力［10］。

蛋白酶［10］和果胶酶［32］分泌活性定性测定：将5 mm球刺盘孢菌饼分别接种至含有0.4%明胶（pH 4.0）的GYP平板和果胶琼脂培养基上。25℃培养7 d后，分别用10%饱和硫酸铵溶液和1%十六烷基三甲基溴化銨水溶液浸没15 min，如菌落周围出现明显的透明圈，表明球刺盘孢具有产生蛋白酶和果胶酶的能力。

1.2.2 球刺盘孢细胞壁降解酶分泌活性的定量测定［3334］

1.2.2.1 培养基中球刺盘孢细胞壁降解酶粗酶液的提取及纯化

分别在250 mL的细胞壁降解酶诱导培养液和PDB培养液中接种10个球刺盘孢菌饼（5 mm），于摇床（HNY203T，天津欧诺仪器股份有限公司）中25℃、120 r/min振荡培养，分别于培养24、48、72、96、120、144、168 h和192 h过滤菌丝，培养液10 000 r/min 离心30 min，收集上清液，即为待测粗酶液。利用60%饱和硫酸铵对所得粗酶液进行浓缩。具体为：将粗酶液与60%饱和硫酸铵混合，4℃静置5 h，4℃ 14 000 r/min离心25 min，弃上清，将沉淀溶解于50 mmol/L的醋酸醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中，4℃透析48 h，得到纯化酶液。

1.2.2.2 球刺盘孢侵染马铃薯茎秆后细胞壁降解酶的提取

将球刺盘孢接种至PDB中，25℃，120 r/min振荡培养获得孢子悬液（108个/mL），将其接种至马铃薯茎秆，于接种后24、48、72、96、120 h和144 h分别收集马铃薯发病部位及周围的组织样本（每个时间段收集混合样品共1 g）于无菌研钵中，加入1 mol/L NaCl（9 mL/g组织）进行研磨，收集研磨匀浆液，4℃、10 000 r/min 离心20 min，收集上清液于4℃保存。以接种无菌水后研磨的马铃薯组织上清液为对照。以球刺盘孢侵染后马铃薯体内CWDEs活性与无菌水接种后CWDEs活性的差值表示球刺盘孢侵染茎秆时所分泌的CWDEs活性。每个时间段收集3份样品用于试验。

1.2.2.3 标准曲线绘制

葡萄糖标准曲线：在8个空的10 mL离心管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL和1.4 mL浓度为1 mg/mL的葡萄糖溶液，补足蒸馏水至2 mL，分别加入2 mL DNS，使葡萄糖浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL和0.35 mg/mL，混匀后煮沸5 min，自来水冷却，加入5 mL蒸馏水。以含有0 mg/mL葡萄糖的溶液为对照，利用紫外分光光度计测定不同浓度葡萄糖溶液的OD540。以葡萄糖浓度为横坐标，对应浓度的OD540为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

D半乳糖醛酸标准曲线：标准曲线绘制方法同葡萄糖标准曲线，其中，以D半乳糖醛酸［用50 mmol/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）配制］代替1 mg/mL葡萄糖，且自来水冷却后的混合液用蒸馏水定容至10 mL。最后，利用紫外分光光度计测定不同浓度D半乳糖醛酸的OD540，以不加D半乳糖醛酸的混合液为对照。以D半乳糖醛酸的浓度为横坐标，对应的OD540为纵坐标，绘制D半乳糖醛酸标准曲线。

牛血清蛋白标准曲线：用蒸馏水将1 mg/mL的牛血清蛋白分别稀释为0、20、60、100、140、180、220 μg/mL 和260 μg/mL，再分别加入5 mL考马斯亮蓝G250，混匀后静置2 min。以含0 mg/mL牛血清蛋白的混合液作为空白调零，利用紫外分光光度计测定各管OD595。以牛血清蛋白的浓度为横坐标，对应的OD595为纵坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线。

将1 mL待测粗酶液与5 mL考马斯亮蓝G250混匀，静置2 min后测定OD595，试验重复3次。

以加入1 mL 50 mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH 5.0）的混合液为对照，再根据牛血清蛋白标准曲线计算酶液蛋白浓度［35］。

1.2.2.4 细胞壁降解酶活性的定量测定

羧甲基纤维素酶和β葡萄糖苷酶活性：

将1 mL待测酶液与1 mL柠檬酸柠檬酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH 5.0）混合，加入1 mL底物［1% CMC和1%水杨苷分别为测定

羧甲基纤维素酶（Cx）和β葡萄糖苷酶（βGlu）酶活性的底物］，50℃保温30 min后加入2 mL DNS，于沸水中加热终止反应（测定Cx和βGlu活性的离心管分别加热10 min和5 min），分别测定各样品于540 nm处的吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算葡萄糖浓度。对照组是先加入DNS终止反应，再加入底物，其他步骤与处理组相同。每个试验重复3次。将1个酶活力单位定义为：在50℃和pH 5.0的条件下，1 mL酶液水解CMC或水杨苷1 h产生1 mg葡萄糖所需酶量。

酶活力（U/mL）=（As-A0）/（K×V×T）×Dr，式中，As：樣品酶的OD540;A0：空白样品酶的OD540;K：标准曲线斜率;Dr：稀释倍数;V：取样量（mL）;T：反应时间（h）。

PG和PMG活性：测定方法与上述方法相似。其中，测定PG和PMG活性的底物分别为1%多聚半乳糖醛酸和1%果胶，50℃保温60 min。根据D半乳糖醛酸标准曲线，计算PG和PMG酶活力。每个试验重复3次。将1个酶活力单位定义为：在50℃和pH 5.0条件下，1 mL酶液水解1 h多聚半乳糖醛酸或果胶产生1 mg D半乳糖醛酸所需酶量。

酶活力（U/mL）=（As-A0）/（K×V×T）×Dr，

式中，As：样品酶的OD540;A0：空白样品酶的OD540;K：标准曲线斜率;Dr：稀释倍数;V：取样量（mL）;T：反应时间（h）。

多聚半乳糖醛酸反式消除酶（polygalacturonic acid transeliminase，PGTE）和果胶甲基反式消除酶（pectin methyltranseliminase，PMTE）活性：分别用1%多聚半乳糖醛酸和1%果胶作为底物进行酶活性检测。具体操作方法：1 mL待测粗酶液中加入1 mL 50 mmol/L GlyNaOH（pH 9.0）缓冲溶液，再加入1 mL底物和1 mL 3 mmol/L CaCl2溶液，混匀，30℃条件下反应60 min，立即加入2 mL DNS终止反应，自来水冷却后，加入蒸馏水，定容至6 mL，测定其OD232。其中，对照组先加入DNS终止反应后再加入底物。每个试验重复3次。1个酶活力单位定义为：在30℃和pH 5.0 条件下，1 mL酶液1 min水解多聚半乳糖醛酸或果胶产生1 μmol不饱和醛酸所需酶量。

酶活性（U/mg）=（ΔOD232×0.1×Dr）/（0.17×C×T），式中，△OD232：OD232（反应T时间后）- OD232（反应初期）;Dr：稀释倍数;0.17：每释放0.1 μmol不饱和醛酸，在232 nm处增加的OD232值;C：粗酶液蛋白浓度（mg/mL），根据牛血清蛋白标准曲线计算;T：反应时间（h）。

1.2.3 经果胶和纤维素诱导的球刺盘孢粗酶液对马铃薯茎秆的浸解作用

在细胞壁降解酶培养基中分别利用CMC和果胶对球刺盘孢进行诱导培养，诱导培养96 h后，采用1.2.2.1的方法提取粗酶液并纯化。分别取100 μL纯化的纤维素酶和果胶酶液接种至健康的马铃薯茎秆（用5号昆虫针针刺造成微伤口，且利用75%乙醇进行表面消毒）。以接种球刺盘孢为阳性对照组，以接种无菌水为阴性对照组。72 h后，观察并记录纤维素粗酶液和果胶粗酶液对马铃薯茎秆组织的浸解作用。

1.2.4 球刺盘孢侵染过程中PG基因的相对表达量

选择4个具有信号肽且在侵染马铃薯茎秆过程中上调表达的PGs基因［Cluster14407.17878， Cluster14407.16352、Cluster83170.0和Cluster84997.0，属于糖苷水解酶28家族（GH28）］，采用RTqPCR（QuantStudio5，ABI，美国）测定其在球刺盘孢侵染马铃薯后3、6、12、24、48、72 h和96 h 的表达情况，以收集于PDA平板的球刺盘孢菌丝和分生孢子的转录本作为对照组（0 h）。采用OMEGA真菌RNA提取试剂盒（OMEGA Biotek， Georgia， 美国）提取球刺盘孢样本的RNA，以此为模板，利用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd.， 北京，中国）合成球刺盘孢的单链cDNA。利用Primer Premier 6.0设计PGs基因的RTqPCR引物，以球刺盘孢的18S rRNA作为内参基因（表1）［31］。RTqPCR的扩增程序为：95℃ 10 min；40个循环（95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s）；熔解曲线（95℃ 15 min，60℃ 60 s，95℃ 15 s）。扩增体系为（20 μL）：10 μL 2x SYBR Green qPCR Master Mix，上、下游引物各1 μL （10 μmol/L），1～100 ng 球刺盘孢cDNA，0.4 μL ROX Reference Dye（No.2）。利用2-ΔΔCt计算基因相对表达量，其中ΔΔCt=（Ct处理组目标基因- Ct处理组18S rRNA）-（Ct对照组目标基因- Ct对照组18S rRNA）［36］，每个试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 球刺盘孢细胞壁降解酶活性定性测定结果

球刺盘孢在离体条件下具有产生CWDEs的能力。分别在以羧甲基纤维素钠和明胶作为诱导底物的GYP培养基上，球刺盘孢可以分泌纤维素酶和蛋白酶，在果胶琼脂培养基上可分泌

果胶酶。其中，将球刺盘孢接种至含有0.5% CMC的GYP平板，培养7 d后，通过染色可明显观察到菌丝覆盖的培养基背景色由染色后的红色变为黄色（图1a），说明培养基中有纤维素酶的产生;于含有0.4%明胶的GYP平板上，球刺盘孢菌落周围出现明显的透明水解圈（图1b），说明有蛋白酶产生;用1%十六烷基三甲基溴化铵水溶液浸没接种球刺盘孢的果胶琼脂平板后，其菌落周围出现明显的透明圈（图1c），说明球刺盘孢能够产生果胶酶水解培养基中的果胶进而形成水解圈;同时，对照组平板均无明显变化 （图1a′，b′和c′）。

2.2 球刺盘孢细胞壁降解酶活性的定量测定结果

2.2.1 标准曲线

分别测定不同浓度葡萄糖、D半乳糖醛酸和牛血清蛋白在540、540 nm和595 nm处的吸光度，以此绘制标准曲线。得到的标准曲线方程分别为：y=6.916 4x+0.017 9（R2=0.999 6），y=5.371 4x-0.036 6（R2=0.998 5）和 y=0.006 2x+0.016 1（R2=0.997 3）。

2.2.2 培养基中球刺盘孢分泌的细胞壁降解酶活性

离体条件下，在细胞壁降解酶诱导培养基中球刺盘孢可分泌

Cx、βGlu、PG和PMG，其酶活性随着培养时间的增长，呈现先升高后降低的变化趋势。其中，Cx和βGlu活性均在培养120 h时达到峰值，其酶活性分别为0.657 9 U/mL（圖2a）和0.6145 U/mL（图2b），但与培养144 h时的酶活性无显著差异

（P<0.05）;在底物为果胶的细胞壁降解酶诱导培养基中，球刺盘孢分泌的PG和PMG活性分别于培养后96 h和72 h达到峰值，分别为103.553 U/mL（图2c）和137.849 U/mL（图2d），达到峰值之后，PG活性相比PMG活性出现大幅度降低。由此可见，球刺盘孢经果胶诱导能够产生大量的PG和PMG，且产生的细胞壁降解酶活性为：PMG＞PG＞Cx＞βGlu。

在PDB培养基中，球刺盘孢仅能产生PG和PMG。其中，PG和PMG活性分别于培养后120 h和96 h达到峰值，其酶活性分别为79.309 U/mL（图3a）和163.955 U/mL（图3b），达到峰值后其活性均显著下降（P<0.05）。球刺盘孢于PDB培养基中培养24～192 h内，PG和PMG活性的变化范围分别为19.445～79.309 U/mL和114.02～163.955 U/mL， 与含有底物的细胞壁诱导培养基中

所产生的PG和PMG活性相似，且PMG＞PG。

2.2.3 球刺盘孢侵染马铃薯茎秆后分泌的细胞壁降解酶活性

将球刺盘孢接种至马铃薯茎秆，检测其侵染过程中PG、PMG、PGTE和PMTE的活性。结果表明，在接种后24～144 h，其在茎秆内分泌的PG、PMG和PGTE活性均大于0 U/mL （或U/mg）（图4a～c），但未检测到PMTE活性。其中，PG活性在接种后48 h达到最大值，为26.50 U/mL（图4a）;PMG活性在接种后72 h达到峰值，为77.61 U/mL（图4b），显著高于其他互作时间段的酶活性（P<0.05）。除此之外，在球刺盘孢接种马铃薯茎秆后24～120 h，PGTE活性較低，接种后144 h达到最大值，为0.16 U/mg（图4c）。该结果表明，球刺盘孢在侵染马铃薯茎秆的过程中，能够在马铃薯茎秆体内产生较多的PMG，其次为PG和PGTE，但不能产生PMTE。

2.2.4 球刺盘孢细胞壁降解酶对马铃薯茎秆的浸解作用

将羧甲基纤维素钠（图5a）和果胶（图5b）诱导后的浓缩酶液接种至马铃薯茎秆72 h后，其接种部位组织被浸解，出现褐色和梭形坏死症状，与接种球刺盘孢（图5c）的发病症状相似。其中，与接种纤维素酶液后的马铃薯茎秆相比，果胶酶液在马铃薯茎秆上的活性较高，对植物细胞壁组织的浸解作用较强，能够明显造成马铃薯茎秆变褐。接种无菌水的马铃薯茎秆并未表现出任何组织坏死等症状（图5d）。结果表明，果胶酶在球刺盘孢侵染过程中发挥重要作用，可作为毒力因子，加速对马铃薯茎秆的浸解，可促进球刺盘孢的顺利侵入。

2.2.5 球刺盘孢侵染过程中PG基因的相对表达量

采用RTqPCR对4个含有信号肽，且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的PGs基因［属于糖苷水解酶28家族（GH28）］在球刺盘孢侵染过程中的表达量进行分析，发现Cluster14407.17878 和Cluster14407.16352在球刺盘孢侵染的整个过程中（3～96 h）持续上调表达。其中，Cluster14407.17878在接种后24 h显著上调表

达（P<0.05），其相对表达量是对照的21.38倍;Cluster14407.16352在接种后48 h显著上调表达（P<0.05），其相对表达量是对照的45.50倍

。除此之外，Cluster83170.0在接种后24 h开始上调表达，且在24 h时表达量最高，为对照的41.36倍，在接种后96 h的表达量显著低于其他互作时间段的表达量（P<0.05）。Cluster84997.0仅在接种后24 h和48 h上调表达。通过RTqPCR测定发现，球刺盘孢的4个PGs基因主要在其侵染马铃薯后24 h和48 h共表达（图6）。

3 结论与讨论

植物细胞壁含有多种组分，还能抵御病原菌的入侵。然而，为了能够打破寄主植物的物理屏障顺利进入寄主植物细胞，并在寄主体内定殖和扩展，病原菌会分泌大量的CWDEs降解植物细胞壁组分，以加速其侵染过程［15］。通常，果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的活性与病原菌的致病性相关［37］。球刺盘孢在含诱导底物的平板上可以产生果胶酶、纤维素酶和蛋白酶。同时，在纤维素和果胶诱导下可产生Cx、βGlu、PG和PMG。果胶酶是致病真菌产生的一类重要的细胞壁降解酶，在病原菌早期致病过程中发挥重要作用，其降解植物细胞壁果胶成分，从而促进病原菌的侵入［3839］。在本研究中，PG和PMG在离体和活体条件下均于培养后或接种后24 h被检测到，其活性经底物诱导培养96 h和72 h达到峰值，且高于Cx和βGlu的活性。但有研究表明，立枯丝核菌Rhizoctonia solani经果胶诱导48 h才能产生PG和PMG，随着培养时间的增加，其活性逐渐增加，分别于培养10 d和12 d达到峰值［40］。本研究中，球刺盘孢在细胞壁降解酶诱导培养液中产生最多的CWDEs是PMG，其次是PG、Cx和βGlu， 其中，PMG的活性范围为86.59～137.849 U/mL，在诱导后72 h达到峰值。在山药组织中，草酸青霉Penicillum oxalicum的βGlu酶活性低于果胶酶和Cx［41］，本研究结果与此一致。本研究结果表明，球刺盘孢在果胶诱导下会产生大量的果胶酶，果胶酶可能是病原菌的一个致病因子。

通过活体接种发现，球刺盘孢侵染马铃薯后 48 h 和72 h，马铃薯茎秆内PG和PMG活性最高，分别为26.50 U/mL和77.61 U/mL。但有研究表明，Colletotrichum可在诱导培养基中产生大量PG，而在寄主植物活体组织内检测不到PG［12］，这与本研究结果不同。PG在球刺盘孢侵染马铃薯的过程中可能发挥重要作用。此外，在球刺盘孢侵染马铃薯茎秆后24～48 h，茎秆内PG活性相比其他互作时间段高，说明PG可能在球刺盘孢的活体营养阶段协助病原菌侵入寄主植物并引起病害症状。有研究表明，PGTE可在玉米弯孢霉叶斑病菌Curvularia lunata侵染玉米后72 h产生，并在外源铁的作用下可导致植物病害发生［33］。球刺盘孢在侵染马铃薯时，马铃薯茎秆内也检测到PGTE，但在侵染后24～120 h内其活性水平较低，于侵染后144 h活性顯著升高，说明PGTE可能在球刺盘孢的死体营养阶段发挥作用。在马铃薯茎秆上接种CMC和果胶诱导的酶液，进一步证实了果胶酶和纤维素酶具有降解植物细胞壁的作用，且果胶诱导的粗酶液相比CMC诱导的粗酶液在马铃薯茎秆上引起的浸腐症状更明显。同样，Babalola［42］认为，纤维素酶和果胶酶能够促进Fusarium compactum侵入分枝列当Orobanche aegyptiaca，并造成其死亡率大于50%。以上研究结果表明，球刺盘孢分泌的果胶酶可能在降解马铃薯植株细胞壁和促进球刺盘孢侵染过程中发挥重要作用，尤其是PG和PMG。

除此之外，BenDaniel等［31］设计简并引物，克隆了球刺盘孢的果胶裂解酶基因，并证实其可作为致病因子影响球刺盘孢的致病性。而在本文中，通过对球刺盘孢侵染马铃薯后上调表达的4个PGs基因的动态表达情况进行监测，初步确定其与球刺盘孢的侵染过程具有相关性。其中，这4个PGs基因在球刺盘孢侵染后24 h共同显著上调表达，而通过生理生化检测，球刺盘孢产生的PG活性峰值出现在其侵染马铃薯后48 h，这主要是因为病原菌生理生化的表现常受控于基因表达的调控，因此基因的表达往往早于生理生化特征的表现［43］，证实了本试验的结论。除此之外，Cluster14407.17878 和 Cluster14407.16352在球刺盘孢侵染马铃薯后3～96 h内持续上调表达。Cluster83170.0和 Cluster84997.0在侵染马铃薯后24 h开始被诱导表达，其中，Cluster84997.0仅在侵染马铃薯后24 h和48 h表达，表明其可能在球刺盘孢侵染中期参与对马铃薯细胞壁的降解，而玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis分泌的PG在其侵染后10 d才能被检测到［44］，说明PG家族内的不同基因在不同病原菌的不同侵染时期发挥重要作用。糖苷水解酶28家族（GH28）的CWDEs通常具有协同作用和功能冗余现象，其中一个基因编码的CWDEs活性会受到其他CWDEs的影响［45］。有报道表明，缺少多聚半乳糖醛酸酶基因pgxB的黑曲霉Aspergillus niger对苹果果实的致病性明显降低，但是，通过RTqPCR检测发现，同一家族内其他PG基因（pgal、pgall、pgaA、pgaC、pgaD和 pgaE）的表达量明显增加，且PG活性也明显升高［46］。在本试验中，球刺盘孢分泌的PG活性在其侵染后48 h最高，而球刺盘孢的4个PGs基因在其侵染后24 h显著共上调表达，且不同时间段4个PG基因的表达量存在差异，该结果表明，这4个PGs基因可能在球刺盘孢侵染马铃薯的整个过程具有协同作用。然而，关于它们在球刺盘孢致病过程中的作用，以及它们各自之间的互作机制，还需有待进一步研究。

参考文献

［1］ 王虎存， 赵武云， 孙伟， 等. 马铃薯机械化收获技术与装备研究进展［J］. 农业工程学报， 2023， 31（14）： 122.

［2］ 郭东锋， 钟林宇， 周挺， 等. 马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗性的快速检测方法［J］. 植物保护学报， 2023， 50（1）： 214223.

［3］ DEVI A R， SHARMA G D， MAJUMDAR P B， et al. A multispecies consortium of bacteria having plant growth promotion and antifungal activities， for the management of Fusarium wilt complex disease in potato （Solanum tuberosum L.） ［J］. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology， 2018， 16： 614624.

［4］ CUI Lingxiao， YANG Chengde， WEI Lijuan， et al. Isolation and identification of an endophytic bacteria Bacillus velezensis 84 exhibiting biocontrol activity against potato scab ［J/OL］. Biological Control， 2020， 141： 104156. DOI： 10.1016/j.biocontrol.2019.104156.

［5］ 杨成德， 姜紅霞， 陈秀蓉， 等. 甘肃省马铃薯炭疽病的鉴定及室内药剂筛选［J］. 植物保护， 2012， 38（6）： 127133.

［6］ AKIR E， KARAHAN A， KURBETLI I. Involvement of Colletotrichum coccodes causing a typical symptoms of potato tubers in Turkey ［J］. Journal of Plant Diseases and Protection， 2019， 126（2）： 173176.

［7］ BELOV G L， BELOSOKHOV A F， KUTUZOVA I A， et al. Colletotrichum coccodes in potato and tomato leaves in Russia ［J］. Journal of Plant Diseases and Protection， 2018， 125（3）： 311317.

［8］ TIAN Zaimin， WU Yuhuan， GUO Huijing， et al. First report of potato black dot caused by Colletotrichum coccodes in Hebei province of China ［J］. Plant Disease， 2019， 103（10）： 2669.

［9］ PEREZMORA J L， COTARODRIGUEZ D A， RODRIGUEZPALAFOX E E， et al. First confirmed report of Colletotrichum coccodes causing black dot on potato in Mexico ［J］. Journal of Plant Diseases and Protection， 2020， 127（2）： 269273.

［10］RAMEZANI Y， TAHERI P， MAMARABADI M. Identification of Alternaria spp. associated with tomato early blight in Iran and investigating some of their virulence factors ［J］. Journal of Plant Pathology， 2019， 101（3）： 647659.

［11］KIKOT G E， HOURS R A， ALCONADA T M. Contribution of cell wall degrading enzymes to pathogenesis of Fusarium graminearum： a review ［J］. Journal of Basic Microbiology， 2009， 49（3）： 231241.

［12］FERNANDO T H P S， JAYASINGHE C K， WIJESUNDERA R L C. Cell wall degrading enzyme secretion by Colletotrichum acutatum the causative fungus of secondary leaf fall of Hevea brasiliensis ［J］. Mycological Research， 2001， 105（2）： 195201.

［13］STRASSER K， MCDONNELL E， NYAGA C， et al. MycoCLAP， the database for characterized lignocelluloseactive proteins of fungal origin： Resource and text mining curation support ［J/OL］. Database， 2015， 2015： bav008. DOI： 10.1093/database/bav008.

［14］KING B C， WAXMAN K D， NENNI N V， et al. Arsenal of plant cell wall degrading enzymes reflects host preference among plant pathogenic fungi ［J/OL］. Biotechnology for Biofuels， 2011， 44. DOI： 10.1186/1754683444.

［15］GAWADE D B， PERANE R R， SURYWANSHI A P， et al. Extracellular enzymes activity determining the virulence of Rhizoctonia bataticola， causing root rot in soybean ［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2017， 100： 4956.

［16］RAMOS A M， GALLY M， SZAPIRO G， et al. In vitro growth and cell wall degrading enzyme production by Argentinean isolates of Macrophomina phaseolina， the causative agent of charcoal rot in corn ［J］. Revista Argentina de Microbiologia， 2016， 48（4）： 267273.

［17］ARMESTO C， MAIA F， MONTEIRO F P， et al. Exoenzymes as a pathogenicity factor for Colletotrichum gloeosporioides associated with coffee plants ［J］. Summa Phytopathologica， 2020， 45（4）： 368373.

［18］JOSHI R. A review on Colletotrichum spp. virulence mechanism against host plant defensive factors ［J］. Journal of Medicinal Plants Studies， 2018， 6（6）： 6467.

［19］薛莲， 檀根甲， 徐先松， 等. 苹果炭疽病菌对苹果果实致病机制初探［J］. 安徽农业大学学报， 2006（4）： 522525.

［20］JIA Yongjian， FENG Baozhen， SUN Wenxiu， et al. Polygalacturonase， pectate lyase and pectin methylesterase activity in pathogenic strains of Phytophthora capsici incubated under different conditions ［J］. Journal of Phytopathology， 2009， 157（10）： 585591.

［21］ROGERS L M， KIM Y K， GUO W， et al. Requirement for either a host or pectininduced pectate lyase for infection of Pisum sativum by Nectria hematococca ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2000， 97（17）： 98139818.

［22］宋丹丹， 孔慶军， 李鸿彬， 等. 蟠桃褐腐病原菌生物学特性及细胞壁降解酶活性［J］. 食品科学， 2017， 38（10）： 4248.

［23］SWAMI C S. Studies on pectinase production in tomato fungi on different culture media ［J］. Indian Journal of Applied Research， 2020， 10（1）： 5051.

［24］康振生， 黄丽丽， 韩青梅， 等. 禾谷镰刀菌侵染引致小麦穗组织细胞壁成分变化的细胞化学研究［J］. 植物病理学报， 2007， 27（6）： 623628.

［25］WARREN J G， KASUN G W， LEONARD T， et al. A phage displayselected peptide inhibitor of Agrobacterium vitis polygalacturonase ［J］. Molecular Plant Pathology， 2016， 17（4）： 480486.

［26］WU Huichen， WU Wenshao. Evaluation of virulence and pathogenicity of Alternaria patula on French marigold （Tagetes patula） ［J］. Plant Pathology， 2019， 68（4）： 678688.

［27］DI FRANCESCO A， RUSIN C， DI FOGGIA M， et al. Characterization of apple cultivar susceptibility to Neofusicoccum parvum Brazilian strains ［J］. European Journal Plant Pathology， 2020， 156（3）： 939951.

［28］BOUDART G， CHARPENTIER M， LAFITTE C， et al. Elicitor activity of a fungal endopolygalacturonase in tobacco requires a functional catalytic site and cell wall localization ［J］. Plant Physiology， 2003， 131（1）： 93101.

［29］RAMOS A M， GAILY M， GARCIA M C， et al. Pectinolytic enzyme production by Colletotrichum truncatum， causal agent of soybean anthracnose ［J］. Revista Iberoamericana de Micologia， 2010， 27（4）： 186190.

［30］PALANIYANDI S A， YANG S H， SUH J W. Extracellular proteases from Streptomyces phaeopurpureus ExPro138 inhibit spore adhesion， germination and appressorium formation in Colletotrichum coccodes ［J］. Journal of Applied Microbiology， 2013， 115（1）： 207217.

［31］BENDANIEL B H， BARZVI D， TSROR L. Pectate lyase affects pathogenicity in natural isolates of Colletotrichum coccodes and in pelA genedisrupted and geneoverexpressing mutant lines ［J］. Molecular Plant Pathology， 2012， 13（2）： 187197.

［32］SUNITHA V H， NIRMALA DEVI D， SRINIVAS C. Extracellular enzymatic activity of endophytic fungal strains isolated from medicinal plants ［J］. World Journal Agricultural Sciences， 2013， 9（1）： 19.

［33］WANG Fen， LU Yuanyuan， LIU Miaomiao， et al. Effects of iron on the asexual reproduction and major virulence factors of Curvularia lunata ［J］. European Journal of Plant Pathology， 2020， 157（3）： 497507.

［34］YANG Yingqing， LAN Bo， JIAN Yanlin， et al. Infection process and pathogenic mechanism of Phomopsis asparagi， the asparagus stem blight pathogen ［J］. Phytoparasitica， 2016， 44（1）： 1118.

［35］WHIFFEN L K， MIDGLEY D J， MCGEE P A. Polyphenolic compounds interfere with quantification of protein in soil extracts using the Bradford method ［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2007， 39（2）： 691694.

［36］李紀顺， 陈凯， 李玲， 等. 木霉融合子Tpf2的定殖及其对番茄防御酶系的影响［J］. 植物保护， 2018， 44（4）： 6569.

［37］GEETHU C， RESNA A K， NAIR R A. Characterization of major hydrolytic enzymes secreted by Pythium myriotylum， causative agent for soft rot disease ［J］. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology， 2013， 104（5）： 749757.

［38］BEZERRA J D P， SANTOS M G S， SVEDESE V M， et al. Richness of endophytic fungi isolated from Opuntia ficusindica Mill. （Cactaceae） and preliminary screening for enzyme production ［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2012， 28（5）： 19891995.

［39］CNOSSENFASSONI A， BAZZOLLI D M S， BROMMONSCHENKEL S H， et al. The pectate lyase encoded by the pecCl1 gene is an important determinant for the aggressiveness of Colletotrichum lindemuthianum ［J］. Journal of Microbiology， 2013， 51（4）： 461470.

［40］XUE Caiyun， ZHOU Rujun， LI Yuanjie， et al. Cellwalldegrading enzymes produced in vitro and in vivo by Rhizoctonia solani， the causative fungus of peanut sheath blight ［J/OL］. Peerj， 2018， 6： e5580. DOI： 10.7717/peerj.5580.

［41］IKOTUN T. Cell walldegrading enzymes produced by Penicillium oxalicum Curie et Thom ［J］. Mycopathologia， 1984， 88： 1521.