云木香内生细菌的分离鉴定及其对大丽轮枝菌的抑制作用

2024-06-08 14:55金利容许冬王玲丛胜波杨妮娜李文静尹海辰黄薇武怀恒万鹏
植物保护 2024年3期
关键词:大丽枝菌黄萎病

金利容 许冬 王玲 丛胜波 杨妮娜 李文静 尹海辰 黄薇 武怀恒 万鹏

摘要

从药用植物云木香中分离得到41株内生细菌,采用细菌16S rRNA基因测序的方法对这些菌株进行鉴定,结果显示,这些云木香内生细菌分别属于6个属,其中假单胞菌属Pseudomonas和拉恩氏菌属Rahnella为优势菌属。采用对峙培养方法对这些菌株进行筛选,发现其中12株内生细菌对大丽轮枝菌Verticillium dahliae具有抑制作用,其中有2株属于拉恩氏菌属Rahnella,7株属于假单胞菌属Pseudomonas,3株属于沙雷氏菌属Serratia。12株内生细菌对棉花黄萎病的温室防效评估结果表明,假单胞菌属菌株R16、R113和S12对棉花黄萎病的温室防效达到55%以上,具有潜在的生产利用价值。

关键词

云木香; 内生细菌; 鉴定; 大丽轮枝菌; 抑菌活性

中图分类号:

S 476; S 435621

文獻标识码: A

DOI: 10.16688/j.zwbh.2023251

Isolation, identification of endophytic bacteria from Aucklandia costus and its inhibitory effect on Verticillium dahliae

JIN Lirong, XU Dong, WANG Ling, CONG Shengbo, YANG Nina, LI Wenjing, YIN Haichen,HUANG Wei, WU Huaiheng, WAN Peng*

(Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs,

Hubei Key Laboratory of Crop Disease, Insect Pests and Weeds Control, Institute of Plant Protection, Soil and

Fertilizer Research, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China)

Abstract

Fortyone strains of endophytic bacteria were isolated from the medicinal plant Aucklandia costus, and the 16S rRNA gene sequencing method was employed for their identification. The results showed that the endophytic bacteria belonged to six genera, with Pseudomonas and Rahnella being the predominant ones. Subsequently, these isolates were screened via confrontation culture, where 12 isolates exhibited inhibitory effects against Verticillium dahliae, among which two isolates were identified as Rahnella spp., seven isolates as Pseudomonas spp., and three as Serratia spp.. In a greenhouse experiment evaluating the effectiveness of these 12 isolates against cotton Verticillium wilt, showing that the control effect of R16, R113, and S12 belonging to Pseudomonas exceeded 55%, indicating their potential utility in production.

Key words

Aucklandia costus; endophytic bacteria; identification; Verticillium dahliae; antifungal activity

植物内生菌是寄生在植物体内而不引起植物明显症状的一类微生物,包括真菌、细菌和放线菌等[1]。植物内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中形成一种互惠互利的和谐关系,宿主植物为植物内生菌提供合适的环境和营养物质,植物内生菌则能通过促进植物生长[2]、增强植物的抗病及抗逆能力[3]、帮助植物抵御生物或非生物的胁迫等多种方式增强植物的适应性[4]。

我国药用植物资源丰富,关于中草药的研究和利用也有着悠久的历史,现在仅临床常用的植物药材就有700余种[5],很多药用植物因其特殊的生境蕴藏着丰富而独特的内生菌资源。之前人们往往更关注药用植物的医用价值,但随着国家大力提倡可持续发展的绿色生态农业,药用内生菌资源在农业生产上的应用也受到了越来越多的关注。研究表明,一些药用植物内生菌能够促进植物生长,例如,从人参组织中分离的多株内生细菌具有产嗜铁素、产吲哚乙酸等特性,其中有3株内生细菌具有促生特性[6]。从葛根Pueraria montana var. lobata的根瘤、根系和根部愈伤组织分离出的223个菌株中,15株兼具固氮、溶磷、产嗜铁素、产吲哚乙酸4种促生特性,17株兼具3种促生特性[7]。一些药用植物的内生细菌是通过合成吲哚乙酸实现其对宿主的促生作用[8]。当小麦接种一株金银花Lonicera japonica中分离的内生类芽胞杆菌Paenibacillus菌株后,小麦幼苗生长速率和叶绿素含量显著提高[9]。一些药用植物内生菌还能增强植物对重金属和高盐等非生物胁迫的耐受能力。从印度高盐地区的长春花Catharanthus roseus中分离的耐盐内生细菌Achromobacter xylosoxidans通过降低乙烯水平和增加多种抗氧化酶含量而增强植物的盐胁迫抗性[10]。药用植物内生菌也能产生一些抗菌活性物质如生物碱、多肽类、萜类等以及一些新的化合物,可用于植物病害的防治。例如,从黄花蒿Artemisia annua的1株炭疽菌属Colletotrichum sp.内生真菌中分离的化合物中有5种对小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici、纹枯病菌Rhizoctonia cerealis、根腐病菌Bipolaris sorokiniana和辣椒疫霉Phytophthora capsici等具有明显的抑制作用[11]。从雷公藤Tripterygium wilfordii中分离得到的内生真菌Cryptosporiopsis cf. quercina可產生活性化合物cryptocandin,该化合物可抑制核盘菌Sclerotinia sclerotiorum和灰霉病菌Botrytis cinerea等多种植物病原真菌活性[12]。然而,目前关于药用植物内生菌的研究较为匮乏,据不完全统计,近10年来药用植物内生菌相关研究涉及的种类仅占常用药用植物的9%左右[5],可见,药用植物的内生菌资源亟待开发。

云木香Aucklandia costus是一种菊科植物,主产于云南、四川等地,现广泛栽培于我国湖南、湖北、广东、广西、陕西、甘肃和西藏等地。云木香在临床上以根茎入药,具有健胃消食、行气止痛、降压利尿、抗菌止泻的医用功效[13]。关于云木香内生细菌的研究,国内尚未见报道。

棉花黄萎病是棉花上的一种重要病害,其病原菌为大丽轮枝菌Verticillium dahliae,该病的发生会严重影响棉花的产量和品质。棉花黄萎病是土传维管束病害,加上V.dahliae能够产生抗逆性强且能在土壤中长期存活

的休眠结构微菌核,增加了病害的防治难度。大丽轮枝菌寄生在棉花维管组织内,利用植物内生菌防治此病害具有天然的优势。

本研究从药用植物云木香中分离、鉴定内生细菌,筛选对大丽轮枝菌具有抑制作用的菌株,评估分离菌株对棉花黄萎病的温室防效,旨在挖掘良好的生防菌资源用于棉花黄萎病的防治。

1 材料与方法

1.1 供试材料与培养基

云木香植物为云南省农业科学院提供。落叶型大丽轮枝菌(Vd)菌株V991b为本实验室保存。

营养琼脂培养基(NA):细菌蛋白胨50 g,牛肉浸膏 30 g,氯化钠 50 g,琼脂200 g,蒸馏水

1 000 mL,121℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,121℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏30 g,蛋白胨 50 g,蒸馏水1 000 mL,pH 70。

柠檬酸盐利用培养基:硫酸镁02 g,磷酸二氢铵 10 g, 氯化钠50 g,柠檬酸 20 g,1%溴百里香酚蓝3 mL,琼脂 120 g,蒸馏水1 000 mL,pH 68。

甲基红试验及VP试验培养基:蛋白胨50 g,葡萄糖50 g,磷酸氢二钾 50 g,蒸馏水1 000 mL,pH 70~72。

明胶液化培养基:蛋白胨 50 g,明胶 1200 g,牛肉浸膏 30 g, 蒸馏水1 000 mL,pH 72~74。

淀粉水解培养基:牛肉浸膏20 g,蛋白胨 175 g,淀粉20 g,琼脂170 g, 蒸馏水1 000 mL,pH 70。

丙二酸利用培养基:酵母膏 10 g,硫酸铵20 g,磷酸二氢钾06 g,磷酸氢二钾04 g,氯化钠20 g,丙二酸钠 30 g,溴百里香酚蓝 0025 g,蒸馏水1 000 mL,pH 70~74。

1.2 方法

1.2.1 云木香内生细菌的分离

云木香组织用自来水反复冲洗,再用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将其根和茎剪成05 cm的小段,称取组织10 g,依次用75%乙醇浸泡1 min,5%次氯酸钠浸泡3 min,75%乙醇浸泡30 s,无菌水冲洗5~8次,最后加入5 mL无菌水,用灭菌研钵将组织研碎,将组织匀浆液用无菌水分别稀释10倍和100倍,取两种稀释液各10、20 μL和100 μL涂布于NA培养基平板中,同时,吸取样本处理时最后一次无菌水冲洗液100 μL涂布于NA培养基作为对照培养,若培养后无细菌生长,则说明表面消毒彻底。将培养皿置于28℃恒温培养箱中培养24 h。挑取不同形态的内生细菌单菌落至2 mL NA液体培养基中,28℃振荡培养14 h;将菌液在NA平板中划线培养,挑单菌落,观察其菌体形态,经多次转接得到纯化菌株,并保存于-80℃低温冰箱中。

1.2.2 云木香内生细菌16S rRNA基因序列的分子鉴定

活化所分离的云木香内生细菌,采用细菌基因组提取试剂盒(天根,DP30202)提取菌株基因组DNA,采用16S rRNA 通用引物27 F 和1492 R(27F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′,1492R:5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′)进行PCR 扩增。PCR 反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,53℃退火45 s,72℃延伸1 min,35 个循环;72℃延伸10 min。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对,根据比对结果初步判断每个菌株所在属,进而分析云木香内生细菌的多样性和优势菌属。

1.2.3 筛选对大丽轮枝菌具有抑菌活性的内生细菌

云木香内生细菌对大丽轮枝菌的抑菌试验采用平板对峙培养法。在大丽轮枝菌V991b的菌落边缘打取6 mm菌饼,转接到PDA平板后在25℃条件下黑暗培养2 d,用记号笔在距V991b菌落边缘15 mm处标记4个点,分别在4个点处加5 μL内生菌菌液,25℃条件下黑暗培养5 d(大丽轮枝菌生长缓慢),以加5 μL无菌水作为空白对照,每处理3次重复。分别在大丽轮枝菌生长2 d和7 d时采用十字交叉法测量V991b的菌落直径,计算两者的差值得到5 d内大丽轮枝菌的菌落生长直径,并按照下列公式计算抑菌率(PI)。

PI=(对照组大丽轮枝菌5 d内的菌落生长直径-对峙组大丽轮枝菌5 d内的菌落生长直径)/对照组大丽轮枝菌5 d内的菌落生长直径×100%。

1.2.4 代表性菌株的形态鉴定和生理生化鉴定

将筛选获得的具有抑菌活性的代表性菌株在NA平板中划线,28℃培养16 h后观察其培养性状,记录菌落的大小、颜色、形态、干燥程度等,挑取少许菌体进行革兰氏染色,参照东秀珠等[14]的方法对菌株进行生理生化鉴定。

1.2.5 代表性菌株系统发育树构建

将筛选获得菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中相关种属的16S rRNA基因序列进行比对分析,用MEGA 51建立系统发育树。用邻接法(neighborjoining method)计算进化距离,采用Pdistance法和Kimura twoparameter双参数法构建系统进化树,进化树分支的置信度采用bootstrap法分析,重复次数为1 000次。

1.2.6 代表性菌株抑制棉花黄萎病的温室试验

将筛选获得的云木香内生细菌菌株在NA平板上划线活化16 h(28℃),挑取单菌落用NA液体培养基扩大培养,培养液10 000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀用无菌水调整浓度至1×108 cfu/mL备用。将脱绒的常规感病棉花品种‘冀棉11的种子表面消毒后种入盛有营养基质的长方形塑料盒(长×宽×高=440 mm×290 mm×75 mm)中,每个塑料盒留苗30~40株。待棉苗长至2片真叶,用200 mL云木香内生细菌菌液对棉苗进行均匀的灌根处理,每个云木香内生菌菌株对应一个塑料盒,灌根处理3 d后进行大丽轮枝菌的接菌试验。

大丽轮枝菌的接菌方法:大丽轮枝菌菌株V991b在PDA平板中25℃培养10 d后,用无菌水洗下孢子并过滤,调整孢子浓度至5×106个/mL备用。将棉苗从营养基质中拔出,用自来水轻轻冲洗根部表面,用大丽轮枝菌的孢子悬浮液浸根处理5 min。以先用200 mL无菌水灌根再用大丽轮枝菌的孢子悬浮液浸根作为阳性对照。以均用无菌水处理作为阴性对照。浸根后将每个内生菌菌株处理棉苗和对应的营养基质移栽到一次性塑料钵(直径×高=70 mm×100 mm)中,一个钵中移栽3~4株棉苗,每处理包括3个重复,1个重复10株棉苗。温室温度保持在25~28℃,隔天浇1次水,保持合适的湿度。接种后15、20、25、30 d按5级标准调查和记载发病严重度[15],计算病情指数(DI)和防效,以第30天调查结果为最终评价指标。

DI=∑(各级病株数×相应级值)调查总株数×4×100;

防效= [(对照病情指数-菌株处理病情指数)/对照病情指数]×100%。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 220软件进行统计分析。处理间差异采用方差分析(ANOVA)和Duncan氏新复极差法进行检验。

2 结果与分析

2.1 云木香内生细菌的分离和鉴定

从云木香的根部和茎部共分离到41株内生细菌菌株,其中从根部分离28株,从茎部分离13株。利用PCR扩增技术获得41个菌株的16S rRNA基因序列,测序结果在NCBI数据库上进行同源性比对,比对结果显示,有20株与假单胞菌属Pseudomonas的一致性在99%以上,14株与拉恩氏菌属Rahnella的一致性在99%以上,3株与沙雷氏菌属Serratia一致性在99%以上,2株与肠杆菌属Enterobacter的一致性在99%以上,1株与哈夫尼亚菌属Hafnia的一致性在99%以上,1株与芽胞杆菌属Bacillus的一致性在99%以上(表1)。结果表明,云木香内生细菌表现出较为丰富的多样性,假单胞菌属和拉恩氏菌属是云木香内生菌的优势菌属。41个菌株中,只有1株是属于芽胞杆菌门Bacillota的芽胞杆菌纲,而其他40个菌株均属于变形菌门的γ变形菌纲。

2.2 云木香内生细菌对大丽轮枝菌的抑菌效果

通过对峙培养方法对分离出的41株云木香内生菌进行筛选,获得12株对大丽轮枝菌具有显著拮抗作用的菌株(表2,图1)。其中6株来自根部,6株来自茎部。它们对大丽轮枝菌抑菌率为177%~633%,其中菌株S213的抑菌效果最好(表2)。

1) 表中数据为平均值±标准差。同列不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验处理间在005水平上差异显著。

Data in the table are mean±standard deviation. Different letters in the same column indicate significant differences at 005 level based on Duncans new multiple range test.

2.3 对大丽轮枝菌有抑菌活性的菌株的形态和生理生化特性

12株对大丽轮枝菌有抑菌活性的菌株,其菌落形态特征及生理生化特征见表3和表4。菌株R113,R14,R213,R210,S16,R16,S12接触酶试验阳性,均能分解利用柠檬酸盐、丙二酸和明胶,为葡萄糖氧化发酵型,甲基红试验和VP试验阴性,产淀粉酶,属革兰氏阴性菌;菌株S213, S216、R21、S211和S17接触酶试验阳性,能分解柠檬酸盐和丙二酸,不能分解明胶,为葡萄糖氧化发酵型,甲基红试验阴性,VP试验阳性,产淀粉酶,属革兰氏阴性菌。

2.4 对大丽轮枝菌有抑菌活性的菌株的分子鉴定

经16S rRNA基因序列的扩增、测序和比对分析得到12株云木香内生细菌菌株的16S rRNA基因序列,在NCBI网站上与相关菌属进行序列比对,

结果显示,7个菌株R113,R14,R213,R210,S16,R16,S12与假单胞菌属菌株的序列最相似,2个菌株S211和S17与拉恩氏菌属菌株的序列最相似,3个菌株S213、S216和R21与沙雷氏菌属菌株的序列最相似(表5)。

2.5 对大丽轮枝菌有抑菌活性菌株基于16S rRNA序列的系统发育树

将12株内生细菌菌株与参考菌株的16S rRNA序列进行比对分析,用MEGA 510软件构建系统发育树,结果如图2所示。菌株S211和菌株S17与Rahnella aquatilis及R.aceris的遗传关系最近,结合细菌的形态特征和生理生化特征,将菌株S211和菌株S17鉴定为拉恩氏菌属Rahnella spp.。菌株R14,R213,R210,S16,R16和R113聚于同一分支,與Pseudomonas koreensis,Pseudomonas putida及Pseudomonas chlororaphis的遗传关系最接近;菌株S12与Pseudomonas grimontii的遗传关系最近,因此,菌株R14,R213,R210,S16,R16和R113被鉴定为假单胞菌属Pseudomonas spp.,菌株S12被鉴定为Pseudomonas grimontii。菌株S213,R21和S216与Serratia sp.的遗传距离最接近,它们被鉴定为沙雷氏菌属Serratia spp.。

2.6 对大丽轮枝菌有抑菌活性菌株对棉花黄萎病的温室防效

温室试验结果(表6)显示,菌株Pseudomonas sp. R16、Pseudomonas sp. S12和Pseudomonas sp. R113的温室防效较好,均能达到55%以上,其中菌株Pseudomonas sp. R16的防效最好,达到638%。与抑菌试验的结果进行比较发现,温室防效与室内平板抑菌效果并不是正相关,菌株Pseudomonas sp. R16的防效最好,但是其对大丽轮枝菌的平板抑制率只有235%。菌株Serratia sp. S213的平板抑制效果最好,但其温室防效为465%,低于上述3种假单胞菌。

3 结论与讨论

在植物病害的防治中,化学农药的使用带来了对生态环境的污染和农药残留等众多问题,生物防治被认为是一种极具应用前景的防治手段。药用植物内生菌是一种天然的菌种资源,很多药用植物内生菌能够产生生物碱、甾体、萜类等抗菌和抗氧化类的代谢产物,对植物生长和植物病害的防治具有积极作用,因此,药用植物内生菌作为生防因子的开发和利用具有重要的科学价值和广泛的应用前景。

云木香是一种重要的中草药。本研究从云木香的根部和茎部分离出41株内生细菌,分属于6个属,说明云木香内生菌具有较为丰富的多样性。其中假单胞菌属和拉恩氏菌属是优势菌属,分别占比488%和341%,这两个属在云木香的根部和茎部都能分离到。文献记载与药用植物相关的内生细菌共有11目88属。最常见的属为芽胞杆菌属、泛菌属Pantoea和假单胞菌属[16]。很多内生细菌具有生物学功能,如链霉菌能够促进植物的生长发育[17],芽胞杆菌、假单胞菌和类芽胞杆菌Paenibacillus可以增强药用植物的抗性和代谢[18]。黄小茜等[7]从葛根组织中分离得到223个菌株,这些菌株隶属于2门4纲10科19属,其中芽胞杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属Agrobacterium、肠杆菌属是葛根内生细菌的优势菌群。张敏等[19]发现,芽胞杆菌属、假单胞菌属、泛菌属和沙雷氏菌属Serratia是甘草内生细菌的主要优势种群。假单胞菌属是它们共同的优势菌属。假单胞菌属有200多个种,广泛存在于自然界的土壤、水、动植物体内,该属细菌既是植物致病菌,也是重要的生防菌[20]。本研究中从云木香的根部和茎部所分离的菌的种类也存在一定的差异,例如,肠杆菌属和芽胞杆菌属仅从云木香的根部分离得到,而哈夫尼亚菌属仅从云木香的茎部分离得到。据报道,不同植物的内生细菌种类存在差异,同一植物的不同部位内生细菌的种类也存在差异。Mcinroy等[21]从生长期的棉花‘DES119的根部和茎部分离到了36个种,棉花根部的优势菌属有沙雷氏菌Serratia spp.、放射性农杆菌Agrobacterium radiobacter和伯克霍尔德氏菌Burkholderia solanacearum,棉花茎部的优势菌有巨型芽胞杆菌Bacillus megaterium和短小芽胞杆菌Bacillus pumilus。当然,这种差异可能与分离的菌株数量有关,增加内生菌的分离数量更能体现不同组织的菌株多样性。

本研究中,我们通过室内筛选从41株云木香内生细菌中获得12株对大丽轮枝菌具有抑制作用的菌株,并评估了这些菌株对棉花黄萎病的温室防效,发现室内抑菌作用最好的3个菌株分别是1株沙雷氏菌和2株拉恩氏菌,而温室防效最好的3个菌株均为假单胞菌,其中菌株Pseudomonas sp. R16的防效最好,能够达到638%。利用假单胞菌对由大丽轮枝菌引起的黄萎病进行生物防治有较为广泛的报道,如荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens PICF7[2223]或恶臭假单胞菌Pseudomonas putida PICP5[24]对不同作物如棉花[25]、橄榄[26]、茄子[27]和马铃薯[28]等作物上的黄萎病均具有很好的防效。这些菌株通过拮抗作用、竞争作用、重寄生作用以及诱导抗性等多种机制发挥其防效。从结果我们也可以看出,室內抑菌活性和温室防效的结果并不是完全吻合的,其可能原因在于菌株对棉花黄萎病的防效机制不只是拮抗作用,还通过其他的机制抑制棉花黄萎病菌的生长和繁殖,或者通过多种机制共同发挥作用。未来,我们将筛选防效稳定的菌株开展进一步的机制和应用研究。

参考文献

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(責任编辑:杨明丽)

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