反相离子对色谱法测定复方丹参制剂中三七素的含量*

黄晓晨，罗亦灵，朱 敏

(1 南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300；2 泰州市药品检验院，江苏 泰州 225300)

复方丹参制剂为中药制剂，具有活血化瘀、理气止痛等功效，能够改善心脏、肝脏的微循环，多用于心脑系统血管疾病[1]。临床有浓缩丸、喷雾剂、片剂、胶囊等多种剂型，大多数剂型在《中国药典》中均有相应的规定，为防治心脑血管疾病不可缺少的有效药[2]。其主要的原料药物由丹参、三七、冰片组成，丹参的作用点侧重于血管，三七的作用点侧重于心肌；丹参与三七配伍后存在协同互补效应，用以增强药物疗效[3]。三七素是一种经过蒸烫后易分解的水溶性成分，主要能够增加血小板数量，能够缩短大鼠凝血的时间，其机制与激活血小板AMPA受体，进而调控钙内流、cAMP生成，TXA2释放有关；还推测它的止血作用可能与促进组胺而血管收缩有关，因为其可以增强诱导豚鼠主动脉收缩。

2020版《中国药典》中没有对复方丹参制剂中的三七素含量的规定，查阅整理相关文献资料发现[4]，也没有对复方丹参制剂中三七素的考察，而三七素作为三七药材中拥有最强止血功效的单体活性成分，有待进一步的研究与开发。本文现采用Waters XTERRA RP18(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)色谱柱，配合PDA检测器，并且通过对样品处理方法优化，对复方丹参制剂中的三七素含量进行研究，为进一步研究复方丹参制剂的质量、临床应用提供参考依据，有利于复方丹参制剂的开发与利用。

图1 三七素(三七氨酸)结构式图Fig.1 Structure diagram of notoginsenoside

1 实验仪器与试药

1.1 仪 器

Waters e2695型高校液相色谱仪(配2998PDA检测器)；XS1050U型十万分之一电子天平，梅特勒-托利多；52000型KUDOS超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MERRLER TOLEDO SevenEasy pH计；色谱柱：Waters XTERRA反相C18(RP)，4.6 mm×250 mm，3.5 μm；ANPEL水相针式滤器(聚醚砜)，25 mm，0.45 μm；Milli-Q Reference超纯水机，上海君翼设备有限公司；一次性使用无菌注射器(带针，5 mL)。

1.2 试 药

无水磷酸二氢钠来源于国药集团化学试剂有限公司(批号为20190611)；三七素对照品(批号为26620010)；10%浓度的四丁基氢氧化铵的水溶液为分析纯，来源于国药集团化学试剂有限公司(批号为20190601)；复方丹参制剂样品来源于9批不同厂家。

表1 样品生产厂家和批号Table 1 The manufacturers and lot numbers of the samples

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱使用的是Waters XTERRA RP18(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)。流动相为0.03%四丁基氢氧化铵的水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氢钠的甲醇溶液比例为95∶5，用磷酸调节pH值为3.4。柱温为25 ℃，检测波长：220 nm，流速：1 mol/mL，进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

采用十万分之一电子天平精密称定三七素对照品13.46 mg，置于50 mL容量瓶中，加入纯水定容，超声使其完全溶解后，再用纯水定容至刻度线，摇匀，制成每1 L中含269 mg三七素的溶液，作为对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

取复方丹参制剂样品适量，称重，研磨成细粉，取约0.8 g，精密称定(万分之一天平)，置具塞锥形瓶中，精密量取纯水50 mL，超声30 min，摇匀，经0.45 μm水相针式滤器滤过，过滤后所得溶液作为供试品溶液。

2.4 系统适应性

按“2.1” 项下色谱条件，分别精密量取10 μL对照品、样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。三七素对照品、复方丹参制剂样品的色谱图见图2，空白溶剂和辅料的色谱图见图3。

图2 三七素对照品(A)和复方丹参制剂样品(B)的HPLC色谱Fig.2 HPLC chromatograms of the reference substance of Dencichine (A) and the sample of compound Danshen preparation (B)

图3 辅料(A)和空白溶剂(B)的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of excipients (A) and blank solvent (B)

2.5 线性关系的考察

三七素供试品一系列溶液的制备：精密移取三七素对照品贮备液适量，定容，配制成一系列不同浓度对照品溶液，浓度分别为269.01，134.51，67.26，33.72，16.61，8.41，4.21，2.11 mg·L-1。按“2.1” 项下优选色谱条件，分别精密量取不同浓度溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积×10-4(A×10-4)为纵坐标(y)，浓度C(mg·L-1)为横坐标(x)，建立线性回归曲线，回归方程为y=1.299 6x+0.11，相关系数r=1。结果表明三七素在2.01～269.11 mg·L-1浓度范围内具有良好的线性关系。

2.6 检测限和定量限

2.6.1 定量限

精密量取浓度为2.10 mg·L-1的溶液2.5 mL于10 mL容量瓶中定容，浓度为0.525 mg·L-1，测得信噪比S/N约为10，定量限为26.25 ng，色谱图见图4。

图4 三七素定量限的色谱图Fig.4 Chromatogram of the limit of quantification of Dencichine

2.6.2 检测限

精密量取“2.5”项下，浓度是33.72 mg·L-1的溶液0.5 mL置于50 mL容量瓶中，定容，取稀释液2 mL至10 mL容量瓶中，定容，此时溶液浓度为0.067 mg·L-1，测得信噪比S/N约为3，其检测限为3.36 ng，定量限的色谱图见图5。

图5 三七素检测限的色谱图Fig.5 Chromatogram of the detection limit of Dencichine

2.7 精密度

选取“2.5”项下，浓度为33.72 mg·L-1的对照品溶液，进样10 μL，进样6次，记录色谱峰面积，计算RSD值。结果33.72 mg·L-1对照品溶液中三七素峰面积RSD为1.16%<2%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性

2.8.1 溶液的制备

照“2.3”项下，取编号为4的复方丹参片样品，平行称定6份，取样量分别为0.803 7，0.803 9，0.803 6，0.803 9，0.803 9，0.803 9 g，加纯水超声30 min，制备成6份供试品溶液。

2.8.2 重复性检测

按“2.1”项下，供试品进样量10 μL，记录色谱图，色谱峰面积RSD分别为1.4%<2%，说明该方法重复性良好。

2.9 溶液稳定性

照“2.1”项下，供试品进样量10 μL，记录0 h峰面积，在室温条件下放置2，4，8，12，24，48 h后再进样，测的结果与0时的峰面积相比较，结果表明48 h内，7次测定三七素对照品溶液，其峰面积的RSD为1.08%。结论说明三七素供试品溶液能够放置在室温状态下48 h以内保持稳定。

2.10 专属性

量取3.5 mmol·L-1磷酸二氢钠甲醇溶液和0.03%四丁基氢氧化铵，放置于100 mL烧杯中，加水溶解，配置为流动相，保持柱温25 ℃[5]。在保证其他成分不干扰实验测定的情况下，缩短分析时间，考察指标为保留时间、拖尾因子、分离度以及理论塔板数，并且对流动相比例、pH值大小、检测器的波长进行单因素考察。

2.10.1 流动相比例的考察

朱静等[6]在研究中发现将实验的流动相比例调节在80∶20时，洗脱效果较佳，有较好分离效果。选用80∶20的流动相比例。采用不同比例的0.03%四丁基氢氧化铵的水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氢钠的(80∶20、85∶15、90∶10、95∶5)甲醇溶液，实验结果见表2，最终选择的流动相比例为95∶5。

表2 不同比例的流动相的实验结果Table 2 Experimental results of different proportions of mobile phase

2.10.2 流动相pH值的考察

用Waters XTERRA(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)反相C18色谱柱，流动相为0.03%四丁基氢氧化铵水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氢钠的甲醇溶液(95∶5)，流速设置为1 mL/min，调节流动相的pH值进行考察，综合考虑保留时间、分离度、对称因子和理论塔板数，选择流动相的pH值为3.4，实验结果见表3。

表3 不同pH值的流动相的实验结果Table 3 Experimental results of mobile phases with different pH values

2.10.3 小结

通过对柱温、流动相比例、pH值、检测波长等4个方面的单因素考察，结果表明，柱温设置为25 ℃，流动相为0.03%四丁基氢氧化铵的水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氢钠的甲醇溶液(95∶5，1 mol·L-1磷酸调节pH值为3.4)。检测波长设置为220 nm色谱条件下，三七素与其他成分分离度较好，无干扰，保留时间大约为12.8 min，三七素的理论塔板数不低于12 000。

2.11 加样回收实验

精密称定编号为4的复方丹参片粉末约0.4 g，置于具塞锥形瓶中，按照药典，加入三七素对照品的量与供试品中待测定三七素量之比分别为1.5∶1，1∶1，0.5∶1，按照供试品溶液制备方法制成高、中、低三种质量浓度的溶液各三份(n=3)，测定其中所含三七素的含量，按照此公式：加样回收率=测得量/(含有量+加入量)，计算加样回收率，结果见表4。

表4 复方丹参制剂中三七素的加样回收率Table 4 The recovery rate of Dencichine in compound Danshen preparations

复方丹参样品中的三七素加样回收率均在95%到105%之间，三种不同质量浓度溶液的回收率的RSD分别为1.49%，1.39%，0.95%，均小于2%，结果表明测量系统和本法的准确度均良好。

2.1.2 含量测定

取样按照“2.3”项下，制备由9个生产厂家的供试品溶液各三份(n=3)，进样量10 μL，按照“2.1”项下，进行测定，结果见表5。实验表明，不同批次的复方丹参制剂中，三七素的质量分数为0.02～3.03 mg/g，含量存在显著差异，尤其是编号为1号的含量最低，只有0.03 mg/g，7号公司生产的制剂中三七素含量最高，达到3.01 mg/g。

表5 不同来源样品的复方三七片中三七素含量Table 5 The content of Dencichine in compound Sanqi tablets from different sources

从表5中可以看出，来自不同厂家的复方丹参制剂中三七素的含量存在明显差异，对比含量测定的结果，不同剂型之间的差异也较大。造成上述差异的原因可能主要是两个方面，原料和生产工艺的不同。原料药的不同产地、不同加工方式、不同提取工艺以及可能存在的三七不同部位入药的情况，都可能造成三七素的含量差异，表明以三七素为指标，复方丹参制剂的质量存在参差不齐的现象，因此有必要对复方丹参制剂进行多指标评价，以求全面把控复方丹参制剂的质量、保证本药临床使用的有效性。

3 样品处理方法的优化

在寻找样品最优处理方法时，选择改变超声时间，记录超声时间对应的样品的峰面积。结果见表6。实验结果表明，超声时间为30 min，样测得的含量最高，此时提取效率最高。鞠政财、何纯勇等[7]研究证实，纯水超声提取的效率高于高温水浴回流1 h所得到的含量。三七素极性较大，有较好的水溶性，且高温下不稳定，因此选用纯水超声提取，简单方便。

表6 超声时间对三七素提取效率的影响Table 6 The effect of ultrasound time on the extraction efficiency of Dencichine

4 结 论

复方丹参制剂是以丹参为主要成分，三七和冰片为辅组成的具有代表性的中成药，功能主治活血化瘀、理气止痛。药理学研究表明，其具有良好的临床治疗效果，如抗血栓、改善缺血细胞等作用[2]。杨艳丽等[8]研究表明其可作为心绞痛、冠心病的治疗优选。目前在《中国药典》中，对复方丹参制剂的含量测定主要是以丹参酮ⅡA、丹酚酸B，人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1为指标成分，其它相关研究也多以这几种指标成分进行研究。但是复方丹参制剂中也使用了三七作为原料药，其价格不菲，有金不换的美誉，三七中具有强止血功效的单体成分就是三七素，因此对其进行含量测定具有质量控制意义。中药复方制剂是由多个成分协同配合发挥药效，复方制剂中各成分在机体内互相反应互相作用。

本文主要探究了反相离子对色谱法测定复方丹参制剂中三七素的含量测定效果，这也是第一次利用反相离子对色谱法测定复方丹参制剂中三七素的含量。目前现三七素含量测定主要有柱前衍生化法，毛细管区带电泳检测法[9]，氨基酸自动分析仪测定等方法，但是考虑到成本、灵敏度不佳、操作繁琐以及稳定性等原因，选择使用反相离子对色谱法进行含量测定。对于反向离子的选择，一般来说测定碱性样品会选择烷基磺酸类，测酸性样品则是使用四丁基铵盐[10]，四丁基氢氧化铵的铵离子能够链接到C18上[11]，能够对复方丹参片中三七素含量进行检测。本实验测定复方丹参制剂中三七素含量的方法具有准确、稳定、快速、方便等优势，而且重复性良好、专属性强、加样回收率在95%～105%之间，可以用于复方丹参制剂中三七素的含量测定，为其临床新应用的开发、拓展质量控制范围提供一定参考。