长链脂酰辅酶A 合成酶4 调控铁死亡在急性脊髓损伤治疗中的研究进展

何天 白登彦 朱祥辉 张海军

脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统疾病，根据病因不同可分为外伤性SCI（如车祸、跌倒引起椎体骨折、脱位并发脊髓受损等）和非外伤性SCI（如肿瘤、椎间盘压迫脊髓等）。原发性损伤后数小时内神经元和神经胶质细胞会出现继发性缺血、变性甚至死亡，而继发性损伤则在组织学上表现为胶质瘢痕和囊腔形成以及内源性再髓鞘化和轴突再生不良[1]，可导致SCI 治疗出现效果差、恢复慢、致残率高等问题。因此，保证神经元和神经胶质细胞存活成为治疗的关键。近30年来，SCI 全球发病率有上升趋势[2]。我国SCI 年患病率约37/100 万，男性明显多于女性，年龄在34.7～54.4 岁，主要病因为交通事故和高空坠落伤，其他原因有跌倒和煤矿作业等[3]。高昂的住院费用和高致残率给SCI 患者带来了巨大的经济和心理负担。

细胞死亡是继发性SCI 的最终阶段。有研究证实，SCI 患者细胞会发生各种调节性细胞死亡（RCD），如焦亡、凋亡、自噬依赖性细胞死亡、程序性坏死以及PARP-1 依赖的细胞死亡[4-9]。2012 年，Dixon 等[10]发现了一种由erastin-system XC（-）介导的新型非凋亡性细胞死亡方式，并将其命名为铁死亡。近年来，有学者发现铁死亡抑制剂可以减轻脊髓挫伤大鼠的铁死亡，并促进其功能恢复[11]，为SCI 治疗提供了新思路。

1 铁死亡

1.1 铁死亡概述

细胞死亡根据是否可调控，可分为RCD 和意外细胞死亡（ACD）。作为一种新型RCD，铁死亡以铁离子蓄积、活性氧积累、线粒体缩小及膜密度增加等形态学改变为特征，可通过多种通路介导细胞死亡。谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）4 通路被认为是铁死亡的主要信号通路，其中关键分子为GPX4 和长链脂酰辅酶A 合成酶（ACSL）4。ACSL4 可以促进脂质过氧化，从而诱发铁死亡，而GPX4 的作用则相反。总的来说，铁死亡是否发生是由细胞内ACSL4 介导的多不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化与GPX4 等介导的抗过氧化是否平衡决定的。

1.2 铁死亡发生机制

细胞外的3 价铁离子在与转铁蛋白（TF）结合后，可被细胞膜上的转铁蛋白受体（TFR）1 识别，然后通过内吞作用进入细胞内并储存在内体中。前列腺6 跨膜上皮抗原（STEAP）3 可以将3 价铁离子还原为2 价铁离子，并在2 价金属转运体的介导下将2 价铁离子转运到胞质中，最终由铁蛋白中的铜蓝蛋白将2 价铁离子氧化为3 价铁离子并储存在铁蛋白中。铁蛋白可在维持细胞铁含量方面发挥关键作用，当细胞内的铁稳态被破坏时，胞内蓄积的亚铁离子可以通过芬顿反应产生活性氧，从而促进脂质过氧化的发生。线粒体和NADPH 氧化酶（NOX）产生的超氧阴离子可将3 价铁离子还原为2 价铁离子，促进芬顿反应发生[12]。

富含花生四烯酸（AA）和肾上腺酸（AdA）等PUFA 的细胞膜容易发生脂质过氧化。AA 和AdA 可分别通过ACSL4 和磷脂酰胆碱酰基转移酶（LPCAT）3 转化为多不饱和脂肪酸磷脂（PUFAPE），即游离PUFA 如AA 和AdA 经过ACSL4 催化，可与CoA 结合生成PUFA-CoA（AA-CoA 和AdACoA），再经过LPCAT3 催化，可与脑磷脂（PE）反应生成PUFA-PE（AA-PE 和AdA-PE）[13-15]。15-脂氧合酶（15-LOX）可将AA-PE 氧化为单氧合PE（15-OH-AA-PE）、双氧合PE（15-OOH-AA-PE）和三氧合PE（15-OOH-8-OH-AA-PE、15-OOH-9-OHAA-PE、15-OOH-12-OH-AA-PE）。在铁死亡细胞模型中加入15-LOX 可以产生较多的三氧合PE 和较少的单氧合PE[13]，由此导致磷脂双分子层厚度、渗透性和结构的破坏[16-17]。脂质过氧化既是正常的生理过程，可以受细胞调控，也可以通过自由基链式反应进行，所以也会失控[18]。本质上，自由基反应是绕过限制三重态氧反应性的自旋屏障，从而驱动更符合热力学的脂质过氧化，并导致细胞膜完整性和功能破坏的过程[17]。此外，过氧化脂质的毒性作用也会造成细胞损伤。其中ACSL4的激活是一个正反馈过程[19-20]，铁死亡诱导物可引起脂质过氧化物的轻微积累，从而诱导β Ⅱ磷酸化蛋白激酶C（PKCβ Ⅱ）激活。活化的PKCβ Ⅱ直接结合并磷酸化ACSL4，从而激活ACSL4，最终促进脂质过氧化产物形成。最后，脂质过氧化物-PKCβ Ⅱ-ACSL4 正反馈闭环促进脂质过氧化物达到致死水平，从而引发细胞铁死亡。

1.3 铁死亡的调控

GSH/GPX4 是公认的主要铁死亡调节通路。细胞膜表面的胱氨酸/谷氨酸逆转运体[System XC（-）]可将胞外胱氨酸转运到胞内，同时将胞内等量的谷氨酸排出。胱氨酸进入细胞后被还原为半胱氨酸，并与甘氨酸、谷氨酸经过一系列反应生成GSH。GSH 作为还原剂，在 GPX4 的催化下，可以将有毒的过氧化脂质还原为无毒的脂醇。erastin 可通过抑制System XC（-）重链SLC7A11 的活性来降低GSH的含量，进而导致过氧化脂质蓄积，并诱导铁死亡发生。近年有学者发现，激活转录因子（ATF）3 可抑制SLC7A11 表达，从而发挥与erastin 相似的作用[21]。

除上述途径外，调节铁含量、脂质过氧化物生成的酶也可以调控铁死亡。Anandhan 等[22]发现，NFE2L2/NRF2敲除细胞可以改变能够控制铁蛋白合成和降解的蛋白如HERC2、F-box 富含亮氨酸重复蛋白（FBXL）5、铁调控蛋白（IRP）2 和核受体共激活因子（NCOA）4 等的表达，从而损害铁稳态，并影响脂质过氧化。生育酚和生育三烯酚可以抑制LOX[13]，提示维生素E 可能有抗铁死亡作用。ACSL4 也可受到调控，具体详见下页图1。

2 ACSL4

2.1 ACSL4 概述

ACSL4基因位于X 染色体中，其编码的蛋白ACSL 包含5 个异构体，分别为ACSL1、3、4、5、6。它们可以将游离的长链脂肪酸转化为脂肪酰辅酶a，用于合成细胞脂质和促进β 氧化降解。ACSL4在肾上腺、卵巢、睾丸和脑组织中含量丰富，主要分布在内质网、线粒体、过氧化物酶体中[23]。铁死亡发现者Dixon 等[14]发现，ACSL4可能在铁死亡中发挥重要作用。

2.2 ACSL4 是铁死亡的关键分子

Doll 等[15]研究发现，ACSL4缺陷同时敲除GPX4的小鼠胚胎成纤维细胞较单纯敲除GPX4的细胞存活时间更长，提示ACSL4缺失对细胞抗铁死亡有强大作用，且ACSL4与GPX4之间有着密不可分的关系。Kagan 等[13]发现，经铁死亡诱导剂处理后，ACSL4敲除细胞胞酯化氧合AA 含量较野生型细胞更低。而与ACSL4相比，其他ACSL家族成员表达的缺失对铁死亡敏感性没有任何影响，提示ACSL4缺失对铁死亡具有特别意义[15]。

2.3 ACSL4 受到的调控

罗格列酮、吡格列酮和特罗格列酮等噻唑烷二酮类抗糖尿病药物可以靶向调控ACSL4，从而可以抑制细胞铁死亡发生。动物实验证实，罗格列酮可以显著延长GPX4敲除小鼠的总体生存期[15]。但值得注意的是，动物和细胞实验均表明，噻唑烷二酮类药物在抗铁死亡方面仅有预防作用，并不能发挥治疗作用。目前已有实验证实，罗格列酮可以促进少突胶质细胞生成和小胶质细胞生成，通过阻断ACSL4 抑制铁死亡，从而改善小鼠大脑缺血再灌注损伤[24]。

转录因子缺氧诱导因子（HIF）1α 可以通过核转位和基因表达调控介导对氧化应激的适应性反应。线粒体的变化对氧化应激的适应性反应至关重要。有研究表明，与低氧低糖处理的HIF-1α沉默SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞系相比，非沉默组ACSL4表达水平明显更高，并通过chip 实验发现HIF-1α显著富集于ACSL4的两个保守启动子区域（CNS1 和CNS2），可破坏ACSL4表达，从而增强细胞对铁死亡的敏感性[25]。Wang 等[26]通过HK-2细胞chip 实验也可以得出同样结论。

抗真菌药舍他康唑是一种FDA 批准的强效ACSL4抑制剂，它对人类ACSL4有较好的选择性。此外，舍他康唑还能降低脂质过氧化作用，由此保护对铁死亡敏感的非致癌神经元细胞系的细胞免受rsl3 诱导的铁死亡[27]。这些都提示ACSL4抑制剂将来可能作为临床有效抑制细胞铁死亡的药物。

3 SCI 和铁死亡

近年有研究表明，锌可以增加SCI 小鼠NRF2/HO-1的表达，从而抑制铁死亡并降低炎症因子水平，NRF2 抑制剂布鲁萨托尔则可以逆转锌的作用[28]。动物实验发现，川芎嗪可以调控铁蛋白重链1 和铁蛋白轻链的表达，从而调节铁代谢紊乱，并促进SCI 大鼠肢体功能恢复[29]。向SCI 早期大鼠注射亚硒酸钠可显著降低铁离子浓度以及脂质过氧化产物丙二醛和4-羟基壬烯醛水平，提高GPX4蛋白及其mRNA 水平，并抑制神经元和少突胶质细胞损伤，从而促进大鼠运动功能恢复[30]。大量实验研究均表明，SCI 与铁死亡之间有着密切的联系。目前，仅少数文献报道药物干预SCI 模型可导致ACSL4 表达的变化。如用依达拉奉治疗SCI 大鼠可上调GPX4和System XC（-），并下调ACSL4和5-LOX。目前针对ACSL4 的药物尚未用于干预SCI模型的实验。

疾病模型中被用作铁死亡抑制剂的去铁胺（DFO）可降低SCI 后总铁离子、肿瘤坏死因子、白细胞介素-1、caspase-3 的表达水平，抑制凋亡和胶质瘢痕形成，促进功能恢复，这表明铁死亡在继发性SCI 中可能发挥了重要作用。一些噻唑烷二酮类药物在保护细胞免受铁死亡损伤方面仍有局限性，此类药物需提前用药才能发挥抗铁死亡作用。因此，在SCI 早期应用罗格列酮可以使细胞有足够的时间进行适当的磷脂重构，从而有望减少铁死亡导致的继发性胶质瘢痕的形成，促进神经元及胶质细胞恢复。已有实验证实，罗格列酮在SCI 中应用有效。Meng 等[31]通过KEGG 分析和实验验证发现,罗格列酮可以降低推定激酶1 的关键转录因子（FOX）O1 的表达，进而改善SCI 大鼠的运动功能，抑制炎症反应，并促进神经干细胞的体内增殖。罗格列酮+毛喉素[32]或罗格列酮+甲泼尼龙[33]联合应用较单一药物应用，大鼠的运动功能恢复均更好，提示罗格列酮通过激活脊髓中过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-γ 发挥抗炎和抗氧化作用。罗格列酮是否通过抑制ACSL4 引起的抗铁死亡作用对SCI 后神经起到保护作用尚不明确，而罗格列酮治疗SCI 仅停留在动物实验，尚未进行临床试验，其疗效有待考察。

目前，SCI 与铁死亡之间的研究主要聚焦于抗铁死亡药物与动物运动功能恢复的关联。其中，抗铁死亡药物的作用机制主要为影响GSH/GPX4 轴，影响脂质过氧化物形成和铁离子蓄积的药物较少。

4 结语

SCI 是一种严重的中枢神经系统疾病，因其损伤后治疗效果差、恢复慢、致残率高等问题，使得SCI 的治疗及预防成为焦点话题。自2012 年铁死亡被发现以来，已有足够的证据支持铁死亡与神经系统疾病有密切关系，铁死亡的发现打开了SCI研究的一扇大门，对SCI 治疗有着重要意义。

ACSL4 作为铁死亡的关键分子，其基因缺陷有逆转铁死亡的作用，近两年逐渐成为铁死亡的研究热点。它通过脂质过氧化物-PKCβ Ⅱ-ACSL4正反馈引起脂质过氧化物大量蓄积，由此造成细胞死亡，最终导致各系统疾病的发生发展。目前，ACSL4 主要集中在肿瘤研究领域，少见于SCI 研究，但ACSL4 可能是有潜力的SCI 治疗靶点，因此可能成为未来SCI 预防和治疗研究的方向。